Name: Imaging e analisi del trasporto neurofilamento nel nervo tibiale del topo escresato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Impara a eseguire l'imaging della fotoattivazione fluorescente per analizzare il trasporto dei neurofilamenti nei nervi periferici di topi transgenici. Questo metodo consente di misurare direzione e velocità del trasporto assonale.

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Gli autori ringraziano Paula Monsma per l'istruzione e l'assistenza con la microscopia confocale e la dissezione dei nervi tibiali e la dottoressa Atsuko Uchida, Chloe Duger e Sana Chahande per l'assistenza con l'allevamento dei topi. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla collaborazione National Science Foundation Grants IOS1656784 ad A.B. e IOS1656765 a P.J., e National Institutes of Health Grants R01 NS038526, P30 NS104177 e S10 OD010383 ad A.B. N.P.B. è stato sostenuto da una borsa di studio del programma Postdoctoral Scholars del Presidente della Ohio State University.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'analisi degli esperimenti di fuga e di diffusione dell'impulso deve essere presa in considerazione perché esiste un potenziale significativo per l'introduzione dell'errore durante la post-elaborazione, principalmente durante la correzione del campo piatto, l'allineamento dell'immagine e la correzione della candeggina. La correzione a campo piatto è necessaria per correggere la non uniformità nell'illuminazione, che si traduce in una caduta di intensità attraverso il campo di vista dal centro alla periferia. L'entità de...

Il trasporto assonale dei neurofilamenti è stato dimostrato per la prima volta negli anni '70 mediante l'etichettatura radioisotopica a impulsi1. Questo approccio ha prodotto una ricchezza di informazioni sul trasporto neurofilamento in vivo, ma ha una risoluzione spaziale e temporale relativamente bassa, in genere nell'ordine di millimetri e giorni al meglio2. Inoltre, l'etichettatura radioisotopica degli impulsi è un approccio indiretto che richiede l'iniezione e il sacrificio di più animali per generare un singolo corso di tempo. Con la scoperta delle proteine fluorescenti e i progressi nella microscopia a fluorescenza negli anni '90, è diventato successivamente possibile immagine del trasporto neurofilamento direttamente nei neuroni ri culture su una scala temporale di secondi o minuti e con risoluzione spaziale sub-micrometrica, offrendo una visione molto maggiore del meccanismo del movimento3. Questi studi hanno rivelato che i polimeri neurofilament negli assoni si muovono rapidamente e ad intermittenza sia in direzioni anterograde che retrograde lungo le tracce di microtubuli, spinte dalle proteine motorie dei microtubuli. Tuttavia, i neurofilamenti sono strutture limitate alla diffrazione di soli 10 nm di diametro che sono tipicamente distanziate dai loro vicini da solo decine di nanometri; pertanto, i polimeri possono essere tracciati solo in neuroni ri culture che contengono neurofilamenti scarsamente distribuiti in modo che i polimeri in movimento possano essere risolti dai loro vicini4. Pertanto, non è attualmente possibile tracciare singoli neurofilamenti in assoni che contengono abbondanti polimeri neurofilament, come gli assoni mielinati.
Per analizzare il trasporto assonale dei neurofilamenti in assoni ricchi di neurofilamenti utilizzando la microscopia a fluorescenza, usiamo un metodo di sfuggimento a impulsi di fotoattivazione fluorescenza che abbiamo sviluppato per studiare il comportamento di pausa a lungo termine dei neurofilamenti nelle cellule nervosepianate 4,5. I neurofilamenti contrassegnati con una proteina di fusione del neurofilamento fluorescente fotoattivabile vengono attivati in un breve segmento di assone, e quindi il tasso di partenza di tali filamenti dalla regione attivata viene quantificato misurando il decadimento della fluorescenza nel tempo. Il vantaggio di questo approccio è che si tratta di un'analisi a livello di popolazione del trasporto neurofilamento che può essere applicata su una scala temporale di minuti o ore senza la necessità di monitorare il movimento dei singoli polimeri neurofilament. Ad esempio, abbiamo usato questo metodo per analizzare la cinetica del trasporto neurofilamento nelle culture mielinanti6.
Recentemente, abbiamo descritto lo sviluppo di un topo transgenico hThy1-paGFP-NFM che esprime bassi livelli di una proteina neurofilamento con tag paGFP M (paGFP-NFM) nei neuroni sotto il controllo del promotore Thy1 specifico del neuroneumano 7. Questo topo permette l'analisi del trasporto di neurofilamenti in situ utilizzando la microscopia a fluorescenza. In questo articolo, descriviamo gli approcci sperimentali per l'analisi del trasporto di neurofilamenti in assoni mielinati di nervi tibiali da questi topi utilizzando due approcci. Il primo di questi approcci è il metodo di fuga a impulsi descritto in precedenza. Questo metodo può generare informazioni sul comportamento di pausa dei neurofilamenti, ma è cieco alla direzione in cui i filamenti lasciano la regione attivata e pertanto non consente la misurazione della direzionalità netta e della velocità ditrasporto 8. Il secondo di questi approcci è un nuovo metodo di diffusione dell'impulso in cui analizziamo non solo la perdita di fluorescenza dalla regione attivata, ma anche l'aumento transitorio della fluorescenza in due finestre di fiancheggiamento attraverso le quali i filamenti fluorescenti si muovono mentre partono dalla regione attivata sia in direzioni anterograde che retrograde. In entrambi gli approcci, i parametri del trasporto neurofilamento come la velocità media, la direzionalità netta e il comportamento di pausa possono essere ottenuti utilizzando l'analisi matematica e la modellazione dei cambiamenti nella fluorescenza nelle finestre di misurazione. Figura 3 illustra questi due approcci.
Questo protocollo dimostra la dissezione e la preparazione del nervo, l'attivazione e l'imaging della fluorescenza paGFP e la quantificazione del trasporto neurofilamento dalle immagini acquisite utilizzando il pacchetto di distribuzione FIJI di ImageJ9. Usiamo il nervo tibiale perché è lungo (diversi cm) e non si ramifica; tuttavia, in linea di principio qualsiasi nervo che esprime paGFP-NFM è appropriato per l'uso con questa tecnica se può essere sezionato e de-tireggiato senza danneggiare gli assoni.

