Calibrazione e utilizzo delle prestazioni del microcoil MRM dimostrato sulle radici della trogola Medicago a 22 T

Questo protocollo consente la caratterizzazione e l'utilizzo di microcoil per la risonanza magnetica ad altissimo campo. La risonanza magnetica è uno strumento unico e non invasivo per esplorare la fisiologia, il metabolismo e le proprietà di diffusione del campione biologico. Utilizzando un'elevata resistenza al campo magnetico e microcoil adattati a un campione di interesse, è possibile ottenere immagini fino a risoluzione cellulare.

In questo metodo, descriviamo passo dopo passo come determinare le caratteristiche dei microcoil commerciali o costruiti in casa per le applicazioni di imaging. Utilizziamo campioni biologici di diametro inferiore a un millimetro e uno spettrometro NMR a foro verticale ad altissimo campo. Utilizzando microcoil costruiti in casa, possiamo regolare le dimensioni della bobina a radiofrequenza in base alle dimensioni del campione.

In questa ricerca, stiamo usando un piccolo pezzo di radice vegetale. Ciò è utile perché la sensibilità della bobina è proporzionale al diametro decrescente della bobina. Possiamo quindi ottenere immagini con un rapporto segnale/rumore più elevato per piccoli campioni.

A causa delle piccole dimensioni e della fragilità di questi microcoil, è importante stabilire alcuni parametri di base come, ad esempio, la lunghezza dell'impulso e la potenza dell'impulso di 90 gradi, i limiti operativi di sicurezza e infine calcolare la sensibilità della bobina in un modo che può essere confrontato tra diversi sistemi NMR. Il microcoil solenoide è costituito da un filo arrotolato attorno a un capillare e due condensatori: la messa a punto e il condensatore corrispondente. Il condensatore di sintonizzazione viene scelto per ottenere la frequenza risonante desiderata di 950 megahertz, mentre il condensatore corrispondente ha scelto di ottenere la massima trasmissione del segnale.

È un'impedenza di 50 Ohm. Il condensatore più grande è variabile per consentire una regolazione più fine. La bobina si trova su una piastra di base che è fissata a una presa modificata.

Opzionalmente, è possibile aggiungere un serbatoio per il fluido di corrispondenza della suscettibilità per ridurre gli effetti di suscettibilità dal filo della bobina. In un bicchiere da orologio trasferire un millilitro di perfluorodecalina, o PFD, che verrà utilizzato per immergere il campione. Pfd viene utilizzato in quanto può riempire gli spazi dell'aria nel campione senza entrare in cellule biologiche.

Inoltre, non è osservabile dalla risonanza prima e futila protonica. Coprire immediatamente il PFD con un coperchio della piastra di Petri per evitare l'evaporazione prima che sia necessario. Se si prepara un campione di riferimento, utilizzare invece una soluzione di solfato di rame.

Quindi, estrarre attentamente un sistema radicale dal suo substrato di crescita. Asportare una piccola sezione usando un bisturi. Per il trattamento sottovuoto, posizionare il campione in un tubo Eppendorf contenente una soluzione fissante.

Quindi sigillare il tubo con un filamento e fori di punzonatura per consentire la ventilazione. Sottosotire il campione al trattamento sottovuoto. Le bolle d'aria possono essere viste sfuggire al campione.

Mentre si guarda attraverso un microscopio stereo utilizzare una pinzetta per immergere sia il campione che il capillare nella soluzione preparata in precedenza. Quindi inserire il campione nel capillare utilizzando una pinzetta sia capillare che campionare un completamente sommerso. Utilizzare un capillare più piccolo o una punta dell'ago della siringa come asta di spinta.

Modellare la carta velina in un punto fine e usarla per rimuovere circa un millimetro di liquido da entrambe le estremità del capillare. Sciogliere, un piccolo volume di cera capillare usando una penna di cera. Applicare la cera su entrambi i lati.

La cera diventerà opaca quando si solidifica. Fare attenzione ad escludere le bolle d'aria dal capillare. Successivamente, raschiare la cera in eccesso usando un bisturi.

Inserire il campione nel microcoil utilizzando una pinzetta, mantenendo stabile il microcoil. Utilizzare un'asta per centrare il campione nella bobina. Se la bobina viene testata per la prima volta, utilizzare un campione di riferimento di solfato di rame per la calibrazione della potenza e determinare l'SNR e l'omogeneità del campo B1.

