Name: Schermo genetico in avanti utilizzando Transgenic Calcium Reporter Aequorin per identificare nuovi obiettivi nella segnalazione di calcio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Scopri lo screening genetico in avanti per identificare nuovi geni coinvolti nella segnalazione del calcio in Arabidopsis utilizzando il reporter di calcio aequorina. Questo metodo consente di mappare i geni causali associati ai fenotipi.

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Ringraziamo l'Istituto Nazionale di Ricerca sul Genoma Vegetale - Phytotron Facility per la crescita delle piante, Bombay Locale per le riprese video e il Consorzio Department of Biotechnology- eLibrary per aver fornito l'accesso alle risorse e-resources. Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento di Biotecnologia, India attraverso il National Institute of Plant Genome Research Core Grant, Max Planck Gesellschaft-India Partner Group programma; e CSIR-Junior Research Fellowship (a D.M e S.M) e Department of Biotechnology-Junior Research Fellowship (a R.P).

1. Mutagenesi ems e raccolta di semi a base di un singolo albero genealogico (1-3 mesi)
<ol><li>Pesare 150 mg di semi (7500 dollari) di aequorina per la mutagenesi EMS (M0 semi). Pesare altri 150 mg di semi da utilizzare come controllo.</li>
	<li>Trasferire i semi in un tubo da 50 mL e aggiungere 25 mL di 0,2% EMS (v/v) (CAUTION) (per il trattamento) o 25 mL di acqua autoclaved (per il controllo). NOTA: il solfonato di metano etilico è un agente chimico per la mutagenizzazione del materiale vegetale.</li>
	<li>Sigillare il tubo con parafilm e avvolgerlo in un foglio di alluminio. Ruotare l'estremità finale del tubo per 18 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lasciare che i semi si depositino. Rimuovere con attenzione la soluzione EMS e scartare in un contenitore di rifiuti contenente 1 M NaOH in eguali (NaOH aiuta a neutralizzare/inattivare EMS rendendolo sicuro da scartare). Eliminare il materiale plastico usato in una soluzione NaOH da 1 M. NOTA: Dopo 24 ore, smaltire gli scarti secondo le pratiche di laboratorio di materiali pericolosi.</li>
	<li>Lavare accuratamente i semi mutageni con 40 mL di acqua autoclave almeno 8 volte. Eliminare eMS contenente acqua in un contenitore di rifiuti NaOH come accennato in precedenza.</li>
	<li>Per il lavaggio finale, aggiungere 40 mL di 100 mM di sodio tiosulfato e risciacquare 3 volte per rimuovere le tracce di EMS.</li>
	<li>Immergere i semi in 40 mL di acqua autoclave per 1 h per diffondere EMS dai semi e poi metterli su carta da filtro fino a completa asciugatura.</li>
	<li>Trasferire i semi in un tubo di microcentrifuga e stratificare i semi a 4 gradi centigradi in 40 mL di acqua autoclata per 2-4 giorni. Questo aiuta a rompere la doglienza dei semi e assicura una crescita omogenea.</li>
	<li>Trasferire i semi mutageniti (M0) e i semi di controllo sul suolo (composizione del suolo: agropet: soilrite, 1:1) e trasferirli in ambienti di crescita con un fotoperiodo scuro di 16 h/8 h, un'intensità di luce di 150 mol∙m−22 ∙ss. 1 e 70% di umidità relativa.</li>
