Name: Imaging e analisi del trasporto neurofilamento nel nervo tibiale del topo escresato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Impara a eseguire l'imaging della fotoattivazione fluorescente per analizzare il trasporto dei neurofilamenti nei nervi periferici di topi transgenici. Questo metodo consente di misurare direzione e velocità del trasporto assonale.

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Gli autori ringraziano Paula Monsma per l'istruzione e l'assistenza con la microscopia confocale e la dissezione dei nervi tibiali e la dottoressa Atsuko Uchida, Chloe Duger e Sana Chahande per l'assistenza con l'allevamento dei topi. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla collaborazione National Science Foundation Grants IOS1656784 ad A.B. e IOS1656765 a P.J., e National Institutes of Health Grants R01 NS038526, P30 NS104177 e S10 OD010383 ad A.B. N.P.B. è stato sostenuto da una borsa di studio del programma Postdoctoral Scholars del Presidente della Ohio State University.

<ol><li>Hoffman, P. N., Lasek, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+component+of+axonal+transport.+Identification+of+major+structural+polypeptides+of+the+axon+and+their+generality+among+mammalian+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons.</a> Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).</li>
<li>Brown, A. Slow Axonal Transport. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrown%2C+A+%22Reference+Module+in+Biomedical+Sciences%22">Reference Module in Biomedical Sciences</a>. , (2014).</li>
<li>Wang, L., Ho, C. -L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+movement+of+axonal+neurofilaments+interrupted+by+prolonged+pauses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses.</a> Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).</li>
<li>Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+neurofilament+transport+in+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons.</a> Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).</li>
<li>Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilaments+switch+between+distinct+mobile+and+stationary+states+during+their+transport+along+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons.</a> Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).</li>
<li>Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+regulation+of+neurofilament+transport+by+myelinating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells.</a> Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).</li>
<li>Walker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Acceleration+of+Neurofilament+Transport+at+Nodes+of+Ranvier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier.</a> Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).</li>
<li>Li, Y., Brown, A., Jung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+axonal+transport+kinetics+of+neurofilaments+using+the+fluorescence+photoactivation+pulse-escape+method%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method.</a> Physical Biology. 11 (2), 026001(2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Breuer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+axonal+transport+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+an+intra-axonal+organelle+traffic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis.</a> Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).</li>
<li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells%3A+FRAP%2C+photoactivation%2C+photoconversion%2C+and+FLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).</li>
<li>Model, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensity+calibration+and+flat-field+correction+for+fluorescence+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes.</a> Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).</li>
<li>Schmidt, M. M., Dringen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+iodoacetamide+and+iodoacetate+on+glycolysis+and+glutathione+metabolism+of+cultured+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroenergetics%22%5BJournal%5D)">Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes.</a> Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).</li>
<li>Surre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+increase+in+the+autofluorescence+of+cells+signals+struggle+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12088(2018).</li>
<li>Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Least+Squares+Congealing+for+Unsupervised+Alignment+of+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+IEEE+Computer+Society+Conference+on+Computer+Vision+and+Pattern+Recognition%22%5BJournal%5D)">Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images.</a> Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).</li>
<li>Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy+of+NAD%28P%29H+and+flavoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).</li>
<li>Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kymograph+analysis+with+high+temporal+resolution+reveals+new+features+of+neurofilament+transport+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics.</a> Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).</li>
<li>Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+Va+increases+the+efficiency+of+neurofilament+transport+by+decreasing+the+duration+of+long-term+pauses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses.</a> Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).</li>
<li>Xu, Z., Tung, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+Spatial+Variations+in+Slow+Axonal+Transport+Velocity+Along+Peripheral+Motoneuron+Axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons.</a> Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).</li>
<li>Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+Slowing+of+Neurofilament+Transport+Along+the+Mouse+Sciatic+Nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve.</a> Physical Biology. 6 (4), 046002(2009).</li>
<li>Cohen, J. The effect size index: d. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+J+%22Statistical+Power+Analysis+for+the+Behavioral+Sciences+2nd+ed%22">Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed</a>. , Lawrence Erlbaum Associates. 20-26 (1988).</li>
<li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+axonal+transport+of+mitochondria+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging axonal transport of mitochondria in vivo.</a> Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).</li>
<li>Gilley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+axonal+transport+and+locomotor+changes+and+tau+hypophosphorylation+in+a+%22P301L%22+tau+knockin+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a "P301L" tau knockin mouse.</a> Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).</li>
<li>Marinkovic, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).</li>
<li>Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+declines+with+age+in+two+distinct+phases+separated+by+a+period+of+relative+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).</li>
<li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'analisi degli esperimenti di fuga e di diffusione dell'impulso deve essere presa in considerazione perché esiste un potenziale significativo per l'introduzione dell'errore durante la post-elaborazione, principalmente durante la correzione del campo piatto, l'allineamento dell'immagine e la correzione della candeggina. La correzione a campo piatto è necessaria per correggere la non uniformità nell'illuminazione, che si traduce in una caduta di intensità attraverso il campo di vista dal centro alla periferia. L'entità de...

