Specifica del progenitore epatico da cellule staminali pluripotenti utilizzando un sistema di differenziazione definito

Questo protocollo fornisce un sistema di differenziazione epatica derivato da cellule staminali che offre uno strumento riproducibile per lo studio della biologia epatica sia per la ricerca di base che per quella clinica. Combinando un protocollo standardizzato e facile da seguire con reagenti di coltura standard, questo sistema consente la produzione di progenitori epatici e cellule simili agli epatociti su larga scala. Mantenere le cellule pluripotenti umane a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in un piatto di 10 centimetri con laminina-531, nutrendole quotidianamente con 10 millilitri di terreno di mantenimento delle cellule staminali per piatto.

Per preparare le piastre di laminina 521, diluire la laminina 521 scongelata in DPBS ghiacciato con calcio e magnesio fino a una concentrazione finale di otto microgrammi per millilitro. Aggiungere 250 microlitri della soluzione di laminina a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti o 50 microlitri a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Scuotere delicatamente la piastra da un lato all'altro per ricoprire uniformemente i pozzetti, quindi sigillare le piastre con una pellicola flessibile semitrasparente e conservarle a quattro gradi Celsius per una notte.

Il giorno della semina cellulare, riscaldare le piastre pre-rivestite in un incubatore per colture cellulari per 30-60 minuti. Aspirare la soluzione di laminina 521 e aggiungere a ciascun pozzetto il terreno di mantenimento delle cellule staminali integrato con 10 inibitori micromolari ROCK, quindi rimettere la piastra nell'incubatore. Quando la fluidità della conta cellulare raggiunge il 70-80%, aspirare il terreno esaurito dalla piastra di coltura e lavare ogni piastra di coltura con cinque millilitri di DPBS senza calcio o magnesio a temperatura ambiente.

Aspirare il lavaggio DPBS dalla piastra di coltura, quindi aggiungere cinque millilitri di reagente di dissociazione privo di enzimi alla piastra e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per otto-10 minuti fino a quando le cellule non si staccano visibilmente dalla piastra. Staccare delicatamente le cellule dal piatto di coltura con un raschietto cellulare, quindi pipettare il contenuto di ciascun pozzetto su e giù con una pipetta sierologica da cinque millilitri per ottenere una sospensione di singole cellule. Per ogni linea cellulare, raggruppare le cellule di tutti i pozzetti di mantenimento in una provetta sterile da 50 millilitri.

Lavare ogni piatto di coltura svuotato con cinque millilitri di questo terreno di mantenimento delle cellule staminali e aggiungere i lavaggi alla provetta corrispondente con le cellule raggruppate. Eseguire tre conteggi cellulari vitali su ciascun campione aggregato. Centrifugare i campioni raggruppati a 250 x g per cinque minuti.

Quindi aspirare il surnatante e risospendere le cellule a una temperatura ambiente compresa tra uno e tre millilitri come terreno di mantenimento delle cellule staminali integrato con 10 inibitori micromolari ROCK Y27632. Dopo aver calcolato il numero richiesto di cellule necessarie per raggiungere la densità di semina desiderata, risospendere le cellule alla concentrazione appropriata e distribuirle nelle piastre pre-rivestite. Il volume totale per pozzetto deve essere di un millilitro per una piastra a 24 pozzetti e di 0,1 millilitri per una piastra a 96 pozzetti.

Scuotere delicatamente le piastre da un lato all'altro e avanti e indietro per garantire una dispersione uniforme delle cellule e posizionare le piastre seminate nell'incubatrice, facendole oscillare avanti e indietro e da un lato all'altro. Preparare i terreni per l'induzione definitiva dell'endoderma e per il successivo differenziamento della specifica cellulare progenitrice epatica come descritto nel manoscritto del testo. Il primo giorno di differenziazione, rimuovere il terreno esaurito dai pozzi e sostituirlo con uno medio di fase uno.

Nei giorni due, tre e quattro, rimuovere il terreno esaurito e nutrire ogni pozzetto con il terreno di fase uno due. Il quinto giorno, fissare i pozzetti destinati all'analisi definitiva della differenziazione dell'endoderma. Per i pozzetti rimanenti, rimuovere il terreno esaurito e alimentare ciascun pozzetto con il terreno progenitore epatico diff dello stelo.

Il giorno 10, prelevare le cellule per l'analisi della differenziazione dei progenitori epatici o procedere con un'ulteriore differenziazione cellulare simile a quella degli epatociti. Per caratterizzare le colture di differenziazione dei progenitori epatici, utilizzare l'immunocolorazione per rilevare l'espressione dei marcatori specifici dell'endoderma definitivi il quinto giorno e dei marcatori specifici del progenitore epatico il giorno 10 e quantificare la percentuale di cellule alfa positive per HNF4. Il giorno 10, misurare anche l'alfa fetoproteina e la secrezione di albumina tramite ELISA.

Questo protocollo è stato utilizzato per differenziare le cellule progenitrici epatiche sia dalle cellule staminali embrionali umane che dalle cellule staminali pluripotenti indotte umane. Al quinto giorno del protocollo di differenziazione, la specificazione definitiva dell'endoderma è stata valutata tramite l'espressione di Sox 17. In entrambe le linee cellulari, Sox 17 era altamente espresso con l'80 e l'87,8% delle cellule Sox 17 positive per H9 e P106, rispettivamente.

Al decimo giorno, i progenitori epatici mostravano una morfologia simile a quella di un ciottolo. Inoltre, è stata valutata la specificazione del progenitore epatico per l'espressione di HNF4 alfa, AFP, albumina e citocheratina 19. Entrambe le colture progenitrici epatiche esprimevano marcatori epatici fetali, come HNF4 alfa, AFP e CK 19.

secrezione di alfa fetoproteina è stata rilevata al giorno 10 in entrambe le linee cellulari, mentre la secrezione di albumina non è stata rilevata con ELISA. La variabilità del numero di cellule e l'efficienza del differenziamento dei progenitori epatici sono state valutate quantificando l'espressione di HNF4 alfa. Al giorno 10, i progenitori epatici non hanno mostrato una variabilità significativa tra le file con oltre il 95% e il 97% di cellule alfa positive per pozzetto HNF4 rispettivamente per H9 e P106.

Una distribuzione uniforme delle cellule prima dell'inizio della differenziazione è fondamentale per garantire una popolazione omogenea di cellule progenitrici epatiche. Per ottenere ciò, far oscillare delicatamente le piastre da un lato all'altro e avanti e indietro per garantire una dispersione uniforme delle cellule. Le cellule progenitrici epatiche prodotte da questo protocollo possono essere ulteriormente differenziate da cellule simili agli epatociti per altri saggi, offrendo uno strumento riproducibile e standardizzato per la modellazione della malattia o lo screening dei farmaci.