	<li>Per determinare se la mutagenesi abbia avuto successo, cercare una riduzione della velocità di germinazione e della crescita delle piantine e della clorofilla18 (Figura 1A). Confrontare le piante mutagenizzate con gli impianti di controllo per identificare queste differenze fisiologiche e di sviluppo. NOTA: Metodi diversi possono essere utilizzati per la raccolta di semi da piante M1. In questo protocollo, abbiamo usato il metodo di raccolta dei semi basato su un singolo pedigree. A ogni impianto M1 viene assegnato un numero univoco, a partire da A1 a A3500.</li>
	<li>Mantenere gli impianti numerati singolarmente come linee di impianti discreti (Figura 1B).</li>
	<li>Alla maturazione, raccogliere semi da queste singole piante mutanti e conservare come singole linee M1 (Figura 2). Dalla collezione di semi a base di pedigree singolo, abbiamo ottenuto circa 5000 M1 linee di cui 3500 M1 linee sono state sottoposte a screening.</li>
</ol>2. Screening ad alto contenuto di velocità effettiva per selezionare i mutanti (8 mesi)
<ol><li>Identifica nuovi mutanti in base alla risposta di Ca2 a uno stimolo selezionato. Qui, abbiamo usato H2O2 come esempio.</li>
	<li>Per identificare i mutanti, vagliare la generazione M2. Dal momento che i mutanti recessivi si segregano a 1/8 frequenza nella generazione di M2 sulla mutagenesi EMS14, lo screening di piante a 8-12 M2-segregazione copre una linea M1 e identifica un mutante omozio recessivo (l'uso di 12 piantine aumenta la probabilità di trovare un mutante). Da ogni linea M1 indipendente, prova 12 M2 piantine per la risposta Ca2 a H2O2 (12 M2 piantine per linea M1).</li>
	<li>Utilizzare una sterilizzazione dei semi ad alta produttività e un protocollo di crescita delle piante idroponica19. Mettere quasi 12-15 M2 semi per M1 linea in singoli pozzi di una piastra di coltura dei tessuti 24-pozzi e sterilizzare utilizzando gas cloro (40 mL di 12% di ipoclorito di sodio e acido cloridrico, 3:1, v / v) in un desiccatore per 4 h in un cofano di fumi. Dopo la procedura, aprire il desiccatore e lasciare evaporare per una notte il gas cloro.</li>
	<li>Dopo la sterilizzazione, portare le piastre all'esterno e aggiungere i supporti liquidi 1/2 MS (mezza resistenza MS senza agar) ai singoli pozzi. Sigillare le piastre con il parafilm e stratificare i semi per 2-4 giorni a 4 gradi centigradi, quindi spostare i semi in una camera di crescita con 10 h luce / 14 h fotoperiodo scuro a 20-22 gradi centigradi con 70% di umidità relativa.</li>
	<li>Una volta che le piantine sono 8-12 giorni, mettere 12 M2 piantina da ogni linea singolarmente in una piastra di luminometro 96-well. Per misurare la risposta ca2 a H2O2, utilizzare un lettore di piastra per luminometro.</li>
	<li>Dopo il trasferimento delle piantine, aggiungere 150 gradi l di 5-10 M soluzione di coelentrazina (diluito in acqua autoclaved da uno stock di 5 mM in metanolo) (CAUTION) in singoli pozzi in una zona scura / bassa luce e conservare in scuro a 21 gradi C per 8 h. NOTA: Coelentrazine è un gruppo protesico che si lega all'apo-aequorin e lo ricostituisce all'aequorin funzionale. La Coelentrazine è sensibile alla luce e viene quindi conservata in bottiglie di colore scuro, protette dalla luce.</li>
	<li>Il giorno successivo, eseguire schermo mutante utilizzando 10 mM H2O2 come stimolo e misurare la successiva risposta Ca2. </li>
