Name: Analisi patologica delle metastasi polmonari a seguito di iniezione laterale della vena della coda di cellule tumorali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Scopri un metodo di analisi digitale per quantificare le metastasi polmonari dopo iniezione nella vena della coda in modelli murini. Questa tecnica offre misurazioni accurate e riproducibili del carico tumorale.

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I dati rappresentativi sono stati finanziati attraverso il National Cancer Institute (K22CA218549 a S.T.S). Oltre alla loro assistenza nello sviluppo del metodo di analisi completo qui riportato, ringraziamo l'Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Direttore - Krista La Perle, DVM, PhD) per i servizi di istologia e immunoistochimica e il Pathology Imaging Core per lo sviluppo e l'analisi degli algoritmi.

L'uso degli animali ha seguito i regolamenti dell'Università Laboratory Animal Resources (ULAR) nell'ambito del protocollo approvato dall'OSU Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore).
1. Iniezione della vena della coda delle cellule del cancro al seno
<ol><li>Preparazione di cellule e siringhe per iniezione<ol>
<li>Placcare un numero appropriato di cellule in base al numero di topi e alla concentrazione cellulare da utilizzare. NOTA: Il numero di cellule iniettate e il tempo per lo sviluppo delle metastasi dipenderanno dalla linea cellulare utilizzata e dovranno essere ottimizzati. In questa dimostrazione, 1 x 106 cellule MDA-MB-231 vengono iniettate per via endovenosa in topi NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) e le lesioni polmonari macroscopiche vengono osservate entro e non oltre 24 giorni dopo l'iniezione. Per la linea cellulare del tumore mammario murino MVT117, 3 x 106 cellule vengono iniettate in topi FVB/N immunocompatibili con numerose metastasi polmonari osservate da 14 giorni22,23.</li>
		<li>Aspirare i mezzi e le piastre delle celle di risciacquo con 1x PBS. Tripsinizzare le cellule in volume minimo, aggiungere il volume appropriato di media e contare le cellule utilizzando un ematocitometro o un altro metodo preferito. Il blu di tripano (0,4%) o altri coloranti a cellule vive / morte possono essere utilizzati per determinare la conta cellulare vitale.</li>
		<li>Celle a pellet ruotando a 180 x g per 5 min.</li>
		<li>Sospendere il numero appropriato di cellule in PBS sterile 1x in modo tale che venga iniettato un volume di 100 μL per topo. Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio per mantenere la vitalità.</li>
		<li>Prima dell'iniezione, risospendare accuratamente le cellule con una pipetta da 200 μL o 1 mL per evitare l'aggregazione. Aspirare 100 μL in una siringa da insulina da 28 G (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Eliminare eventuali bolle d'aria mantenendo la siringa verticale, picchiettando la siringa e regolando lentamente lo stantuffo. L'iniezione di bolle d'aria nella vena è probabile che causi un'embolia aria / gas che può essere fatale.</li>
	</ol></li>
	<li>Iniezione laterale della vena della coda NOTA: Per i test sperimentali di metastasi del cancro al seno, le iniezioni vengono eseguite su topi femmina di > 6 settimane.<ol>
<li>Maneggiare il mouse per la coda e far scivolare l'animale in un tubo/dispositivo di ritenuta a fessura di dimensioni appropriate (vedere la tabella dei materiali per il dispositivo di ritenuta utilizzato).</li>
		<li>Inserire la parte della spina del dispositivo di ritenuta e posizionare il mouse su un lato in modo tale che la sua vena laterale della coda sia facile da visualizzare. Il topo ha un'arteria ventrale in linea con i genitali, una vena dorsale e due vene caudali laterali.</li>
		<li>Pulire la superficie della coda del mouse con una salvietta asettica. Afferrare la coda tra indice e pollice con la mano non dominante e applicare una leggera tensione.</li>
		<li>A partire dalla porzione distale della coda, inserire l'ago parallelo alla vena con la fine smussata.</li>
		<li>Se consentito, ricapitolare attentamente l'ago e piegarlo con un angolo di 20-30 °. Un dispositivo di avvicinamento con una sola mano o un dispositivo di ricapitolazione dell'ago è altamente raccomandato. NOTA: Non è necessario aspirare in quanto ciò potrebbe causare il collasso della vena. Tuttavia, un piccolo lampo di sangue può essere visto quando viene posizionato per la prima volta. L'ago avanzerà dolcemente nella vena con un posizionamento corretto.</li>
		<li>Erogare lentamente il volume completo nella vena. Non ci dovrebbe essere resistenza quando lo stantuffo viene spinto.</li>
