Name: Estrazione rapida ed economica dellRNA del tessuto pancreatico ratto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Scopri un metodo rapido ed economico per l'estrazione di RNA da tessuto pancreatico di ratto. Questa tecnica garantisce elevata purezza e integrità dell'RNA isolato, ottimizzando la ricerca in biologia molecolare.

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Il presente studio è stato sostenuto finanziariamente dalla Shiraz University of Medical Sciences (Grant No. Ringraziamo il Sig. Eomorodian e il Sig. Rostami presso il Dipartimento di e-Learning in Scienze Mediche, Scuola Virtuale e Centro di Eccellenza in e-Learning, Università di Scienze Mediche di Shiraz per la modifica del video.

L'approvazione etica per questo studio è stata ottenuta dalla Shiraz University of Medical Sciences (numero di approvazione: 93-01-01-7178-03-07-2014).
NOTA: Utilizzare ratti maschi Sprague-Dawley del peso di 250 g. Posizionare la fiala contenente una scheggia di tessuto pancreatico immerso nel reagente stabilizzante dell'RNA in un serbatoio di azoto liquido a -80 gradi centigradi e utilizzare la soluzione del reagente di estrazione dell'RNA per mantenere l'integrità dell'RNA.
1. Rimozione del tessuto pancreatico ratto
<ol><li>Preparare la sala operatoria e posizionare tutti i materiali necessari sotto il cofano.</li>
	<li>Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici (dressing forceps, forceps Brown-Adson, forbici Iris e forbici Littler) in forno per almeno 4 h a 240 gradi centigradi per inattivare RNases15. Sterilizzare la superficie del luogo di chirurgia con 70% di alcol sotto il cofano.</li>
	<li>Iniettare chetamina/xylazina intraperitonealmente utilizzando una siringa insulina [80/8 mg/kg]. Controllare la profondità dell'anestesia pizzicando le dita dei piedi del ratto per una mancanza di risposta.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di reagente di stabilizzazione dell'RNA nel microtubo corretto (2 mL) per inibire l'attivazione delle endonucleasi nei tessuti azizzati.</li>
	<li>Posizionare immediatamente il ratto sulla tavola chirurgica (allontanarsi dal chirurgo) per un'incisione a media linea.</li>
	<li>Sterilizzare l'intera superficie addominale con il 70% di alcol e rimuovere i capelli di ratto utilizzando un tagliacapello con #40 lame.</li>
	<li>Fai un'incisione a forma di V per aprire l'addome dall'area pubica alle zampe anteriori con le forbici Dressing, le forcepi Brown-Adson, le forbici Iris e le forbici Littler.</li>
	<li>Capovolgere gli organi addominali sul lato sinistro per esporre il pancreas. Trova con attenzione il tessuto pancreatico, che si diffonde nella cavità addominale. Individuare l'area sotto la milza per trovare il pancreas senza essere confuso con il tessuto adiposo.</li>
	<li>Rimuovere immediatamente 20-30 mg di pancreas dalla cavità addominale in meno di 2 min. Mettere rapidamente il tessuto rimosso nel microtubo da 2 mL e tagliarlo con una fresa sterile per penetrare i tessuti separati con il reagente di stabilizzazione dell'RNA.</li>
	<li>Posizionare il microtubo in un serbatoio di azoto per congelare immediatamente. Conservare il microtubo in un congelatore a -80 gradi centigradi per 24 h16.</li>
	<li>Dopo 24 h, trasferire i piccoli pezzi di tessuti pancreatici in un contenitore di ghiaccio.</li>
	<li>Iniettare cloruro di potassio (KCl) intracardially per l'eutanasia dei ratti dopo l'intervento chirurgico.</li>
</ol>2. Estrazione dell'RNA
<ol><li>Sterilizzare la superficie sotto il cofano con 70% di alcol.</li>
	<li>Mettere 1 mL del reagente di estrazione dell'RNA, che contiene il diocianio di guanidinio per inibire RNase, nel microtubo sterile.</li>
	<li>Trasferire il tessuto pancreatico separato nel microtubo. Trasferire il microtubo nell'azoto liquido per congelare immediatamente.</li>
	<li>Omogeneizzare il tessuto con il sonicatore della sonda a micro punta a 4 gradi centigradi impostato al livello 20 per 60 s on e 5 s off.</li>