<table><tbody><tr><td>Guarnizione rettangolare 14 x 22 0,1 mm</td><td>Bioptechs</td><td>1907-1422-100</td><td>guarnizione interna</td></tr><tr><td>2-deossi-D-glucosio</td><td>Sigma</td><td>D6134</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizione rotonda da 30 mm con fori</td><td>Bioptechs</td><td>1907-08-750</td><td>guarnizione esterna</td></tr> piatto <tr><td>35 x 10 mm</td><td>Thermo Fisher</td><td>153066</td><td>piastre di dissezione</td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti rotondi da 40 mm</td><td>Bioptechs</td><td>40-1313-0319</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 60 ml - Punta Luer-lock</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Sistema confocale a disco rotante Andor Revolution WD</td><td>Andor</td><td></td><td>dotato di sistemi Perfect Focus e FRAPPA</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Fisher</td><td>12-541-B</td><td>per vetrino di fluoresceina</td></tr><tr><td>Soluzione D-(+)-glucosio</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Perni di dissezione</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-70</td><td></td></tr><tr><td>Pinze di dissezione</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>pinze a punta fine</td></tr><tr><td>Microscopio di dissezione</td><td>Zeiss</td><td>47 50 03</td><td></td></tr><tr><td>Vaschetta di dissezione con cera</td><td>Ginsberg Scientific</td><td>568859</td><td></td></tr><tr><td>Forbici di dissezione</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-09</td><td>iniziale forbici da dissezione</td></tr><tr><td>FCS2 camera di perfusione</td><td>Bioptechs</td><td>060319-2-03</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina sodica</td><td>Fluka</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore di soluzione in linea</td><td>Warner Instruments</td><td>SH27-B</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per laminectomia</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td>pinze per dissezione iniziale</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per microacquedotto</td><td>Bioptechs</td><td>130119-5</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td>per vetrino di fluoresceina</td></tr><tr><td>Inserto per tavolino per microscopio</td><td>Strumentazione scientifica applicata</td><td>I-3017</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di riscaldamento dell'obiettivo</td><td>Okolab</td><td></td><td>Oko Touch con collare dell'obiettivo</td></tr><tr><td>Olio dell'obiettivo - tipo</td><td>A Nikon</td><td>fuori produzione</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo VC 100x 1.40 NA obiettivo</td><td>Nikon</td><td>MRD01901</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodio iodoacetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2512</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>Sage Instruments</td><td>Modello 355</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore per tubi - femmina</td><td>Small Parts Inc.</td><td></td><td></td>1005109</tr><tr><td>Adattatore per tubi - maschio</td><td>Small Parts Inc.</td><td></td><td></td>1005012</tr><tr><td>Tygon tubi</td><td>Bioptechs</td><td></td><td>1/16" ID, 1/32" spessore della parete</td></tr><tr><td>Vannas forbici a molla</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td>forbici fini</td></tr></tbody></table>