		<li>Se si avverte resistenza, rimuovere prontamente l'ago della siringa. Se necessario, reinserire l'ago (idealmente non più di 3 tentativi) spostandosi verso l'estremità prossimale della coda o la vena laterale opposta.</li>
		<li>Un piccolo volume di sangue sarà probabilmente spostato dopo l'iniezione. Applicare una leggera pressione con una garza sterile e pulire con una salvietta asettica.</li>
		<li>Smaltire tempestivamente la siringa in un apposito contenitore per taglienti.</li>
		<li>Riportare il mouse in una gabbia pulita e ventilata e monitorare i segni di pericolo.</li>
		<li>Monitorare i topi 2-3x / settimana per segni di formazione di metastasi (respirazione affannosa, postura curva, perdita di peso) e disagio generale. Il tempo di sviluppo delle metastasi dipenderà dalla linea cellulare e dal ceppo di topo.</li>
		<li>Se si utilizza un dispositivo di imaging animale vivo in vivo, i topi immagine immediatamente dopo l'iniezione della vena della coda per confermare il successo dell'iniezione di cellule e ottenere dati "zero" a tempo (dettagli specifici sull'imaging a bioluminescenza in vivo non sono inclusi nel presente documento, ma sono descritti da Yang et al.24).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fissazione del tessuto polmonare e analisi del carico tumorale polmonare metastatico
<ol><li>Gonfiaggio del tessuto polmonare per mantenere il formato strutturale dei polmoni per l'istopatologia<ol>
<li>Dopo aver seguito le procedure di eutanasia approvate (ad es. anidride carbonica al 30 - 70% di spostamento del volume della camera / min), fissare la carcassa del topo a una scheda di dissezione con perni. Spruzzare o applicare il 70% di etanolo per tenere la pelliccia del topo fuori mano durante la dissezione. NOTA: L'asfissia da anidride carbonica può causare emorragia polmonare come lesione di fondo prevista, specialmente a portate più lente.</li>
		<li>Aprire il torace con un'incisione della linea mediana, estendere l'incisione cranicamente / caudale attraverso il peritoneo e tagliare via il diaframma afferrando il processo xifoide.</li>
		<li>Usando un set separato di forbici per non opacizzare le lame, tagliare le costole lungo ciascun lato dello sterno e rimuovere con cura la gabbia toracica lasciando spazio ai polmoni per espandersi.</li>
		<li>Isolare la trachea rimuovendo le ghiandole salivari sottomandibolari e la muscolatura infraioide. Posizionare i perni su entrambi i lati della trachea può impedire movimenti indesiderati durante l'inserimento dell'ago.</li>
		<li>Riempire una siringa da 26 G con 2-3 mL di formalina tamponata neutra al 10% e inserirla nella trachea.</li>
		<li>Iniettare lentamente formalina e guardare per i polmoni di espandersi (di solito richiede ~ 1,5 ml di formalina).</li>
		<li>Una volta che la formalina inizia a fuoriuscire dai polmoni (evitare l'inflazione eccessiva), pizzicare la trachea con un paio di pinze, rimuovere l'ago della siringa e staccare l'intero apparato respiratorio. Posizionare polmoni, cuore, ecc. direttamente nella formalina poiché è possibile eseguire ulteriori rifilature del tessuto dopo la fissazione.</li>
		<li>Completa la lavorazione, l'incorporamento, il sezionamento del tessuto e la colorazione di ematossilina ed eosina (H & E) utilizzando metodi standard.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi del carico tumorale polmonare metastatico<ol>
<li>Scansione di sezioni polmonari colorate di H&E su uno scanner a vetrini ad alta risoluzione con ingrandimento 40x (Figura 3).</li>
		<li>Importare immagini in un software di analisi delle immagini (ad esempio, Visiopharm Image Analysis) per la quantificazione delle metastasi polmonari. NOTA: si consiglia ai nuovi utenti di ottenere una formazione in loco o online per utilizzare il software di analisi delle immagini. Numerosi webinar sono disponibili anche attraverso la pagina web commerciale.</li>
		<li>Selezionare l'app Visiopharm 10118 H&E Lung Metastasis dalla libreria di app del software. NOTA: lo scopo di questa app è quello di etichettare e quantificare le metastasi polmonari sui vetrini colorati di H & E. Come parte dell'app 10118 H&E Lung Metastasis, la prima fase di elaborazione delle immagini segmenta il tessuto polmonare con l'app Tissue Detection. La seconda fase di elaborazione delle immagini utilizza l'app Metastasis Detect che identifica le metastasi all'interno del tessuto polmonare. Le metastasi sono identificate attraverso la forma insieme a regioni che sono troppo deformate, troppo rosse o troppo sparse per essere identificate come metastasi.</li>