	<li>Incubare ogni campione omogeneizzato per 5 minuti a 4 gradi centigradi utilizzando ghiaccio tritato per consentire ai complessi di nucleoproteina di essere completamente dissociati.</li>
	<li>Arricchire i campioni con 0,2 mL di cloroformio per ogni 1 mL di reagente di estrazione dell'RNA. Stringere saldamente il tubo e agitarlo con forza per 15 s.</li>
	<li>Incubare il tubo per 15 minuti sul ghiaccio tritato (4 gradi centigradi) per separare il reagente in tre fasi.</li>
	<li>Eseguire la centrifuga a 12.000 x g per 15 min a 2 -8 . Trasferire la fase aques incolore in un nuovo microtubo.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL del 100% isopropanolo alla fase aque. Chiudere il tubo e invertire almeno 3 volte per mescolare accuratamente l'RNA.</li>
	<li>Incubare il campione per 5-10 min su una scatola fredda (4 gradi centigradi) per consentire la precipitazione dell'RNA.</li>
	<li>Eseguire la centrifuga a 12.000 x g per 15 min a 2 -8 . Scarta il supernatant.</li>
	<li>Arricchire ciascuno dei tubi centrifuga con 1 mL del 75% di etanolo.</li>
	<li>Lavare il pellet dell'RNA invertendo il tubo almeno 3 volte.</li>
	<li>Eseguire la centrifuga a 7.500 x g a 2-8 dollari per 5 min. Scartare il supernatant per rimuovere l'etanolo in eccesso dal pellet dell'RNA mediante l'essiccazione dell'aria.</li>
	<li>Sospendere nuovamente il pellet di RNA in acqua libera da diethylpyrocarbonate (DEPC) trattata senza RNase.</li>
	<li>Passare la soluzione attraverso una punta di pipetta più volte per sciogliere il pellet di RNA. Quindi, incubare la soluzione per 10-15 min a 65 dollari.</li>
</ol>3. Valutazione dell'integrità dell'RNA con elettroforesi denaturazione
<ol><li>Preparare il buffer di esecuzione del gel: 50 mM NaAc (DEPC trattato) e 0,5 M EDTA (pH 8.0) in H2O trattato da DEPC.</li>
	<li>Preparare 5x formaldeide gel-running buffer (buffer di esecuzione MOPS): 0,1 M MOPS (pH 7.0), 40 mM NaAc, 5 mM EDTA (pH 8.0).<ol>
<li>Sciogliere 20,6 g di MOPS in 800 mL di DEPC trattati con acetato di sodio da 50 mM. Regolare il pH a 7,0 con 2 N NaOH. Aggiungere 10 mL di DEPC-trattato 0.5 M EDTA (pH 8.0). Regolare il volume della soluzione a 1 L con acqua trattata DEPC.</li>
		<li>Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 m e tenerla a temperatura ambiente lontano dalla luce per motivi di sterilizzazione. Il buffer diventa giallo con il tempo se è esposto alla luce o è autoclaved. Un buffer color paglia funziona bene, ma quelli più scuri non17.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare un gel di agarose18. Per 50 mL, aggiungere 0,75 g di agarose e 31 mL di H2O. Microonde la soluzione nel microonde per 1 min. Aggiungere 9 mL di formaldeide e 10 mL di buffer in esecuzione MOPS 5x.</li>
	<li>Preparare i campioni per il gel. Mescolare quanto segue in un tubo di microfugio sterile: RNA X L (fino a 30 g) 2 L di buffer di caricamento gel 5x 10 L di formamide 4 L di buffer di esecuzione MOPS 1 L di 0,1 mg/mL EtBr 3 L di formaldeide 5-x L di DEPC-H2O</li>
	<li>Incubare i campioni a 65 gradi centigradi per 15 minuti e raffreddarli sul ghiaccio. Centrifuga per 5 s fino a quando tutto il fluido viene depositato.</li>
	<li>Pre-eseguire il gel a 5 V/cm per 5 minuti.</li>
	<li>Caricare immediatamente i campioni nelle corsie del gel e poi immergere il gel in un tampone di gel di formaldeide 1x. Eseguire a 3-4 V/cm19.</li>
</ol>

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</ol>

Nessuno dichiarato.

Nella biologia molecolare è fondamentale ottenere RNA di alta qualità. La presenza degli enzimi ribonucleasi nelle cellule e nei tessuti degrada rapidamente l'RNA e rende l'estrazione complessa. Le rule sono enzimi stabili che funzionano senza co-fattori. Piccole quantità di RNase sono adeguate per distruggere l'RNA. Quando il tessuto pancreatico del ratto viene rimosso dalla cavità addominale, è necessario disinfettare gli strumenti chirurgici con detergenti forti, sciacquarli accuratamente e metterli in forno per almen...