	<li>Per la misurazione simultanea di 24 pozzi, creare un programma cinetico automatizzato che misura lo sfondo per 1 min, seguito da aggiunta di stimoli (40 gradi) e misura per 10 min, seguita da una scarica totale di arin (2 M di scarico di rina (2 M Dirin2 in 150 - L 20% etanolo) per 1-2 min. NOTA: È necessario uno scarico finale per l'aequorin totale per quantificare la Misurata Ca2 e come controllo aggiuntivo per l'equore funzionale. Lo scarico finale è un breve periodo di 1-2 min e non causa la morte significativa delle piante. In alternativa, se le piante muoiono dopo la fase di scarico, ri-schermare la linea M1 specifica e salvare senza scarico. Tali mutanti possono essere confermati in M3 e M4 generazioni utilizzando la fase di scarico.</li>
	<li>Utilizzare un metodo di scansione formato a 24 pozzetti che misura ogni riga in intervallo di 7 s con 300 ms tempo di integrazione per pozzo per punto di misurazione. Utilizzare una piantina di tipo selvaggio come controllo in ogni riga per il confronto e la valutazione del mutante. NOTA: Una singola piastra 96 contiene le piantine M2 coprirà 8 singole linee M1 (8 M1, 12 , 96 M2) e può essere esaminata in 2,5 h e ogni giorno verrebbero sottoposte a screening 32 M1 linee, 640 M1 piante al mese. L'intera procedura di screening dopo la preparazione degli impianti richiederebbe circa 8 mesi.</li>
	<li>Identificare i mutanti in base alla perdita o alla ridotta risposta di Ca2 o con H2O2. Salva i mutanti selezionati attraverso un processo di lavaggio a base di antibiotici. Lavare la piantità con soluzione di 25 mg/L cefotaxime due volte e poi trasferire a mezzo di soccorso che contiene 25 mg/L cefotaxime in 1/2 agar MS.</li>
	<li>Far crescere le placche a un fotoperiodo scuro 10 h luce/ 14 h per ottenere una pianta mutante. Il lavaggio cefotaxime aiuta a rimuovere eventuali microrganismi nocivi sulla piantina. Poiché le piantine dopo la ricostituzione sono tenute non sigillate, ridurre al minimo la contaminazione durante il trasferimento in condizioni sterili.</li>
	<li>Trasferire la pianta mutante sul suolo per ottenere la popolazione omozice M3.</li>
</ol>3. Analisi dei dati e identificazione dei mutanti (1-3 mesi)
NOTA: le letture fornite dal metodo di cui sopra sono in unità di luce relativa (RLU).
<ol><li>Per calcolare la concentrazione dicit [Ca2], utilizzare la seguente equazione di concentrazione20. pCa : 0,332588(-log (L/Lmax)) Conteggio luminescenza () e conteggio rimanenti totali (max).</li>
	<li>Convertire i valori pCa ottenuti in [Ca2]cyt values in srl moltiplicando per 106. Quindi traccia graficamente contro un controllo di aequorin (transgenico Col-0 aequorin) per identificare i putativi H2O2 mutanti alla risposta di Ca2. </li>
	<li>Piantine di salvataggio che mostrano una perdita di o ridotta risposta all'applicazione H2O2 salvata.</li>
	<li>Dopo la maturazione, raccogliere i semi dal mutante salvato e ri-screen per la risposta a H2O2 in M3 piantine. Se tutte le piantine da 12 M3 mostrano una risposta Ca 2 opiù simile alla pianta madre, considerare la popolazione come una popolazione mutante Omozygous M3. Se tutte le 12 piantine non mostrano una tale risposta, portale alla generazione M4 e ri-schermata per ottenere la popolazione omozigota.</li>
	<li>Una volta ottenuta una linea vegetale omozivia, identificare il gene che porta al fenotipo alterato utilizzando il sequenziamento di prossima generazione.</li>
</ol>