		<li>Regola i parametri che definiscono la forma e la scarsità per adattarli al meglio alle immagini rappresentative. Le aree segmentate delle metastasi tumorali e del tessuto polmonare normale possono essere visualizzate utilizzando etichette di colore diverse per ogni tipo di tessuto. NOTA: nel caso in cui l'app non sia in grado di separare con precisione le metastasi dal tessuto polmonare normale, potrebbe essere necessario scrivere un'app personalizzata che utilizza il programma Visiopharm Decision Forest come è stato fatto per gli esperimenti (vedere figura 2 e figura 3). Di seguito sono riportati i dettagli per la scrittura di un algoritmo personalizzato. In caso contrario, procedere al passaggio 2.2.9.</li>
		<li>Apri il programma Decision Forest, che funziona addestrando più classi [ad esempio, tessuto polmonare (non neoplastico), metastasi, globuli rossi, epitelio e / o spazio bianco] su un'immagine desiderata. Nella Figura 2, le metastasi tumorali sono blu, il tessuto normale è verde e l'epitelio bronchiolare è giallo. Inoltre, i globuli rossi sono in rosso e gli spazi d'aria in rosa.</li>
		<li>Segui la serie di domande sì o no richieste per addestrare in modo appropriato ogni classe per un'immagine. L'accuratezza dell'algoritmo determinerà il numero di domande sì/no. Per l'analisi, l'algoritmo/app personalizzato è stato scritto con una precisione impostata su 50 (intervallo 0-100).</li>
		<li>Regola le funzionalità per ogni classe applicando filtri per affinare, sfocare, ordinare per forma, ecc. per migliorare l'accuratezza dell'algoritmo/app. Visiopharm visualizza ogni classe attraverso una o più lenti note come funzionalità. Le funzionalità modificano il modo in cui la classe vede l'immagine per far risaltare determinati colori o intensità. NOTA: per l'algoritmo personalizzato, le metastasi di 8500 μm2 e superiori sono etichettate e misurate come metastasi. Ciò tiene conto della varianza delle dimensioni e delle metastasi troppo piccole per essere rilevate. Piccole aree deformate e piccole aree metastatiche inferiori a 8500 μm2 sono state incluse nella normale quantificazione tissutale.</li>
		<li>Salva le impostazioni modificate dall'app o dall'algoritmo personalizzato e quindi applica l'algoritmo / app a un intero set o serie di tessuti colorati H & E.</li>
		<li>Infine, esportare tutte le variabili di output, incluse quelle elencate nella Tabella 1. L'area in micron al quadrato (μm2) può essere quantificata per ciascun tipo di tessuto e le percentuali sono derivate dall'area totale del tessuto netto del campione (cioè tessuto totale meno spazio aereo).</li>
		<li>Quando si crea un algoritmo personalizzato, rivedere i markup dei tessuti in consultazione con un patologo veterinario certificato dall'American College of Veterinary Pathologists per garantire misurazioni accurate e distinguere tra i tipi di tessuto.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Bone+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+orthotopic+mouse+models+of+patient-derived+breast+cancer+brain+metastases+by+a+modified+intracarotid+injection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method.</a> Scientific Reports. 9 (1), 622(2019).</li>
<li>Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+strategies+for+treating+brain+metastases+from+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer.</a> Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).</li>
<li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Stereology+Applications+for+the+Pathologist%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Practical Stereology Applications for the Pathologist.</a> Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).</li>
<li>Aeffner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Microscopy%2C+Image+Analysis%2C+and+Virtual+Slide+Repository%5BTitle%5D)+AND+%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research+Journal%22%5BJournal%5D)">Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Mentre i ricercatori continuano a utilizzare l'iniezione endovenosa di cellule tumorali come modello sperimentale per le metastasi, mancano pratiche standard per analizzare il carico tumorale metastatico risultante. In alcuni casi, differenze significative nel carico tumorale metastatico in caso di manipolazione di particolari linee cellulari e/o uso di composti chimici possono essere osservate macroscopicamente. Tuttavia, in altri casi, sottili differenze nella semina e nella crescita metastatica possono essere trascura...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.
The author list was updated from:
Katie A. Thies1,&#160;Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
to:
Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