Il trasporto assonale dei neurofilamenti è stato dimostrato per la prima volta negli anni '70 mediante l'etichettatura radioisotopica a impulsi1. Questo approccio ha prodotto una ricchezza di informazioni sul trasporto neurofilamento in vivo, ma ha una risoluzione spaziale e temporale relativamente bassa, in genere nell'ordine di millimetri e giorni al meglio2. Inoltre, l'etichettatura radioisotopica degli impulsi è un approccio indiretto che richiede l'iniezione e il sacrificio di più animali per generare un singolo corso di tempo. Con la scoperta delle proteine fluorescenti e i progressi nella microscopia a fluorescenza negli anni '90, è diventato successivamente possibile immagine del trasporto neurofilamento direttamente nei neuroni ri culture su una scala temporale di secondi o minuti e con risoluzione spaziale sub-micrometrica, offrendo una visione molto maggiore del meccanismo del movimento3. Questi studi hanno rivelato che i polimeri neurofilament negli assoni si muovono rapidamente e ad intermittenza sia in direzioni anterograde che retrograde lungo le tracce di microtubuli, spinte dalle proteine motorie dei microtubuli. Tuttavia, i neurofilamenti sono strutture limitate alla diffrazione di soli 10 nm di diametro che sono tipicamente distanziate dai loro vicini da solo decine di nanometri; pertanto, i polimeri possono essere tracciati solo in neuroni ri culture che contengono neurofilamenti scarsamente distribuiti in modo che i polimeri in movimento possano essere risolti dai loro vicini4. Pertanto, non è attualmente possibile tracciare singoli neurofilamenti in assoni che contengono abbondanti polimeri neurofilament, come gli assoni mielinati.
Per analizzare il trasporto assonale dei neurofilamenti in assoni ricchi di neurofilamenti utilizzando la microscopia a fluorescenza, usiamo un metodo di sfuggimento a impulsi di fotoattivazione fluorescenza che abbiamo sviluppato per studiare il comportamento di pausa a lungo termine dei neurofilamenti nelle cellule nervosepianate 4,5. I neurofilamenti contrassegnati con una proteina di fusione del neurofilamento fluorescente fotoattivabile vengono attivati in un breve segmento di assone, e quindi il tasso di partenza di tali filamenti dalla regione attivata viene quantificato misurando il decadimento della fluorescenza nel tempo. Il vantaggio di questo approccio è che si tratta di un'analisi a livello di popolazione del trasporto neurofilamento che può essere applicata su una scala temporale di minuti o ore senza la necessità di monitorare il movimento dei singoli polimeri neurofilament. Ad esempio, abbiamo usato questo metodo per analizzare la cinetica del trasporto neurofilamento nelle culture mielinanti6.
Recentemente, abbiamo descritto lo sviluppo di un topo transgenico hThy1-paGFP-NFM che esprime bassi livelli di una proteina neurofilamento con tag paGFP M (paGFP-NFM) nei neuroni sotto il controllo del promotore Thy1 specifico del neuroneumano 7. Questo topo permette l'analisi del trasporto di neurofilamenti in situ utilizzando la microscopia a fluorescenza. In questo articolo, descriviamo gli approcci sperimentali per l'analisi del trasporto di neurofilamenti in assoni mielinati di nervi tibiali da questi topi utilizzando due approcci. Il primo di questi approcci è il metodo di fuga a impulsi descritto in precedenza. Questo metodo può generare informazioni sul comportamento di pausa dei neurofilamenti, ma è cieco alla direzione in cui i filamenti lasciano la regione attivata e pertanto non consente la misurazione della direzionalità netta e della velocità ditrasporto 8. Il secondo di questi approcci è un nuovo metodo di diffusione dell'impulso in cui analizziamo non solo la perdita di fluorescenza dalla regione attivata, ma anche l'aumento transitorio della fluorescenza in due finestre di fiancheggiamento attraverso le quali i filamenti fluorescenti si muovono mentre partono dalla regione attivata sia in direzioni anterograde che retrograde. In entrambi gli approcci, i parametri del trasporto neurofilamento come la velocità media, la direzionalità netta e il comportamento di pausa possono essere ottenuti utilizzando l'analisi matematica e la modellazione dei cambiamenti nella fluorescenza nelle finestre di misurazione. Figura 3 illustra questi due approcci.
Questo protocollo dimostra la dissezione e la preparazione del nervo, l'attivazione e l'imaging della fluorescenza paGFP e la quantificazione del trasporto neurofilamento dalle immagini acquisite utilizzando il pacchetto di distribuzione FIJI di ImageJ9. Usiamo il nervo tibiale perché è lungo (diversi cm) e non si ramifica; tuttavia, in linea di principio qualsiasi nervo che esprime paGFP-NFM è appropriato per l'uso con questa tecnica se può essere sezionato e de-tireggiato senza danneggiare gli assoni.