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<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+sensor+HPCA1+is+an+LRR+receptor+kinase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis.</a> Nature. 578, 577-581 (2020).</li>
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Nessuno degli autori ha alcun conflitto di interesse da dichiarare.

La mutagenesi EMS è un potente strumento per generare mutazioni nella popolazione. Gli schermi genetici classici che utilizzano lo SME sono stati uno strumento efficace per identificare nuovi geni per due motivi principali: in primo luogo, non richiedono alcuna ipotesi preliminare sull'identità genica e, in secondo luogo, non introducono alcuna distorsione. Ci sono diversi metodi per generare una popolazione di screening come EMS, inserimenti T-DNA, radiazioni ecc. Tra tutti i metodi, la mutagenesi basata su EMS ha pochi...

Un cambiamento nella concentrazione di calcio citosolico (Ca2)dopo la percezione dello stimolo biotico o abiotico è un evento di segnalazione precoce ben studiato che attiva molte vie di segnalazione1,2,3,4.4 Una cellula nel suo stato di riposo basale mantiene una minore concentrazione di Ca2 o nel citosol e sequestri in eccesso Ca2 , in vari organelli intracellulari e apoplasta extracellulare che porta ad un ripido Ca2o gradiente5,6. Dopo la percezione del segnale, i livelli di Ca2 s in n nel citosol a causa di un afflusso di Ca2 o da fonti extracellulari e/o intracellulari e generano una firma di calcio specifica di stimoli7,8,9.9 Le elevazioni Ca2 nel citosol sono attivate da molti stimoli, ma la specificità è mantenuta da negozi distinti che rilasciano Ca2 ,firma unica Ca2 e proteine del sensore appropriate10,11.
L'uso di agente alchilante, il solfato di metano etilico (EMS) per la mutagenesi è un potente strumento negli schermi genetici classici in avanti per identificare più geni indipendenti coinvolti in un processo. L'eMS è un mutageno chimico che induce prevalentemente transizioni da C a T e da G ad A in modo casuale in tutto il genoma e produce un cambiamento di 1 bp ogni 125 kb del genoma. La mutagenesi EMS indurrà cambiamenti nella coppia di base singola di 1000 dollari, ovvero inserimenti/delezioni (InDel) o polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) per genoma12. Le mutazioni indotte da EMS sono mutazioni multiple puntiformi con una frequenza di mutazione che va da 1/300 a 1/30000 per locus. Questo riduce il numero di piante M1 necessarie per trovare una mutazione in un dato gene. Un aumento della popolazione di semi M1 di 2000-3000 è tipicamente utilizzato per ottenere mutazioni di interesse in Arabidopsis thaliana13,14.
Aequorin transgenics sono Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) piante di ecotipo che esprimono p35S-apoaequorin (pMAQ2) nel citosol15. Aequorin è una proteina legante Ca2 e un gruppo protesico composto da molecola di luciferina, coelenterazina. Il legame di Ca2o all'aequorina, che ha tre siti di mani di EF leganti Ca2, si traduce in ossidazione e celio eccitato singlet16. La coelenteramide così prodotta emette una luce blu (zmax, 470 nm) che può essere rilevata dal luminometro17. Le elevazioni estremamente veloci svolte Ca 2 opiù possono quindi essere misurate in tempo reale e sfruttate per schermi genetici rapidi in avanti. Questo protocollo ha lo scopo di utilizzare la specificità della risposta al calcio per identificare i nuovi attori chiave che sono coinvolti nella firma di Ca2. Per raggiungere questo compito, utilizziamo la mutagenesi EMS nell'equorina transgenica e identifichiamo gli SNP associati alla segnalazione di Ca2. Il protocollo identifica i mutanti che non mostrano o riducono le elevazioni di Ca 2 o l'aggiuntadi stimoli. Questi mutanti possono quindi essere mappati per identificare i geni responsabili della risposta ca2. Il metodo è applicabile a qualsiasi tipo di stimoli liquidi nelle piante che si traduce in un'elevazione Ca2. Dal momento che l'elevazione di Ca2 è una delle prime risposte nel percorso di segnalazione della difesa delle piante, l'identificazione dei componenti di risposta a monte può fornire candidati per l'ingegneria genetica per sviluppare piante resilienti.