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Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Nonostante sia un processo altamente complesso e inefficiente1, le metastasi contribuiscono in modo significativo alla morbilità e alla mortalità dei pazienti oncologici2. In effetti, la maggior parte dei decessi correlati al cancro sono attribuiti alla diffusione metastatica della malattia3,4. Affinché le cellule tumorali possano metastatizzare con successo, devono staccarsi dal sito primario, invadere attraverso lo stroma adiacente, intravasare la circolazione sanguigna o linfatica, viaggiare verso il letto capillare di un sito secondario, estravasare nel tessuto secondario e proliferare o crescere fino a formare lesioni metastatiche5. L'uso di modelli murini è stato fondamentale per promuovere la comprensione dei meccanismi molecolari responsabili della semina e della crescita metastatica6,7. Qui ci concentriamo sulle metastasi del cancro al seno, per le quali vengono spesso utilizzati sia modelli murini geneticamente modificati che metodi di trapianto, ognuno con la propria serie di vantaggi e limitazioni.
I modelli di tumore mammario geneticamente modificati fanno uso di promotori specifici della ghiandola mammaria, tra cui MMTV-LTR (mouse mammary tumor virus long terminal repeat) e WAP (Whey Acidic Protein), per guidare l'espressione dei transgeni nell'epitelio mammario8. Gli oncogeni tra cui l'antigene T medio del polioma (PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 e il virus simian 40 (SV40) sono stati espressi in questo modo9,10,11,12,13, e mentre questi modelli genetici sono utili per studiare l'inizio e la progressione del tumore primario, pochi metastatizzano facilmente in organi distanti. Inoltre, questi modelli genetici murini sono spesso più proibitivi in termini di tempo e costi rispetto ai modelli di metastasi spontanee o sperimentali. Data la limitazione della maggior parte dei modelli di tumore mammario geneticamente modificati per studiare le metastasi, le tecniche di trapianto sono diventate metodi interessanti per studiare questo complesso processo. Ciò include l'iniezione ortotopica, della vena della coda, intracardiaca e intracranica di linee cellulari adatte.
Sebbene diverse linee cellulari di cancro al seno metastatizzino prontamente dopo l'iniezione ortotopica nel cuscinetto di grasso mammario14,15, la consistenza e la riproducibilità del carico tumorale metastatico può essere una sfida e la durata di tali studi può essere dell'ordine di diversi mesi. Per valutare le metastasi polmonari, in particolare, l'iniezione endovenosa nella vena della coda è spesso un metodo più riproducibile ed efficace nel tempo con diffusione metastatica che si verifica tipicamente nell'arco di poche settimane. Tuttavia, poiché il modello di iniezione endovenosa bypassa le fasi iniziali della cascata metastatica, è necessario prestare attenzione nell'interpretare i risultati di questi studi. In questa dimostrazione, mostriamo l'iniezione della vena caudale di cellule tumorali mammarie insieme a un metodo di analisi accurato e completo.
Anche se la comunità di ricerca ha compiuto progressi significativi nella comprensione del complesso processo delle metastasi del cancro al seno, si stima che oltre 150.000 donne abbiano attualmente il cancro al seno metastatico16. Di quelli con carcinoma mammario in stadio IV, >36% dei pazienti ha metastasi polmonari17; tuttavia, il modello sito-specifico e l'incidenza delle metastasi possono variare in base al sottotipo molecolare18,19,20,21. Le pazienti con metastasi polmonari associate al cancro al seno hanno una sopravvivenza mediana di soli 21 mesi, evidenziando la necessità di identificare trattamenti efficaci e nuovi biomarcatori per questa malattia17. L'uso di modelli sperimentali di metastasi, compresa l'iniezione endovenosa di cellule tumorali, continuerà a far progredire la nostra conoscenza di questa importante sfida clinica. Quando combinate con la patologia di imaging digitale e il metodo di analisi del carico tumorale polmonare metastatico descritto in questo protocollo, le iniezioni di vena caudale sono uno strumento prezioso per la ricerca sulle metastasi del cancro al seno.