imaging e analisi del trasporto neurofilamento nel nervo tibiale del topo escresato

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

I polimeri proteici neurofilamenti si muovono lungo gli assoni nella componente lenta del trasporto assonale a velocità medie di 0,35-3,5 mm al giorno. Fino a poco tempo fa lo studio di questo movimento in situ era possibile solo utilizzando l'etichettatura a impulsi radioisotopica, che permette l'analisi del trasporto assonale in nervi interi con una risoluzione temporale di giorni e una risoluzione spaziale di millimetri. Per studiare il trasporto di neurofilamenti in situ con una risoluzione temporale e spaziale più elevata, abbiamo sviluppato un topo transgenico hThy1-paGFP-NFM che esprime la proteina neurofilamento M etichettata con GFP fotoattivabile nei neuroni. Qui descriviamo i metodi di fluorescenza fotoattivazione impulso-fuga e pulsazione-spread per analizzare il trasporto neurofilamento in assoni mielinati singoli di nervi tibiali da questi topi ex vivo. I segmenti nervosi isolati vengono mantenuti sullo stadio del microscopio per perfusione con salina ossigenata e immagini di microscopia a fluorescenza confocale del disco rotante. La luce viola viene utilizzata per attivare la fluorescenza in una breve finestra assonale. La fluorescenza nelle regioni attivate e fiancheggiate viene analizzata nel tempo, permettendo lo studio del trasporto neurofilamento con risoluzione temporale e spaziale rispettivamente nell'ordine dei minuti e dei micron. La modellazione matematica può essere utilizzata per estrarre i parametri cinetici del trasporto neurofilamento, tra cui la velocità, la distorsione direzionale e il comportamento di pausa dai dati risultanti. I metodi di fuga di impulsi e di diffusione del polso possono anche essere adattati per visualizzare il trasporto di neurofilamenti in altri nervi. Con lo sviluppo di topi transgenici aggiuntivi, questi metodi potrebbero anche essere utilizzati per immagini e analisi del trasporto assonale di altre proteine citoscheschescheschesche e citosoliche negli assoni.

La Figura 3 mostra immagini rappresentative da esperimenti di fuga di impulsi e di diffusione del polso. Abbiamo pubblicato diversi studi che descrivono i dati ottenuti utilizzando il metodo pulse-escape e i nostri metodi per l'analisi di quei dati5,6,7,8,17. Di seguito, mostriamo come i dati di diffusione dell'impulso possono pro...

Descriviamo i metodi di fotoattivazione della fluorescenza per analizzare il trasporto assonale dei neurofilamenti in assoni singoli mielinati di nervi periferici da topi transgenici che esprimono una proteina neurofilabile fotoattivabile.

Imaging e analisi del trasporto neurofilamento nel nervo tibiale del topo escresato