<table><tbody><tr><td>Guarnizione rettangolare 14 x 22 0,1 mm</td><td>Bioptechs</td><td>1907-1422-100</td><td>guarnizione interna</td></tr><tr><td>2-deossi-D-glucosio</td><td>Sigma</td><td>D6134</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizione rotonda da 30 mm con fori</td><td>Bioptechs</td><td>1907-08-750</td><td>guarnizione esterna</td></tr> piatto <tr><td>35 x 10 mm</td><td>Thermo Fisher</td><td>153066</td><td>piastre di dissezione</td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti rotondi da 40 mm</td><td>Bioptechs</td><td>40-1313-0319</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 60 ml - Punta Luer-lock</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Sistema confocale a disco rotante Andor Revolution WD</td><td>Andor</td><td></td><td>dotato di sistemi Perfect Focus e FRAPPA</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Fisher</td><td>12-541-B</td><td>per vetrino di fluoresceina</td></tr><tr><td>Soluzione D-(+)-glucosio</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Perni di dissezione</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-70</td><td></td></tr><tr><td>Pinze di dissezione</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>pinze a punta fine</td></tr><tr><td>Microscopio di dissezione</td><td>Zeiss</td><td>47 50 03</td><td></td></tr><tr><td>Vaschetta di dissezione con cera</td><td>Ginsberg Scientific</td><td>568859</td><td></td></tr><tr><td>Forbici di dissezione</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-09</td><td>iniziale forbici da dissezione</td></tr><tr><td>FCS2 camera di perfusione</td><td>Bioptechs</td><td>060319-2-03</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina sodica</td><td>Fluka</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore di soluzione in linea</td><td>Warner Instruments</td><td>SH27-B</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per laminectomia</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td>pinze per dissezione iniziale</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per microacquedotto</td><td>Bioptechs</td><td>130119-5</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td>per vetrino di fluoresceina</td></tr><tr><td>Inserto per tavolino per microscopio</td><td>Strumentazione scientifica applicata</td><td>I-3017</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di riscaldamento dell'obiettivo</td><td>Okolab</td><td></td><td>Oko Touch con collare dell'obiettivo</td></tr><tr><td>Olio dell'obiettivo - tipo</td><td>A Nikon</td><td>fuori produzione</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo VC 100x 1.40 NA obiettivo</td><td>Nikon</td><td>MRD01901</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodio iodoacetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2512</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>Sage Instruments</td><td>Modello 355</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore per tubi - femmina</td><td>Small Parts Inc.</td><td></td><td></td>1005109</tr><tr><td>Adattatore per tubi - maschio</td><td>Small Parts Inc.</td><td></td><td></td>1005012</tr><tr><td>Tygon tubi</td><td>Bioptechs</td><td></td><td>1/16" ID, 1/32" spessore della parete</td></tr><tr><td>Vannas forbici a molla</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td>forbici fini</td></tr></tbody></table>

imaging e analisi del trasporto neurofilamento nel nervo tibiale del topo escresato