<table><tbody><tr><td>cuscinetti per la preparazione dell'alcol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td>per pulire la coda prima dell'iniezione</forbici></td></tr><tr><td>dissezione</td><td>forte Fisher Scientific</td><td>08-951-5</td><td>per la dissezione del topo e il gonfiaggio del tessuto polmonare</td></tr><tr><td>DMEM con L-glutammina, 4,5 g/L di glucosio e piruvato di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10013CV</td><td>base di terreni di coltura cellulare per linee cellulari MDA-MB-231 e MVT1</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21030CV</td><td>utilizzata per la risospensione di cellule tumorali per iniezione</td></tr><tr><td>etanolo (soluzione al 70 %)</td><td>OSU</td><td></td><td>utilizzata per ridurre al minimo il pelo del topo durante la dissezione; prestare attenzione - colorante blu di</td></tr><tr><td>Evan infiammabile</td><td>Millipore Sigma</td><td>E2129</td><td>utilizzato all'1 % in PBS sterile per esercitarsi con il metodo di iniezione della vena di coda; usare cautela - reagente pericoloso</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Millipore Sigma</td><td>F4135</td><td>additivo per terreni di coltura cellulare; utilizzato al 10% nelle</td></tr><tr><td>pinze</td> DMEM <td>Fisher Scientific</td><td>10-270</td><td>per la dissezione e il gonfiaggio dei tessuti polmonari</td></tr><tr><td>Topi FVB/NJ</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001800</td><td>ceppo di topo singenico per cellule MVT1</td></tr><tr><td>emacitometro (Bright-Line)</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z359629</td><td>per l'uso in colture cellulari per ottenere la conta cellulare</td></tr><tr><td>siringa da insulina (28 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td>per iniezioni di vena di coda (BD 329424)</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cellule</td> ATCC <td>linea cellulare di carcinoma mammario umano</td><td>ATCC</td><td></td></tr><tr><td>cellule MVT1 cellule</td><td></td><td></td> di <td>tumore mammario di topo</td></tr><tr><td>aghi (26 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-15</td><td>utilizzato per gonfiare il Formalina</td></tr><tr><td>tamponata neutra polmonare (10%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>245685</td><td>utilizzata come fissativo tissutale e per gonfiare il tessuto polmonare; prestare attenzione - reagente</td></tr><tr><td>pericoloso NOD. Topi Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)</td><td>Il Jackson Laboratory</td><td>005557</td><td>gestito da OSUCCC Target Validation Shared Resource</td></tr><tr><td>Penicillina Streptomycin 100x</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>Additivo per terreni di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Garza sterile</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9379092</td><td>per l'applicazione di pressione sulla coda del topo in caso di sanguinamento</td></tr><tr><td>siringa (5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-458</td><td>utilizzato per gonfiare il sistema</td></tr> di <tr><td>contenimento della vena caudale</td> del tessuto polmonare di <td>topo Braintree Scientific, Inc.</td><td>TV-150 STD</td><td>utilizzato per trattenere il topo per iniezioni della vena caudale Blu</td></tr> di <tr><td>tripano (0,4 %)</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>utilizzato in colture cellulari per valutare la vitalità</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,25 %</td><td>ThermoFisher</td><td>25200-114</td><td>utilizzato in coltura cellulare per staccare le cellule tumorali dalla piastra</td></tr></tbody></table>