<table><tbody><tr><td>piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti</td><td>Jetbiofil</td><td>11024</td><td>per piantine in crescita</td></tr><tr><td>cliniplate bianca a 96 pozzetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>9502887</td><td>per misurazioni luminometriche</td></tr><tr><td>Aequorin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agropet</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>per la crescita delle piante</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12135</td><td>per scarico soluzione</td></tr><tr><td>Celenterazina</td><td>PJK</td><td>55779-48-1</td><td>gruppo protesico per equorina</td></tr><tr><td>Etilmetano solfonato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0880-5G</td><td>per mutagenesi dei semi</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Reagente analitico</td><td>1170</td><td>per soluzione di scarica</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Merck Life Sciences</td><td>1.93001.0521</td><td>soluzione di sterilizzazione</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Fisher Scientific</td><td>15465</td><td>come stimolo per l'elevazione del calcio</td></tr><tr><td>Luminoskan ascent</td><td>Thermo Scientific</td> 5300172 <td>misurazione della luminescenza dell'equorina</td><td></td></tr><tr><td>tampone MES Himedia</td><td></td><td>RM1128-100G</td> terreni <td>di</td></tr><tr><td>Murashige e skoog Himedia</td><td></td><td>PT021-25L</td><td>crescita delle piante</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>27805</td><td>per neutralizzare EMS</td></tr><tr><td>Ipoclorito di sodio</td><td>Merck Life Sciences</td><td>1.93607.5021</td><td>soluzione di sterilizzazione</td></tr><tr><td>Tiosolfato di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>28005</td><td>per il lavaggio delle sementi nella fase 1.6</td></tr><tr><td>soilrite</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>per la crescita delle piante</td></tr><tr><td>Vasi quadrati</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>per la crescita delle piante</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td>crescita delle piante</td></tr><tr><td>Taxim</td><td>Alkem</td><td>7180720</td><td>per il salvataggio delle piantine</td></tr></tbody></table>

schermo genetico in avanti utilizzando transgenic calcium reporter aequorin per identificare nuovi obiettivi nella segnalazione di calcio

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Gli screening genetici in avanti sono stati strumenti importanti nell'identificazione imparziale dei componenti genetici coinvolti in diversi percorsi biologici. La base dello schermo è quello di generare una popolazione mutante che può essere vagliata con un fenotipo di interesse. L'EMS (ethyl eilfonato di metano) è un agente alchilante comunemente usato per indurre mutazioni casuali in uno screening genetico classico in avanti per identificare più geni coinvolti in un dato processo. L'elevazione del calcio citosolico (Ca2)è una via di segnalazione precoce chiave che si attiva sulla percezione dello stress. Tuttavia, l'identità di recettori, canali, pompe e trasportatori di Ca2 è ancora sfuggente in molti sistemi di studio. Aequorin è una proteina reporter di calcio cellulare isolata da Aequorea victoria e stabilmente espressa in Arabidopsis. Sfruttando questo, abbiamo progettato uno schermo genetico in avanti in cui abbiamo EMS-mutagenizzato l'aequorin transgenico. I semi delle piante mutanti sono stati raccolti (M1)e lo screening per il fenotipo di interesse è stato effettuato nella popolazione segregazione (M2). Utilizzando un protocollo di misurazione Ca2o, con 96 pozzedi ad alto rendimento, è possibile identificare diversi nuovi mutanti che hanno una risposta di calcio variabile e vengono misurati in tempo reale. I mutanti con il fenotipo di interesse vengono salvati e propagati fino a ottenere una popolazione di piante mutanti omozice. Questo protocollo fornisce un metodo per gli schermi genetici in avanti in secondo piano per i giornalisti ca2 e per identificare i nuovi obiettivi regolamentati ca2.

La popolazione di EMS è stata sottoposta a screening per l'elevazione di H2O2 indotta da Ca2. Come discusso in precedenza, 12 singole piantine M2 sono state schermate da ogni linea M1. Nella Figura 3, una di queste linee M1 viene tracciata con ogni pannello che mostra 12 singole piantine M2. Un aequorin wild-type viene utilizzato come controllo per confrontare e valutare la risposta mutante. Un mutante recessivo seg...

Uno screening genetico in avanti basato sull'elevazione di Ca2 o più come lettura porta all'identificazione dei componenti genetici coinvolti nei percorsi di segnalazione dipendenti dal calcio nelle piante.