I dati genetici strutturali possono essere trascritti in un prodotto funzionale attraverso l'espressione genica. L'analisi dell'RNA viene utilizzata per scoprire le differenze nell'espressione genica in diverse condizioni. Ci sono una serie di metodi per estrarre gli acidi nucleici come segue: guanidinium thiocyanate, estrazione tramite fenolo-cloroformio, cromatografia a base di cellulosa, estrazione da matrici di silice e scambio dianioni 1,2.
La corretta rilevazione dell'espressione genica è influenzata dall'integrità dell'RNA isolato dai tessuti; pertanto, è fondamentale valutare l'integrità dell'RNA isolato dai tessuti prima che vengono effettuati ulteriori test perché test molecolari complementari su RNA di bassa qualità possono compromettere i risultati dell'applicazione diagnostica. Pertanto, l'RNA ad alta integrità è necessario per i test biologici molecolari con diverse applicazioni diagnostiche: RT-PCR quantitativo, micro-array, analisi della protezione della ribonucleasi, analisi delle macchie settentrionali, mappatura dell'RNA e costruzione della libreria cDNA3,4.
L'RNA diventa piuttosto instabile dopo essere stato tenuto a lungo. Frammenti di mRNA lunghi oltre 10 kb sono particolarmente suscettibili alla degradazione5,6. Pertanto, i ricercatori devono considerare vari fattori che influenzano l'integrità dell'RNA purificato. La purezza dell'RNA deve essere protetta da RNases, proteine, DNA genomico e contaminazione da inibitori enzimatici. Inoltre, il miglior e accettabile rapporto di assorbimento tra RNA e UV (260/280) deve essere compreso nell'intervallo di 1,8-2,0 con frammentazione minima sull'elettroforesi. Tecniche di laboratorio sviluppate di recente hanno permesso agli scienziati di valutare l'integrità del campione di analisi molecolarepiù praticamente 7,8.
È molto più difficile estrarre l'RNA non danneggiato dal tessuto pancreatico rispetto ad altri tipi di tessuti a causa dell'elevata quantità di ribonucleasi (RNases). Tuttavia, i metodi di estrazione esistenti, vale a dire la rapida espulsione del tessuto pancreatico dalla cavità addominale e l'omogeneizzazione a basse temperature per ostacolare le RNases, si sono dimostrati inefficaci7,8,9,10,11,12,13,14.
Lo scopo dell'attuale studio sperimentale comparativo è quello di modificare e confrontare i metodi esistenti per determinare i metodi più efficienti. A tal fine, vari protocolli di estrazione dell'RNA sono stati modificati e confrontati. Era specificamente finalizzato a determinare il metodo meno costoso che richiede una quantità minima di tessuto pancreatico.

<table><tbody><tr><td>Agarosio</td><td>Merck</td><td>116801</td><td>Germania</td></tr><tr><td>Atoclave</td><td>Teb Zaim</td><td></td><td>Iran</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Sigma</td><td></td><td>Germania</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Merck 107024</td><td></td><td>Germania</td></tr><tr><td>Acqua trattata con dietilpirocarbonato (DEPC)</td><td>Sigma</td><td></td><td>Germania</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>sigma</td><td>60-00-4</td><td>Germania</td></tr><tr><td>Serbatoio per elettroforesi</td><td>Payapajoohesh</td><td></td><td>Iran</td></tr><tr><td>Eppendorf microTube</td><td>Extragene</td><td></td><td>Taiwan</td></tr><tr><td>EtBr</td><td>sigma</td><td>E 8751</td><td>Germania</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Merck</td><td>81870</td><td>Germania</td></tr><tr><td>Falcon Tube</td><td>Extragene</td><td></td><td>Taiwan</td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td></td><td>Merck 344198</td><td>Germania</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Merck</td><td>344206</td><td>Germania</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore-sunicatore</td><td>Microson XL 2000</td><td></td><td>USA</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>sigma</td><td>19516</td><td>Germania</td></tr><tr><td>Ketamina cloridrato</td><td>sigma</td><td>1867-66-9</td><td>Germania</td></tr><tr><td>Cappa a flusso laminare</td><td>Jal Tajhiz</td><td></td><td>Iran</td></tr><tr><td>Mgnetic stirrer</td><td>Labrotechnik</td><td></td><td>USA</td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Germania</td></tr><tr><td>Punte per micropipette</td><td>Extragene</td><td></td><td>Taiwan</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>sigma</td><td>85022106</td><td>Germania</td></tr><tr><td>Na AC</td><td>Merck</td><td>567422</td><td>Germania</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>109137</td><td>Germania</td></tr><tr><td>Forno</td><td>Teb Zaim</td><td></td><td>Iran</td></tr><tr><td>PH meter</td><td>Knick</td><td></td><td>Germany</td></tr><tr><td>Reagente per la stabilizzazione dell'RNA</td><td>Qiagen</td><td>76104</td><td>USA</td></tr><tr><td>Strumento chirurgico</td><td>Agn Thos</td><td></td><td>Siringhe di fabbricazione tedesca</td></tr><tr><td></td><td>AvaPezeshk</td><td></td><td>Iran</td></tr><tr><td>Reagente/Reagente per l'estrazione dell'RNA</td><td>Roche</td><td>11667157001</td><td>USA</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Labinco</td><td></td><td>Paesi Bassi</td></tr><tr><td>Bagnomaria</td><td>Memmert</td><td></td><td>Germania</td></tr><tr><td>zylazine</td><td>sigma</td><td>7361-61-7</td><td>Germania</td></tr></tbody></table>