analisi patologica delle metastasi polmonari a seguito di iniezione laterale della vena della coda di cellule tumorali

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Le metastasi, la causa principale di morbilità e mortalità per la maggior parte dei malati di cancro, possono essere difficili da modellare preclinicamente nei topi. Sono disponibili pochi modelli di metastasi spontanee. Pertanto, il modello sperimentale di metastasi che coinvolge l'iniezione della vena caudale di linee cellulari adatte è un pilastro della ricerca sulle metastasi. Quando le cellule tumorali vengono iniettate nella vena laterale della coda, il polmone è il loro sito preferito di colonizzazione. Una potenziale limitazione di questa tecnica è la quantificazione accurata del carico tumorale polmonare metastatico. Mentre alcuni ricercatori contano macrometastasi di dimensioni predefinite e/o includono micrometastasi dopo il sezionamento del tessuto, altri determinano l'area delle lesioni metastatiche rispetto all'area tissutale normale. Entrambi questi metodi di quantificazione possono essere estremamente difficili quando il carico metastatico è elevato. Qui, dimostriamo un modello di iniezione endovenosa di metastasi polmonari seguito da un metodo avanzato per quantificare il carico tumorale metastatico utilizzando un software di analisi delle immagini. Questo processo consente di studiare più parametri end-point, tra cui la dimensione media delle metastasi, il numero totale di metastasi e l'area totale delle metastasi, per fornire un'analisi completa. Inoltre, questo metodo è stato esaminato da un patologo veterinario certificato dall'American College of Veterinary Pathologists (SEK) per garantire l'accuratezza.

Se si utilizzano cellule non etichettate per l'iniezione della vena della coda, può essere difficile confermare la colonizzazione polmonare fino a (1) il tempo dell'autopsia se si possono osservare macrometastasi o (2) dopo l'analisi istologica se esistono metastasi microscopiche. Con un ampio carico di tumore polmonare metastatico, i topi avranno faticato a respirare. Come con qualsiasi studio sul tumore, i topi devono essere attentamente monitorati per tutta la durata dello studio. L'uso di cellule marcate è un modo se...

L'iniezione endovenosa di cellule tumorali viene spesso utilizzata nella ricerca sulle metastasi, ma il carico tumorale metastatico può essere difficile da analizzare. Qui, dimostriamo un modello di iniezione della vena caudale di metastasi e includiamo un nuovo approccio per analizzare il carico tumorale polmonare metastatico risultante.

Analisi patologica delle metastasi polmonari a seguito di iniezione laterale della vena della coda di cellule tumorali