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

I polimeri proteici neurofilamenti si muovono lungo gli assoni nella componente lenta del trasporto assonale a velocità medie di 0,35-3,5 mm al giorno. Fino a poco tempo fa lo studio di questo movimento in situ era possibile solo utilizzando l'etichettatura a impulsi radioisotopica, che permette l'analisi del trasporto assonale in nervi interi con una risoluzione temporale di giorni e una risoluzione spaziale di millimetri. Per studiare il trasporto di neurofilamenti in situ con una risoluzione temporale e spaziale più elevata, abbiamo sviluppato un topo transgenico hThy1-paGFP-NFM che esprime la proteina neurofilamento M etichettata con GFP fotoattivabile nei neuroni. Qui descriviamo i metodi di fluorescenza fotoattivazione impulso-fuga e pulsazione-spread per analizzare il trasporto neurofilamento in assoni mielinati singoli di nervi tibiali da questi topi ex vivo. I segmenti nervosi isolati vengono mantenuti sullo stadio del microscopio per perfusione con salina ossigenata e immagini di microscopia a fluorescenza confocale del disco rotante. La luce viola viene utilizzata per attivare la fluorescenza in una breve finestra assonale. La fluorescenza nelle regioni attivate e fiancheggiate viene analizzata nel tempo, permettendo lo studio del trasporto neurofilamento con risoluzione temporale e spaziale rispettivamente nell'ordine dei minuti e dei micron. La modellazione matematica può essere utilizzata per estrarre i parametri cinetici del trasporto neurofilamento, tra cui la velocità, la distorsione direzionale e il comportamento di pausa dai dati risultanti. I metodi di fuga di impulsi e di diffusione del polso possono anche essere adattati per visualizzare il trasporto di neurofilamenti in altri nervi. Con lo sviluppo di topi transgenici aggiuntivi, questi metodi potrebbero anche essere utilizzati per immagini e analisi del trasporto assonale di altre proteine citoscheschescheschesche e citosoliche negli assoni.

La Figura 3 mostra immagini rappresentative da esperimenti di fuga di impulsi e di diffusione del polso. Abbiamo pubblicato diversi studi che descrivono i dati ottenuti utilizzando il metodo pulse-escape e i nostri metodi per l'analisi di quei dati5,6,7,8,17. Di seguito, mostriamo come i dati di diffusione dell'impulso possono pro...

Descriviamo i metodi di fotoattivazione della fluorescenza per analizzare il trasporto assonale dei neurofilamenti in assoni singoli mielinati di nervi periferici da topi transgenici che esprimono una proteina neurofilabile fotoattivabile.

Imaging e analisi del trasporto neurofilamento nel nervo tibiale del topo escresato

