Preparazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di mesh derivati da cellule iPS umane per la riparazione miocardia in Vivo
9 giugno 2020
L'attuale protocollo genera tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di maglia contenenti cellule cardiovascolari derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per consentire lo studio della terapia dell'impianto cellulare per le malattie cardiache.
Questo protocollo descrive un metodo nobile e facile per creare tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di rete derivati da parti del corpo indotte dall'uomo e cellule cardiache derivate da cellule STAMINALI. La flessibilità della geometria tissutale e la scalabilità della funzione tissutale preservata sono i principali vantaggi di questa tecnica. Gli ECT a forma di rete impiantata possono ripristinare una struttura cardiaca e funzionare in un modello di infarto miocardico del ratto.
Confermandone la fattibilità per l'uso in terapia rigenerativa cardiaca. Queste tecniche richiedono l'elaborazione riproducibile delle cellule STAMINALI umane e le capacità di coltura tissutale per risultati coerenti. Iniziare tagliando un foglio PDMS polimerizzato alle dimensioni appropriate per consentire di legare il foglio con adesivo in silicone per fabbricare un vassoio rettangolare di 21 per 20,5 millimetri con una larghezza di 0,5 millimetri lunga sette millimetri e pali rettangolari alti 2,5 millimetri in posizioni sfalsate.
La spaziatura orizzontale tra due linee di pali dovrebbe essere di 2,5 millimetri. Autoclavare il vassoio a 120 gradi Celsius per 20 minuti prima di rivestire lo stampo con 1%Poloxamer 407 in PBS per un'ora. Quindi sciacquare accuratamente lo stampo con PBS e posizionare lo stampo in un unico pozzo di una piastra a sei poi.
Per l'analisi del lignaggio, combina le cellule del cardiomiocita più protocolli cellulari murali endoteliali e vascolari. Quindi la concentrazione finale di cellule murali è dal 10 al 20% in un numero totale di cellule di sei per 10 fino alle sei celle per costrutto. Mescolare 133 microlitri di soluzione di collagene Acid Soluble Rat Tail di tipo uno e 17 microlitri di Alkali Buffer a 17 microlitri di 10X Minimum Essential Medium sul ghiaccio.
Quindi aggiungere 67 microlitri di Matrice di membrana basale alla soluzione di collagene. Successivamente, centrifugare le cellule e rimescolare il pellet in 167 microlitri del Medium essenziale minimo di Alto glucosio Dulbecco integrato con siero bovino fetale e antibiotici. Mescolare le cellule sulla soluzione matriciale sul ghiaccio.
Quindi versare con cura 400 microlitri della sospensione della matrice cellulare sullo stampo in tessuto PDMS rivestito poloxamer 407. Incubare la miscela di matrice cellulare in un incubatore di coltura cellulare standard a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 60 minuti. Quando il tessuto si è formato, immergere con cura lo stampo con quattro millilitri di mezzo di coltura ECT e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare per 14 giorni.
Prima dell'impianto ECT, è stato sterilizzato le forcep fini per rimuovere con cura l'ECT dai posti di carico. Gli stampi tissutali possono essere fabbricati con vari motivi, lunghezze di palo e spaziatura post per generare diverse geometrie ECT finali. Per questa analisi è stato utilizzato uno stampo con pali lunghi sette millimetri con intervalli di 2,5 millimetri di larghezza.
Poloxamer 407 previene l'adesione delle cellule allo stampo e consente la formazione di una caratteristica struttura a rete, dopo una rapida compattazione del gel in 14 giorni. La struttura viene mantenuta anche dopo che l'ECT è stato rilasciato dallo stampo. Il costrutto di tessuto fabbricato è largo circa 1,5 centimetri e spesso 0,5 millimetri.
E la larghezza di ogni fascio nella rete è di circa 0,5 millimetri in media. È possibile generare un ECT a rete finale di 3 centimetri contenente 24 milioni di celle da uno stampo quattro volte più grande con lo stesso design del palo sfalsato. Questo ECT a rete più grande può anche essere facilmente rimosso dallo stampo e genera un atto di forza locale equivalente alla rete più piccola ECT.
È importante versare uniformemente la miscela della matrice cellulare nello stampo tissutale senza generare bolle per evitare difetti di sensazione nel gel finale. Caratterizzazione funzionale del contraente. e le relazioni di quarta frequenza possono essere eseguite utilizzando sistemi integrati.
Il nostro obiettivo finale è la traduzione dei paradigmi ECT in terapie cliniche che utilizzano grandi studi preclinici sugli animali.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo nuovo e semplice per creare tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di rete derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane. La tecnica consente lo studio della terapia con impianto cellulare per le malattie cardiache, in particolare in un modello di infarto miocardico nel ratto.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ingegneria dei tessuti cardiaci
- Terapia con cellule staminali
- Medicina rigenerativa
Sfondo
- I tessuti cardiaci ingegnerizzati possono ripristinare la struttura e la funzione cardiaca.
- Le cellule staminali pluripotenti indotte umane rappresentano una risorsa preziosa per l'ottenimento di cellule cardiache.