estrazione rapida ed economica dell'rna del tessuto pancreatico ratto

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Indipendentemente dal metodo di estrazione, l'estrazione ottimizzata dell'RNA dei tessuti e delle linee cellulari viene effettuata in quattro fasi: 1) omogeneizzazione, 2) denaturazione efficace delle proteine da RNA, 3) inattivazione della ribonuclea e 4) rimozione della contaminazione da DNA, proteine e carboidrati. Tuttavia, è molto laborioso mantenere l'integrità dell'RNA quando ci sono alti livelli di RNase nel tessuto. L'autolisi spontanea rende molto difficile estrarre l'RNA dal tessuto pancreatico senza danneggiarlo. Pertanto, è necessario un metodo pratico di estrazione dell'RNA per mantenere l'integrità dei tessuti pancreatici durante il processo di estrazione. Uno studio sperimentale e comparativo dei protocolli esistenti è stato effettuato ottenendo 20-30 mg di tessuti pancreatici di ratto in meno di 2 minuti ed estraendo l'RNA. I risultati sono stati valutati per elettroforesi. Gli esperimenti sono stati effettuati tre volte per la generalizzazione dei risultati. Immergere il tessuto pancreatico nel reagente di stabilizzazione dell'RNA a -80 gradi centigradi per 24 h ha prodotto RNA ad alta integrità, quando il reagente di estrazione dell'RNA è stato utilizzato come reagente. I risultati ottenuti sono stati paragonabili ai risultati ottenuti da kit commerciali con attacchi di colonna di spin.

Valutazione dell'integrità dell'RNA nel reagente di estrazione dell'RNA secondo un protocollo chirurgico di routine e modificato senza reagente di stabilizzazione dell'RNA Dopo l'estrazione dell'RNA sono state osservate bande inaccettabili con il reagente di estrazione dell'RNA da un protocollo chirurgico di routine. La corsia 1 mostra l'RNA dal fegato come controllo. La corsia 2 mostra lo stato degradato delle bande di rRNA 28S/18S nell'RNA totale ottenuto da un protocollo chirurgico di routine. Quan...

La purezza e l'integrità dell'RNA isolato è un passo vitale nei saggi dipendenti dall'RNA. Qui, presentiamo un metodo pratico, rapido ed economico per estrarre l'RNA da una piccola quantità di tessuto pancreatico non danneggiato.

Estrazione rapida ed economica dell'RNA del tessuto pancreatico ratto

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Ciao a tutti. Abbiamo progettato, un metodo descrittivo semplice e rapido in classe per un'efficiente estrazione dell'RNA dal tessuto pancreatico. Il principale vantaggio di questo metodo è una procedura ottimizzata per estrarre l'RNA dalla quantità minima di tessuto a causa dell'autolisi. Ciao di nuovo. La dimostrazione della procedura sarà fatta da Sanaz Dastghaib, che è il mio dottorando nel nostro laboratorio presso il Dipartimento di Biochimica dell'Università di Scienze Mediche di Shiraz.Prima prepara il luogo dell'intervento chirurgico, metti tutti i requisiti sotto il cofano. Per inattivare la RNasi sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in forno. Iniettare chetamina-xiloazina intraperitoneale 80/8 milligrammo per chilogrammo. Aggiungere 1 reagente di stabilizzazione cc.RNA in un microtubo adeguato per abitare l'attivazione dell'endonucleasi nei tessuti esistenti. Posizionare immediatamente il topo sulla tavola chirurgica. Allontanati dal chirurgo per un'incisione della linea mediana. Quindi, sterilizzare tutta la superficie addominale con il 70% di alcol per rimuovere i peli del topo. Tagliare la pelle per l'intervento. L'incisione rimodella è stata fatta per aprire l

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Microdissezione laser è una tecnica che consente il recupero di cellule scelte da piccole quantità di parenchima. Qui si descrive un protocollo per l'acquisizione di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici da utilizzare per gli studi di trascrittomica. Il nostro protocollo migliora l'autofluorescenza intrinseca delle cellule beta umane, facilitando così la loro collezione.