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Questo protocollo consente l'imaging diretto della popolazione di neurofilamento negli assoni mielinati da topi giovani o adulti utilizzando la microscopia a fluorescenza, rendendo possibile misurare la direzionalità e la velocità del trasporto del neurofilamento in segmenti nervosi isolati. Questo metodo dipende dalla disponibilità di topi che esprimono una fusione fluorescente fotoattivabile della proteina di interesse, ma può essere adattato per l'uso in qualsiasi nervo prontamente sezionato. Per iniziare, versare la salina ossigenata in una siringa da 60 millilitri e assicurarsi che rimanga aria minima nella siringa.Collegare la siringa al tubo, quindi posizionare il tubo di deflusso in un pallone di scarto. Posizionare la guarnizione esterna nell'alloggiamento della camera di perfusione, assicurando che i pali di ingresso e uscita del flusso siano allineati con i fori nella guarnizione, quindi posare la guarnizione interna su una coverlip circolare numero 1.5 e levigare con cura eventuali rughe nella guarnizione per garantire una tenuta stretta. Posizionare la busta e la guarnizione su un tovagliolo di carta o una salvietta per compiti con la guarnizione rivolta verso l'alto.Usa un paio di grandi forbici a dissezione per fare un'incisione dorsale nella pelle vicino al centro della colonna vertebrale e continuare a tagliare intorno all'aspetto ventrale dell'animale. Allontanare lentamente la pelle dal muscolo e tagliare la fascia. Successivamente, utilizzare le forbici a microdisezione per fare un'incisione nei muscoli della coscia a metà strada tra la coda e il ginocchio per esporre il nervo sciatico.Assicurarsi che il nervo, visibile attraverso il muscolo, non sia tagliato. Estendere l'incisione dorsalmente e ventralmente per rimuovere il muscolo, quindi rimuovere i muscoli del polpaccio, mantenendo i tagli poco profondi e corti per evitare di danneggiare i nervi. Continuare a rimuovere i muscoli fino a quando il nervo tibiale è completamente esposto dal punto in cui si ramica dal nervo sciatico al tallone.Afferrare il nervo tibiale all'estremità prossimale della colonna vertebrale con un paio di forcep e tagliarlo con un paio di forbici di microdisezione, assicurandosi di non applicare troppa tensione al nervo. Sollevarlo con cura lontano dal muscolo e tagliare eventuali attacchi, facendo attenzione a non mettere tensione sul nervo. Tagliare l'estremità distale della colonna vertebrale del nervo tibiale e trasferirlo in una piccola piastra di Petri di soluzione salina ossigenata a temperatura ambiente.Partendo dall'estremità prossimale del nervo, afferrare delicatamente le estremità dell'assone esposto con un paio di punte molto fini. Con un secondo paio di forcep, afferrare la torcia nervosa prossimale e tirare lentamente verso l'estremità distale del nervo assicurandosi che non si applica alcuna tensione indebita durante questo processo. Afferrare l'estremità prossimale del nervo e stenderla lentamente su un coverslip, quindi raddrizzare sotto delicata tensione.Posizionare il microaquedotto scivolare sul nervo con lo scivolo scanalato verso il basso e posizionare la direzione del flusso parallela al nervo. Capovolgere l'assieme di coverslip e microaquedotto e posizionarlo nell'alloggiamento della camera di perfusione con lo scivolo opposto alla guarnizione esterna. Per fissare la camera di profusione, posizionarla nell'alloggiamento metallico e ruotare l'anello di bloccaggio.Deprimere lentamente lo stantuffo della siringa salina e riempire la camera di perfusione. Mantenere sempre i tubi di ingresso e di uscita, il pallone di uscita e la siringa sopra la camera stessa durante la configurazione e l'imaging. Trasferire l'assieme di profusione in uno stadio di microscopio invertito e montare la siringa salina nella pompa della siringa, quindi avviare il motore e regolare la velocità per una portata di 0,25 millilitri al minuto.Collegare il riscaldatore della soluzione in linea e impostarlo a 37 gradi Celsius. Collegare il riscaldatore obiettivo e impostarlo a 37 gradi Celsius. Applicare l'olio sull'obiettivo e inserire la camera di profusione nel supporto del palco.Applicare l'olio sul riscaldatore della camera e attaccarlo alla camera di perfusione, quindi collegarlo e impostarlo a 37 gradi Celsius. Bloccare la camera di profusione nell'adattatore del palco e mettere l'olio obiettivo a contatto con la coverslip sul lato inferiore della camera. Utilizzare l'illuminazione Brightfield per concentrarsi sullo strato di assoni sulla superficie inferiore del nervo più vicino alla superficie del coverslip.Gli