- La flessibilità della geometria del tessuto è fondamentale per un'impianto efficace.
- La riproducibilità nella lavorazione delle cellule staminali è essenziale per ottenere risultati costanti.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per la creazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati di forma reticolare.
- Valutare la fattibilità di questi tessuti nella terapia rigenerativa cardiaca.
- Studiare il ripristino della funzione cardiaca dopo l'innesto.
Metodi Utilizzati
- Realizzazione di un vassoio rettangolare utilizzando PDMS e adesivo siliconico.
- Creazione di supporti per tessuti ingegnerizzati.
- Impianto di tessuti cardiaci ingegnerizzati in un modello ratto.
- Valutazione del ripristino della struttura e della funzione cardiaca.
Risultati principali
- I tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di rete hanno ripristinato con successo la funzione cardiaca.
- Il metodo ha dimostrato scalabilità e flessibilità nella geometria del tessuto.
- Risultati costanti sono stati ottenuti mediante un processo riproducibile delle cellule staminali.
- La tecnica è realizzabile per l'uso nella terapia rigenerativa cardiaca.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per creare tessuti cardiaci ingegnerizzati.
- Tessuti a forma di rete possono ripristinare efficacemente la funzione cardiaca in un modello di infarto miocardico.
- L'approccio mostra potenzialità per future terapie rigenerative cardiache.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente la produzione scalabile di tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di rete a partire da cellule cardiovascolari derivate da iPSC umane, offrendo una piattaforma riproducibile per strategie di riparazione miocardica. L'approccio supporta la valutazione preclinica dell'integrazione del tessuto e del ripristino funzionale in modelli di lesione ischemica, affrontando una lacuna critica nella cardiologia rigenerativa. Fornendo un costrutto geometricamente modulabile e scalabile, facilita la riduzione del rischio traslazionale delle terapie basate su cellule staminali per l'insufficienza cardiaca.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la valutazione dell'integrazione strutturale e funzionale di cellule cardiache derivate da hiPSC in vivo.
- Valore operativo: Fornisce un formato tessutale standardizzato e riproducibile per ottenere letture precliniche costanti tra diversi studi.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera metriche strutturali quantificabili (ad esempio, allineamento dei fasci di miofibre, contrazione sincrona) per lo sviluppo di saggi funzionali.
- Valore operativo: Permette la scalabilità a costrutti più grandi (fino a 3,0 cm), consentendo test di risposta alla dose e di coerenza tra lotti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Dimostra la fattibilità del ripristino della struttura e della funzione cardiaca in un modello di infarto miocardico nel ratto, supportando la riduzione del rischio meccanicistico.
- Valore operativo: Collega la fase di scoperta alla validazione preclinica attraverso flussi di lavoro standardizzati di impianto e valutazione funzionale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo posiziona gli ECT a forma di rete come ponte tra la fase di scoperta e quella preclinica, consentendo la verifica delle ipotesi nella fase iniziale di scoperta e la validazione funzionale nelle fasi precliniche attraverso la produzione scalabile e riproducibile di tessuti.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi biologici e la riduzione del rischio biologico consentendo una valutazione controllata dell'integrazione e della funzione elettromeccanica di cellule cardiache derivate da hiPSC.
- Screening: Fornisce tessuti standardizzati pronti per il saggio con output quantificabili (sincronia del battito, allineamento) per il confronto tra composti o condizioni.
- Analisi: Offre parametri strutturali e funzionali (dimensioni del costrutto, diametro delle miofibrille, sincronia della contrazione) per consentire analisi comparative tra gruppi sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Garantisce continuità dalla maturazione in vitro al ripristino funzionale in vivo, supportando decisioni di avanzamento proporzionate al rischio.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una tecnologia di piattaforma adattabile a diverse geometrie e scale, promuovendo la riproducibilità tra progetti e l'efficienza delle risorse.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nell'attecchimento delle cellule staminali e nel loro contributo funzionale alla riparazione cardiaca.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e scalabilità attraverso rapporti cellulari definiti, formulazione della matrice e geometria dello stampo.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo fornendo dati preclinici di efficacia riproducibili, riducendo il rischio biologico nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei candidati per la rigenerazione cardiaca adeguata al rischio, basata su prestazioni del tessuto validate e sulla scalabilità.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella differenziazione di iPSC umane, nella specificazione della linea cellulare cardiovascolare e nelle tecniche di coltura tissutale 3D.
- È dipendente dall'accesso a attrezzature per la stampa in PDMS, capacità di sterilizzazione e manipolazione precisa di fluidi per la miscelazione matrice-cellule.
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi di lavoro per l'approvvigionamento cellulare, la preparazione della matrice e i protocolli di incubazione, al fine di garantire coerenza tra diversi lotti.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si passa a costrutti più grandi o a geometrie alternative, in particolare per quanto riguarda la diffusione dei nutrienti e l'accoppiamento elettrico.
- È limitato dall'attuale dipendenza da modelli rodentici per la validazione funzionale, richiedendo sistemi preclinici più ampi per la traduzione clinica.