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Attualmente non esiste un gold standard per l'analisi dei carichi di tumori polmonari metastatici indotti dall'iniezione della vena coda. Abbiamo utilizzato l'analisi digitale delle immagini per quantificare in modo accurato e riproducibile le metastasi polmonari in modo altamente efficiente. Questo metodo è efficiente in termini di tempo e costi.E, se abbinato all'analisi digitale delle immagini, consente un'analisi estremamente accurata e completa del carico tumorale metastatico polmonare risultante. Per preparare le cellule di carcinoma mammario umano per l'iniezione, in primo luogo, posizionare un numero appropriato di cellule in un terreno di coltura cellulare adatto, in base al numero di topi e alla concentrazione di cellule da utilizzare. Quando le cellule raggiungono una confluenza dell'80-90%, lavare le piastre con PBS e staccare le cellule in un volume minimo di tripsina, secondo i protocolli standard.Quando le cellule si sono staccate, sospenderle nuovamente in un terreno di coltura fresco per il conteggio e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Quindi, risospendere le cellule alla concentrazione appropriata in 100 microlitri di PBS per topo, su ghiaccio. Poco prima dell'iniezione, risospendere accuratamente le cellule sul ghiaccio per evitare la formazione di grumi e caricare 100 microlitri di cellule in una siringa da insulina calibro 28.Mantenendo la siringa in posizione verticale, picchiettare lo stelo mentre si regola lentamente lo stantuffo per rimuovere eventuali bolle. Se consentito, richiudere con cura l'ago e piegare la punta dell'ago a un angolo di 20-30 gradi. Trattiene una femmina di topo di più di sei settimane in un sistema di ritenuta per topi di plastica e posiziona il topo su un lato in modo che la sua vena caudale laterale sia facilmente visibile.Localizzare l'arteria ventrale in linea con i genitali, una vena dorsale e due vene caudali laterali e utilizzare una salvietta asettica per pulire la superficie della coda. Afferrando la coda tra l'indice e il pollice della mano non dominante, applicare una leggera tensione e, iniziando dalla parte distale della coda, inserire l'ago, con il lato smussato rivolto verso l'alto, parallelo alla vena. Erogare lentamente l'intero volume di cellule nella vena.Un piccolo volume di sangue verrà probabilmente spostato dopo l'iniezione. Applicare una leggera pressione con una garza sterile sul sito di iniezione. Quindi gettare la siringa in un contenitore per oggetti taglienti appropriato e posizionare il topo in una gabbia pulita e ventilata con monitoraggio.Entro non più di un'ora dall'iniezione della vena caudale, eseguire l'imaging in vivo su animali vivi per confermare il successo dell'iniezione cellulare e ottenere dati sul tempo zero. Per mantenere il formato strutturale dei polmoni per l'istopatologia, fissare il topo a una tavola da dissezione e bagnare la pelliccia con etanolo al 70%. Aprire il torace con un'incisione sulla linea mediana, estendendo l'incisione cranialmente e caudalmente attraverso il peritoneo, e afferrare il processo xifoideo per consentire la rimozione del diaframma.Usando un secondo paio di forbici, taglia le costole lungo ciascun lato dello sterno e rimuovi con cura la gabbia toracica per lasciare spazio ai polmoni per espandersi. Per isolare la trachea, rimuovere le ghiandole salivari sottomandibolari e la muscolatura infraioidea e posizionare dei perni su entrambi i lati della trachea per evitare movimenti indesiderati durante l'inserimento dell'ago. Caricare una siringa da tre millilitri, dotata di un ago calibro 26, con due o tre millilitri di Formelina tamponata neutra al 10%, e inserire l'ago nella trachea.Iniettare lentamente la formelina, osservando l'espansione dei polmoni. Una volta che la formlina inizia a fuoriuscire dai polmoni, usa una pinza per pizzicare la trachea e rimuovere l'ago. Quindi staccare l'intero apparato respiratorio e posizionare gli organi direttamente in un contenitore di Formelina fresca.Per l'analisi del carico tumorale polmonare metastatico, eseguire la scansione di sezioni di tessuto polmonare colorate con H&E su uno scanner per vetrini ad alta risoluzione con un ingrandimento di 40 volte e importare le immagini in un programma software di analisi delle immagini appropriato. Regola i parametri che definiscono la forma e la scarsità per adattarli al meglio alle immagini. Per visualizzare le aree segmentate delle metastasi tumorali e del tessuto polmonare normale, utilizzando etichette colorate diverse per ogni tipo di tessuto, aprire il programma Decision Forest e seguire la serie di domande sì o no per addestrare in modo appropriato ogni classe per un'immagine.Per regolare le funzionalità per ogni classe, applica filtri per rendere più nitida, sfocare o ordinare per forma per migliorare la precisione dell'algoritmo. In questa analisi, le metastasi tumorali appaiono in blu. Il tessuto normale è verde e l'epitelio bronchiolare è giallo.I globuli rossi possono essere osservati in rosso e gli spazi aerei appaiono in rosa. Quando tutte le funzioni sono state impostate, salvare le impostazioni modificate e applicare l'algoritmo all'intero set o serie di tessuti colorati H&E. Quindi esportare tutte le variabili di output per consentire la quantificazione dell'area in micron al quadrato per ciascun tipo di tessuto e per consentire il calcolo delle percentuali dall'area totale del tessuto netto del campione.La presenza di un segnale di bioluminescenza all'interno dello spazio toracico meno di due ore dopo l'iniezione della vena di coda di cellule di carcinoma mammario epiteliale umano marcate con luciferasi può essere considerata la conferma di un'iniezione accurata. In questo esperimento, il numero di fotoni nella regione toracica è aumentato nel tempo e un forte segnale di bioluminescenza era ancora presente al giorno 24 dopo l'iniezione. Al momento dell'autopsia, in questi topi sono state osservate molte lesioni polmonari macroscopiche.Utilizzando un software di analisi delle immagini e un algoritmo personalizzato, come dimostrato, l'intero tessuto polmonare può essere segmentato in base a diverse caratteristiche del tessuto. Segmentando il tessuto polmonare in questo modo, il software può quantificare vari parametri. Qui vengono mostrati i dati grezzi di un'analisi eseguita su tessuto polmonare di topi iniettati con cellule di carcinoma mammario epiteliale umano seguita da un trattamento con un farmaco progettato per bloccare la colonizzazione metastatica.Come dimostrato da queste immagini, una differenza nel carico tumorale metastatico tra questi gruppi di trattamento potrebbe essere stata facilmente trascurata, poiché il numero totale di noduli polmonari non è diverso. Un'analisi completa di tutti i parametri, tuttavia, ha indicato una differenza significativa nell'area percentuale netta di metastasi polmonari, sottolineando la necessità di un approccio approfondito all'analisi del carico tumorale polmonare metastatico. Una corretta risospensione cellulare senza bolle d'aria è fondamentale per prevenire le embolie polmonari e un gonfiaggio polmonare efficace aiuta a mantenere l'integrità della struttura del tessuto per un'accurata analisi dell'immagine. L'immunocolorazione del tessuto polmonare può essere eseguita per determinare la presenza di cellule o proteine di interesse all'interno delle lesioni polmonari o del microambiente polmonare.

