Preparazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di mesh derivati da cellule iPS umane per la riparazione miocardia in Vivo
June 9th, 2020
L'attuale protocollo genera tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di maglia contenenti cellule cardiovascolari derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per consentire lo studio della terapia dell'impianto cellulare per le malattie cardiache.
Questo protocollo descrive un metodo nobile e facile per creare tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di rete derivati da parti del corpo indotte dall'uomo e cellule cardiache derivate da cellule STAMINALI. La flessibilità della geometria tissutale e la scalabilità della funzione tissutale preservata sono i principali vantaggi di questa tecnica. Gli ECT a forma di rete impiantata possono ripristinare una struttura cardiaca e funzionare in un modello di infarto miocardico del ratto.
Confermandone la fattibilità per l'uso in terapia rigenerativa cardiaca. Queste tecniche richiedono l'elaborazione riproducibile delle cellule STAMINALI umane e le capacità di coltura tissutale per risultati coerenti. Iniziare tagliando un foglio PDMS polimerizzato alle dimensioni appropriate per consentire di legare il foglio con adesivo in silicone per fabbricare un vassoio rettangolare di 21 per 20,5 millimetri con una larghezza di 0,5 millimetri lunga sette millimetri e pali rettangolari alti 2,5 millimetri in posizioni sfalsate.
La spaziatura orizzontale tra due linee di pali dovrebbe essere di 2,5 millimetri. Autoclavare il vassoio a 120 gradi Celsius per 20 minuti prima di rivestire lo stampo con 1%Poloxamer 407 in PBS per un'ora. Quindi sciacquare accuratamente lo stampo con PBS e posizionare lo stampo in un unico pozzo di una piastra a sei poi.
Per l'analisi del lignaggio, combina le cellule del cardiomiocita più protocolli cellulari murali endoteliali e vascolari. Quindi la concentrazione finale di cellule murali è dal 10 al 20% in un numero totale di cellule di sei per 10 fino alle sei celle per costrutto. Mescolare 133 microlitri di soluzione di collagene Acid Soluble Rat Tail di tipo uno e 17 microlitri di Alkali Buffer a 17 microlitri di 10X Minimum Essential Medium sul ghiaccio.
Quindi aggiungere 67 microlitri di Matrice di membrana basale alla soluzione di collagene. Successivamente, centrifugare le cellule e rimescolare il pellet in 167 microlitri del Medium essenziale minimo di Alto glucosio Dulbecco integrato con siero bovino fetale e antibiotici. Mescolare le cellule sulla soluzione matriciale sul ghiaccio.
Quindi versare con cura 400 microlitri della sospensione della matrice cellulare sullo stampo in tessuto PDMS rivestito poloxamer 407. Incubare la miscela di matrice cellulare in un incubatore di coltura cellulare standard a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 60 minuti. Quando il tessuto si è formato, immergere con cura lo stampo con quattro millilitri di mezzo di coltura ECT e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare per 14 giorni.
Prima dell'impianto ECT, è stato sterilizzato le forcep fini per rimuovere con cura l'ECT dai posti di carico. Gli stampi tissutali possono essere fabbricati con vari motivi, lunghezze di palo e spaziatura post per generare diverse geometrie ECT finali. Per questa analisi è stato utilizzato uno stampo con pali lunghi sette millimetri con intervalli di 2,5 millimetri di larghezza.
Poloxamer 407 previene l'adesione delle cellule allo stampo e consente la formazione di una caratteristica struttura a rete, dopo una rapida compattazione del gel in 14 giorni. La struttura viene mantenuta anche dopo che l'ECT è stato rilasciato dallo stampo. Il costrutto di tessuto fabbricato è largo circa 1,5 centimetri e spesso 0,5 millimetri.
E la larghezza di ogni fascio nella rete è di circa 0,5 millimetri in media. È possibile generare un ECT a rete finale di 3 centimetri contenente 24 milioni di celle da uno stampo quattro volte più grande con lo stesso design del palo sfalsato. Questo ECT a rete più grande può anche essere facilmente rimosso dallo stampo e genera un atto di forza locale equivalente alla rete più piccola ECT.
È importante versare uniformemente la miscela della matrice cellulare nello stampo tissutale senza generare bolle per evitare difetti di sensazione nel gel finale. Caratterizzazione funzionale del contraente. e le relazioni di quarta frequenza possono essere eseguite utilizzando sistemi integrati.