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Questo protocollo consente l'imaging diretto della popolazione di neurofilamento negli assoni mielinati da topi giovani o adulti utilizzando la microscopia a fluorescenza, rendendo possibile misurare la direzionalità e la velocità del trasporto del neurofilamento in segmenti nervosi isolati. Questo metodo dipende dalla disponibilità di topi che esprimono una fusione fluorescente fotoattivabile della proteina di interesse, ma può essere adattato per l'uso in qualsiasi nervo prontamente sezionato. Per iniziare, versare la salina ossigenata in una siringa da 60 millilitri e assicurarsi che rimanga aria minima nella siringa.Collegare la siringa al tubo, quindi posizionare il tubo di deflusso in un pallone di scarto. Posizionare la guarnizione esterna nell'alloggiamento della camera di perfusione, assicurando che i pali di ingresso e uscita del flusso siano allineati con i fori nella guarnizione, quindi posare la guarnizione interna su una coverlip circolare numero 1.5 e levigare con cura eventuali rughe nella guarnizione per garantire una tenuta stretta. Posizionare la busta e la guarnizione su un tovagliolo di carta o una salvietta per compiti con la guarnizione rivolta verso l'alto.U

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Identificazione immunocitochimica dei sottotipi di nervo periferico sensoriale fibra (e l'individuazione di espressione della proteina stessa) sono la chiave per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base della sensazione periferici. Qui si descrivono i metodi per la preparazione di campioni di tessuti periferici / viscerale, come la pelle e le ossa degli arti, per immunocolorazione specifica periferica fibre nervose sensoriali.

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Fonte: Boyer, N. P. et. al., Imaging e analisi del trasporto di neurofilamenti nel nervo tibiale di topo asportato. J. Vis. Exp. (2020) Questo video mostra il metodo di fotoattivazione della fluorescenza da analizzare Trasporto di neurofilamenti negli assoni mielinizzati dei nervi periferici. Tracciando i neurofilamenti verdi fotoattivati marcati con fluorofori, la tecnica fornisce informazioni sul trasporto assonale nelle malattie neurodegenerative.

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Il nervo del perone Metodo Injury: Un test affidabile di individuare e testare i fattori che Repair neuromuscolari giunzioni

Qui, descriviamo un protocollo per la visualizzazione di proiezione del neurone di motore e arborization assone in embrioni di topo transgenici Hb9::GFP . Dopo immunostaining per motoneuroni, abbiamo usato Microscopia di fluorescenza del foglio leggero agli embrioni di immagine per la successiva analisi quantitativa. Questo protocollo è applicabile ad altri processi di navigazione di neuroni nel sistema nervoso centrale.

Visualizzazione di navigazione motore Axon e quantificazione di Axon Arborization negli embrioni del Mouse utilizzando la microscopia a fluorescenza foglio leggero

L'obiettivo di questa tecnica è quello di preparare una cultura altamente arricchita dei motoneuroni primari (MNs) da murino del midollo spinale. Per valutare le conseguenze delle mutazioni che causano malattie MN, descriviamo qui l'isolamento di questi isolati MNs e loro transfezione di magnetofection.

Malattia di Charcot-Marie-Tooth In Vitro di modellazione di trasfezione motoneuroni primari del Mouse

L'elettroporazione è un approccio efficace per trasportare geni degli interessi nelle cellule. Applicando questo approccio in vivo sui neuroni del ganglio di topo adulto radice dorsale (DRG), descriviamo un modello per lo studio di rigenerazione dell'assone in vivo.

Inquirenti rigenerazione dell'assone dei mammiferi: In Vivo elettroporazione del ganglio di radice dorsale del topo adulto

La capacità di rilevare con precisione i componenti della giunzione neuromuscolare è fondamentale per valutare le modifiche nella sua architettura a causa di processi patologici o di sviluppo. Qui presentiamo una descrizione completa di un metodo semplice per ottenere immagini di alta qualità di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero che possono essere utilizzate per eseguire misurazioni quantitative.

Dissezione di fibre muscolari scheletriche singole per analisi immunofluorescenti e morfometriche di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero

Utilizzando topi fluorescenti transgenici, vengono descritti protocolli dettagliati per valutare il trasporto assonale in vivo di endosomi e mitocondri di segnalazione all'interno di assoni motori e sensoriali del nervo sciatico intatto in animali vivi.

Espansione del toolkit per l'imaging in vivo del trasporto assonale

Impara a eseguire l'imaging della fotoattivazione fluorescente per analizzare il trasporto dei neurofilamenti nei nervi periferici di topi transgenici. Questo metodo consente di misurare direzione e velocità del trasporto assonale.

Imaging e analisi del trasporto neurofilamento nel nervo tibiale del topo escresato

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