Questo protocollo è dimostrato su uno spettrometro a foro verticale da 22,3 Tesla dotato di una sonda di micro imaging con bobine di gradiente integrate, in grado di raggiungere fino a tre Tesla per metro. Collegare il microcoil alla base della sonda mantenendo il microcoil in posizione verticale. Quindi scorrere sopra la bobina di gradiente del triplo asse.

Ruotare il filetto a vite sulla base della sonda per fissare la sfumatura in posizione. Inserire la sonda nel magnete ed effettuare le connessioni necessarie. Iniziate una curva di oscillazione e regolate la sintonizzazione e la corrispondenza in base alle esigenze.

Si consiglia di iniziare con un'elevata larghezza di sweep spettrale. Tenere presente che potrebbero essere presenti più modalità risonanti. I test SNR per ogni modalità potrebbero essere necessari per determinare la modalità risonante corretta.

Selezionare la configurazione corretta della bobina per il microcoil. Nel caso in cui i limiti di sicurezza per le bobine siano sconosciuti, iniziare con 10 microsecondi a una bassa potenza di impulso di 0,6 watt e aumentare lentamente la lunghezza dell'impulso di un microsecondo alla volta fino a quando non appare un segnale. Registrare una curva di nutazione per una nuova bobina per ottenere la lunghezza e la potenza dell'impulso corrette per l'impulso di 90 gradi.

Per farlo variare sistematicamente la durata dell'impulso mantenendo costante la potenza dell'impulso. Nel caso di un campo B1 disomogeneo, l'impulso di 90 gradi può essere stimato dalle lunghezze alle quali si ottiene la massima intensità del segnale. Utilizzare una scala localizzatore con ampio campo visivo per localizzare la posizione della bobina all'interno del magnete.

Se l'esempio si trova esattamente al centro del sistema di sfumature, l'analisi del localizzatore mostrerà l'esempio. Se la bobina o il campione è fuori centro, regolare la scansione del localizzatore. Una volta trovata una potenza di impulso approssimativa usando la curva di nutazione, variare gradualmente le potenze dell'impulso per una serie di immagini per verificare la presenza dell'immagine più omogenea.

Per alcune bobine con un campo B1 disomogeneo, l'impulso determinato di 90 gradi può essere sopravvalutato portando a un sovrasofficimento nel punto dolce desiderato della bobina. Shim manualmente il campo magnetico basato sul segnale FID. A seconda dell'orientamento dei microcoils shims con orientamento diverso può comportare una correzione più forte dell'omogeneità B0.

Successivamente, è necessario calcolare un SNR normalizzato in volume. Innanzitutto, calcola il volume voxel moltiplicando la risoluzione X e Y per lo spessore della fetta. L'SNR è calcolato sottraendo il rumore medio dal segnale medio e dividendolo per la deviazione standard del rumore moltiplicato per il volume voxel.

Il segnale medio viene prelevato dal centro dell'immagine, mentre il segnale di rumore viene calcolato dalle patch angolari. Eseguire una sequenza di eco a gradiente multiplo per verificare la presenza di potenziali problemi di suscettibilità dovuti al filo della bobina e al campione stesso. Per le bobine sommerse, la differenza di suscettibilità tra i fili della bobina e il loro ambiente è notevolmente ridotta.

L'imaging ad alta risoluzione potrebbe essere raggiunto con esperimenti flash 3D. Si possono distinguere diverse caratteristiche della radice come l'endodermide, la corteccia e lo xilem, che sono difficili da risolvere usando bobine più grandi. Multislice, sequenze multiecho possono anche essere utilizzate per ridurre l'influenza della suscettibilità.

Tuttavia, ciò avviene a costo di una sensibilità ridotta per unità di tempo. I noduli root di Medicago truncatula possono anche essere imaged utilizzando questo protocollo. Una risoluzione isotropica di 31 micrometri è stata ottenuta in quattro minuti, mentre una risoluzione isotropica di 16 micrometri è stata ottenuta in 33 minuti.

Ciò consente di studiare in dettaglio vari aspetti fisiologici dei piccoli noduli delle radici. Per una preparazione efficace del campione, è importante immergere completamente sia il campione che il capillare nel liquido. Ciò impedisce la formazione di bolle d'aria che influenzano negativamente la qualità dell'immagine.

Poiché l'imaging MR non è distruttivo, possiamo rimuovere il campione biologico dopo la risonanza magnetica e usarlo per ulteriori studi usando, ad esempio, la microscopia ottica. Dopo aver guardato questo video dovresti avere una conoscenza di base della caratterizzazione e del funzionamento del microcoil per le applicazioni di imaging. Questo può essere applicato a un'ampia varietà di campioni biologici.