Il nostro obiettivo finale è la traduzione dei paradigmi ECT in terapie cliniche che utilizzano grandi studi preclinici sugli animali.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo nuovo e semplice per creare tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di rete derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane. La tecnica permette di studiare la terapia di impianto cellulare per le malattie cardiache, in particolare in un modello di infarto miocardico nei ratti.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Ingegneria dei tessuti cardiaci
- Terapia con cellule staminali
- Medicina rigenerativa
Contesto
- I tessuti cardiaci ingegnerizzati possono ripristinare la struttura e la funzione cardiaca.
- Le cellule staminali pluripotenti indotte umane sono una risorsa preziosa per la derivazione di cellule cardiache.
- La flessibilità della geometria del tessuto è cruciale per un efficace impianto.
- La riproducibilità nella lavorazione delle cellule staminali è essenziale per risultati coerenti.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo per creare tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di rete.
- Valutare la fattibilità di questi tessuti nella terapia rigenerativa cardiaca.
- Investigare il ripristino della funzione cardiaca dopo l'impianto.
Metodi utilizzati
- Fabbricazione di un vassoio rettangolare utilizzando PDMS e adesivo siliconico.
- Creazione di supporti per sostenere i tessuti ingegnerizzati.
- Implantazione dei tessuti cardiaci ingegnerizzati in un modello di ratto.
- Valutazione del ripristino della struttura e della funzione cardiaca.
Principali risultati
- I tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di rete hanno ripristinato con successo la funzione cardiaca.
- Il metodo ha dimostrato scalabilità e flessibilità nella geometria del tessuto.
- Risultati coerenti sono stati ottenuti attraverso una lavorazione riproducibile delle cellule staminali.
- La tecnica è praticabile per l'uso nella terapia rigenerativa cardiaca.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per creare tessuti cardiaci ingegnerizzati.
- I tessuti a forma di rete possono efficacemente ripristinare la funzione cardiaca in un modello di infarto miocardico.
- L'approccio promette bene per le future terapie rigenerative cardiache.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables scalable production of mesh-shaped engineered cardiac tissues from human iPSC-derived cardiovascular cells, offering a reproducible platform for myocardial repair strategies. The approach supports preclinical evaluation of tissue integration and functional restoration in ischemic injury models, addressing a critical gap in regenerative cardiology. By providing a geometrically tunable and scalable construct, it facilitates translational de-risking of stem cell-based therapies for heart failure.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by assessing structural and functional integration of hiPSC-derived cardiac cells in vivo.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible tissue format for consistent preclinical readouts across studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable structural metrics (e.g., myofiber bundle alignment, synchronous contraction) for functional assay development.
- Operational Value: Supports scalability to larger constructs (up to 3.0 cm) enabling dose-response and batch consistency testing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates feasibility of restoring cardiac structure and function in a rat myocardial infarction model, supporting mechanistic de-risking.
- Operational Value: Bridges discovery to preclinical validation through standardized implantation and functional assessment workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions mesh-shaped ECTs as a discovery-to-preclinical bridge, enabling hypothesis testing in early discovery and functional validation in preclinical stages through scalable, reproducible tissue production.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by enabling controlled assessment of hiPSC-derived cardiac cell integration and electromechanical function.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized tissues with quantifiable outputs (beat synchrony, alignment) for compound or condition comparison.
- Analytics: Provides structural and functional readouts (construct dimensions, myofiber diameter, contraction synchrony) to enable comparative analysis across experimental groups.
- Translational Research: Ensures continuity from in vitro maturation to in vivo functional restoration, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform technology adaptable to various geometries and scales, promoting cross-project reproducibility and resource efficiency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in stem cell engraftment and functional contribution to cardiac repair.
- Operational Value: Ensures standardization and scalability through defined cell ratios, matrix formulation, and mold geometry.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reproducible preclinical efficacy data, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cardiac regeneration candidates based on validated tissue performance and scalability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human iPSC differentiation, cardiovascular lineage specification, and 3D tissue culture techniques.
- Dependent on access to PDMS molding equipment, sterilization capabilities, and precision fluid handling for matrix-cell mixing.
- Necessitates cross-team standardization of cell sourcing, matrix preparation, and incubation protocols to ensure batch-to-batch consistency.
- Involves adaptation considerations when scaling to larger constructs or alternative geometries, particularly regarding nutrient diffusion and electrical coupling.
- Limited by the current reliance on rodent models for functional validation, necessitating larger preclinical systems for clinical translation.