Schermo genetico in avanti utilizzando Transgenic Calcium Reporter Aequorin per identificare nuovi obiettivi nella segnalazione di calcio

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

Lo scopo di questo protocollo è quello di identificare un metodo che possa essere utilizzato per identificare nuovi geni coinvolti nella segnalazione del calcio. Per fare questo, usiamo il classico schermo genetico in avanti. La segnalazione del calcio è un importante percorso di risposta alla difesa in diversi sistemi vegetali.Per identificare i geni coinvolti in questo percorso, abbiamo usato il classico schermo genetico in avanti. In questo metodo, lo SME sarebbe usato come agente alchilante per introdurre mutazioni casuali nei sistemi vegetali. La generazione mutante sviluppata può quindi essere utilizzata per lo screening per un fenotipo di interesse.Una volta identificato il fenotipo di interesse, il gene causale può essere mappato. In questo studio, usiamo la pianta modello Arabidopsis che ha l'aequorina reporter del calcio nel suo spettro. Pesare 150 mg di semi di equorina per la mutagenesi dello SME e altri semi da 150 mg da utilizzare come controllo.Trasferire i semi in un tubo Falcon da 50 ml e aggiungere il 2%EMS o acqua autoclavata. Durante l'uso dello SME, fare attenzione perché è cancerogeno. Gli ingranaggi protettivi devono essere indossati durante l'uso dello SME e qualsiasi tipo di fuoriuscita deve essere prevenuta.Sigillare i tubi Falcon con paraffina e avvolgerlo in alluminio. Ruotare l'estremità del tubo su un'estremità per 18 ore a temperatura ambiente. Lasciare depositare e rimuovere accuratamente la soluzione EMS e scartare in un contenitore di rifiuti contenente un NaOH molare.Lavare accuratamente i semi mutagenizzati con 40 ml di acqua autoclavata almeno otto volte. Per il lavaggio finale, aggiungere 100 millimolare tiosulfato di sodio e risciacquare per almeno tre volte per rimuovere tracce di EMS. Immergere i semi in 40 ml di acqua autoclavata per un'ora per diffondere l'EMS dai semi e quindi metterli sulla carta Whatman fino a completa asciugatura.Trasferire i semi a Eppendorf e incubare a quattro gradi Celsius per due o quattro giorni per la stratificazione. Trasferire sia i semi mutagenizzati che i semi trattati con acqua sul terreno e trasferirli in sale di crescita con un periodo fotografico chiaro di 16 ore e buio di otto ore a 22 gradi Celsius e al 70% di umidità relativa. Per determinare se la mutagenesi ha avuto successo, cercare il settore della clorofilla.Abbiamo utilizzato il metodo di raccolta dei semi a base di pedigree singolo e ad ogni pianta M1 viene assegnato un numero unico. Al momento della maturazione, i semi vengono raccolti da queste singole piante mutanti e conservati come singole linee M1. Viene utilizzato un protocollo di sterilizzazione dei semi ad alta produttività e radice idroponica delle piante, adattato da Ranf et al.Il primo giorno, posizionare quasi 12-15 semi M2 per M1 una linea in singoli pozzi di una piastra di coltura tissutale da 24 pozzetti e sterilizzare utilizzando ipoclorito di sodio e soluzione di acido cloridrico con un rapporto di tre è a uno. Questo rilascia gas cloro che sterilizza i semi. Lasciare la piastra per la notte per evaporare completamente il gas cloro rimanente.Dopo la sterilizzazione, aggiungere mezzi MS liquidi a metà resistenza ai singoli pozzi e stratificare i semi per due o quattro giorni a quattro gradi Celsius, quindi spostare i semi in una camera di crescita con un periodo fotografico di luce di 10 ore e buio 14 ore a 22 gradi Celsius, umidità relativa del 70%. Il giorno 14, una volta che le piantine hanno dagli otto ai 12 giorni, posizionare 12 piantine M2 da ogni linea singolarmente in una piastra luminometrica da 96 po '. Dopo il trasferimento delle piantine, aggiungere 150 microlitri di cinque micromolare soluzione di Coelenterazina nei singoli pozzi e conservare al buio a 21 gradi Celsius per otto ore.La coelenterazina è un gruppo protesico che si lega all'apoaequorina per formare aequorina funzionale. La coelenterazina è sensibile alla luce e viene quindi conservata in bottiglie