Protocollo migliorato per microdissezione laser di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici

Riportiamo una procedura per isolare l'RNA con elevata integrità dal pancreas di topo ricco di ribonucleasi.

Isolamento dell&#39;RNA da mouse Pancreas: Un Tessuto ricco Ribonucleasi

sfide critiche per il campo di ricerca sul diabete sono di comprendere i meccanismi molecolari che regolano la replicazione isolotto β-cellule e di sviluppare metodi per stimolando la rigenerazione delle cellule β-. Qui un metodo ad alto contenuto di screening per identificare e valutare l'attività di replica di promozione β-cellule di piccole molecole è presentato.

A High-contenuti<em&gt; In Vitro</em&gt; La replica della piattaforma Discovery isole pancreatiche β-cellule

Qui presentiamo un protocollo per la rilevazione dell'espressione di microRNA nella membrana peritoneale del ratto utilizzando la reazione a catena di polimerasi reattiva-trasversale in tempo reale. Questo metodo è adatto allo studio del profilo di espressione di microRNA nella membrana peritoneale del ratto in diverse condizioni patologiche.

Rilevamento dell&#39;espressione di microRNA nella membrana peritoneale dei ratti usando il quantitativo PCR in tempo reale

Questo protocollo di isolamento dell'isolotto ha descritto una nuova via di iniezione di collagenasi per digerire il tessuto esocrino e una procedura di gradiente semplificata per purificare le isole dai topi. Si tratta di digestione ezimatica, separazione/purificazione del gradiente e raccolta a mano dell'isolotto. Il successo dell'isolamento può produrre 250-350 isolotti di alta qualità e completamente funzionali per mouse.

Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi

Qui, presentiamo un protocollo per generare insulina esprimendo 3D pancreatoids murino da progenitori pancreatici e 10.5 digalleggiante dissociato e mesenchima associato.

Generazione di insulina senza impalcatura, tridimensionale esprimendo Pancreatoids dal Mouse progenitori pancreatico In Vitro

Descriviamo un metodo per l'isolamento di cellule endocrine da pancreas embrionale, neonatale e postnatale, seguite dal sequenziamento di RNA di cella singola. Questo metodo consente analisi dello sviluppo del pancreas endocrino lignaggio, eterogeneità e trascrittomica dinamiche di cella.

Analisi trascrittomica unicellulare delle cellule Endocrine del pancreas del Mouse

Le cellule metaplastiche pancreatiche sono precursori di cellule maligne che danno origine ai tumori pancreatici. Tuttavia, isolare le cellule pancreatiche vitali intatte è difficile. Qui presentiamo un metodo efficiente per la dissociazione del tessuto pancreatico. Le cellule possono quindi essere utilizzate per il sequenziamento di RNA a singola cellula (scRNA-seq) o per la co-coltura bi- o tridimensionale.

Dissezione del tessuto pancreatico per isolare singole cellule vitali

Questo studio ha sviluppato un metodo semplificato per estrarre in modo efficiente isolotti primari funzionali e cellule acinar dal pancreas del topo, offrendo uno strumento prezioso per studiare la comunicazione intercellulare nella patogenesi del diabete indotto da pancreatite acuta.

Un metodo semplice e rapido per l'isolamento simultaneo degli isolotti primari e delle cellule acinari pancreatiche primarie da topi

Questo protocollo descrive un metodo standardizzato per il prelievo chirurgico, la digestione enzimatica e la purificazione con gradiente di densità degli isolotti pancreatici del ratto Lewis, consentendo preparazioni ad alta resa e alta purezza per l'uso diretto in studi di trapianto o in vitro .

Isolamento e purificazione degli isoli pancreatici da ratti Lewis tramite digestione enzimatica e separazione tra densità e gradiente

Scopri un metodo rapido ed economico per l'estrazione di RNA da tessuto pancreatico di ratto. Questa tecnica garantisce elevata purezza e integrità dell'RNA isolato, ottimizzando la ricerca in biologia molecolare.

Estrazione rapida ed economica dell'RNA del tessuto pancreatico ratto

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