assoni mielinati possono essere identificati dalla presenza di una tona mielina visibile sotto l'illuminazione della luce trasmessa da Brightfield senza miglioramento del contrasto. Acquisire un'immagine di riferimento Brightfield, registrando la direzionalità del nervo, quindi acquisire un'immagine confocale utilizzando un laser da 488 nanometri e un filtro di emissione appropriato per la GFP fotoattivabile. Impostare la potenza del laser su circa cinque volte la normale potenza di imaging e acquisire un'immagine con un tempo di esposizione da tre a quattro minuti, quindi acquisire un'altra immagine confocale per registrare l'autofluorescenza pre-attivazione dopo la fase di sbiancamento.Disegna una linea parallela agli assoni con una lunghezza uguale alla dimensione della finestra di attivazione desiderata dell'immagine Brightfield. Usando questa linea come guida, disegna una regione rettangolare di interesse attraverso il campo visivo perpendicolare agli assoni. Attivare la fluorescenza GFP in questa regione mediante eccitazione di pattern con la luce di 405 nanometri, assicurandosi che un'immagine sia acquisita appena prima e immediatamente dopo l'attivazione.Al termine dell'attivazione, avviare un timer di un minuto. Quando si spegne, inizia l'acquisizione di una serie timelapse. Aggiungere 250 milligrammi di polvere di fluoresceina a 0,5 millilitri di acqua distillata doppia e mescolarla fino a quando non ci sono particelle visibili, quindi ruotare la soluzione per 30 secondi in una centrifuga da tavolo per sedimentare qualsiasi materiale non dissolto.Aggiungere otto microlitri di soluzione di fluoresceina a uno scivolo e applicare una coverlip numero 1.5. Asciugare il liquido in eccesso, sigillare il coperchio con smalto per unghie e lasciare asciugare lo scivolo. Posizionare il lato di scorrimento sul lato del microscopio invertito e regolare la messa a fuoco sul piano sottile di fluorescenza sulla superficie del coverslip.Spostare la diapositiva per trovare un campo visivo che non contenga bolle d'aria o particelle di fluoresceina di grandi dimensioni e acquisire una pila Z che si estende su sei micrometri a intervalli di 0,2 micrometri in modo che l'immagine centrale sia il piano di messa a fuoco originale. Chiudere tutte le persiane del percorso luminoso, incluso l'otturatore della fotocamera, e impostare la potenza del laser e il tempo di esposizione a zero secondi. Acquisisci una pila di 100 immagini con queste impostazioni, che verranno mediate per generare l'immagine del campo scuro.Qui vengono mostrate immagini rappresentative degli esperimenti di fuga e diffusione dell'impulso. Per il metodo di fuga dell'impulso, la cinetica di decadimento della fluorescenza nella regione attivata può fornire informazioni sul comportamento di sospensione a lungo e breve termine. La regione attivata può essere breve per questi esperimenti.Una regione attivata più lunga viene utilizzata per il metodo di diffusione dell'impulso al fine di fornire un pool più ampio di neurofilamenti fluorescenti. Ciò allunga il tempo durante il quale l'aumento della fluorescenza nelle regioni di fianco rimane lineare. Qui vengono utilizzate finestre di fianco di 15 micrometri.La fluorescenza totale dalla finestra di misura è stata quantificata. Il decadimento è bifasico per il metodo di fuga dell'impulso con un decadimento esponenziale iniziale che rappresenta la partenza di neurofilamenti in pista e un secondo decadimento esponenziale più lento a 10-20 minuti che rappresenta la partenza di filamenti fuori pista. Per la strategia di diffusione dell'impulso, i calcoli della velocità e della direzionalità del movimento dipendono solo dalle pendenze nelle finestre di fianco.Per le lunghezze delle finestre qui utilizzate, la fase lineare si estende per circa cinque minuti. Qui viene mostrata una timelapse da un nervo glicoliticamente inibito, che dimostra un'apparente riduzione del trasporto fuori dalla regione attivata. Infatti, i pendii distale e prossimale sono significativamente più bassi nei nervi trattati con inibitore.C'è anche una significativa diminuzione della velocità della popolazione tra queste due condizioni. Quando tenti questo protocollo, ricorda che è fondamentale essere affrettati nel condurre le porzioni di dissezione e assemblaggio della camera mentre la salute dei nervi diminuisce dopo il sacrificio dell'animale. La coltura cellulare neuronale può consentire la misurazione e l'analisi del movimento dei singoli neurofilamenti, che integrerebbe i dati della scala della popolazione raccolti utilizzando questo protocollo.

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