di colore scuro protette dalla luce. Il giorno dopo, i mutanti dello schermo usano il perossido di idrogeno come stimolo e misurano la successiva elevazione del calcio.Per la misurazione simultanea di 24 pozzi, viene realizzato un programma cinetico automatizzato out, che include la misurazione dello sfondo per un minuto, seguito da aggiunta e misurazione dello stimolo per 10 minuti, seguito da iniezione di scarica 150 microliter e misurazione per tre o cinque minuti. E qualsiasi scarico per l'aequorina figlia sarebbe incluso nella lettura per quantificare il calcio misurato e come controllo aggiuntivo per l'aequorina funzionale. Le letture fornite dal metodo precedente sono in unità di luce relative.Per calcolare la concentrazione citosolica di ioni di calcio, viene utilizzata un'equazione di concentrazione precedentemente descritta data da Rental e Knight nel 2004, che è descritta nel protocollo. Le RLU ottenute dal luminometro vengono aggiunte all'equazione per calcolare la concentrazione di ioni di calcio. I valori di ioni di calcio citosolici ottenuti vengono quindi tracciati graficamente contro un controllo di tipo selvaggio per identificare i mutanti putativi di perossido di idrogeno alla risposta al calcio.Questo è un risultato rappresentativo del protocollo mostrato. Abbiamo mostrato una linea M1 con 12 piantine individuali che sono state misurate per l'elevazione della concentrazione di ioni di calcio. La linea verde nel grafico indica l'aequorina di tipo selvaggio che è stata misurata insieme ai mutanti.Il rosso è la media di tutte le 12 piantine, e la linea nera è una singola piantina M2 misurata per l'elevazione degli ioni di calcio. Le piantine che mostrano una risposta altamente ridotta all'applicazione di perossido di idrogeno vengono quindi salvate. I mutanti salvati vengono quindi riconfermati nella generazione successiva, seguiti da una mappatura per identificare i geni causali.Si dovrebbe prestare attenzione quando si utilizza lo SME come mutageno poiché è cancerogeno. Gli ingranaggi protettivi devono essere indossati in ogni momento e qualsiasi fuoriuscita effettuata deve essere trattata con buone pratiche di laboratorio. Inoltre, quando si fa una raccolta di semi a base di pedigree, le singole piante dovrebbero essere raccolte con la massima cura in modo che non vi sia alcuna miscelazione di semi in nessuna fase.Questo aiuterà a tornare indietro e rintracciare la pianta madre, che è la pianta mutante omozigota. Inoltre, poiché questo metodo non introduce alcuna distorsione o ipotesi precedenti nel metodo di screening, può essere utilizzato per una o più condizioni per identificare un fenotipo di interesse. Inoltre, più geni indipendenti potrebbero anche essere identificati usando lo stesso protocollo.Il protocollo è facile da usare poiché con il piccolo dosaggio, un numero enorme di piante può essere mutagenizzato. Questo enorme numero di piante mutanti può essere utilizzato per diverse popolazioni e per diverse condizioni e per identificare diversi geni. Una perdita parziale di funzione, una funzione alterata, una completa perdita di funzione, o anche funzione genica costitutiva possono essere identificate attraverso questo metodo.La mappatura dovrebbe essere un compito semplice dato l'avanzamento delle tecnologie di mappatura negli scenari correnti. Un sistema di mappatura basato su de novo, un plottaggio razziale basato sull'SNP e molti altri possono essere usati per identificare il gene causale che causa il fenotipo di interesse. Data l'applicabilità di questo metodo, può essere utilizzato non solo sugli impianti modello Arabidopsis, ma anche su altre piante modello a condizione che sia possibile stabilire un fenotipo di lettura degli interessi.

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Schermo genetico in avanti utilizzando Transgenic Calcium Reporter Aequorin per identificare nuovi obiettivi nella segnalazione di calcio (Video) | JoVE Journal

Schermo genetico in avanti utilizzando Transgenic Calcium Reporter Aequorin per identificare nuovi obiettivi nella segnalazione di calcio

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