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In questo articolo vengono descritte le procedure di un test metastasi sperimentale che viene utilizzato per determinare il potenziale metastatico di linee cellulari tumorali umane.

Metastasi di analisi sperimentale

Questo video descrive una tecnica di iniezione di cellule tumorali marcate utilizzando l'iniezione della vena caudale in un modello murino. Monitoriamo ulteriormente la formazione e la crescita delle metastasi del cancro al seno utilizzando l'imaging in vivo di animali vivi in tempo reale.

Iniezione della vena caudale: un metodo per somministrare cellule tumorali per studi metastatici in un modello murino

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Modello murino sperimentale di melanoma metastatico: una piattaforma per studiare il potenziale metastatico delle cellule di melanoma nei polmoni

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Le metastasi svolgono un ruolo profondo nella virulenza del cancro, rappresentando circa il 90% dei decessi.  Riportiamo un protocollo per un modello di melanoma metastatico nel topo che è utile per determinare l'efficacia degli agenti terapeutici contro questo fenomeno clinico.

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È stata sviluppata una procedura chirurgica per fornire cellule tumorali mammarie al fegato murino tramite iniezione nella vena porta. Questo modello consente di studiare le fasi avanzate delle metastasi epatiche in un ospite completamente immune competente, tra cui lo stravaso delle cellule tumorali, la semina, la sopravvivenza e la crescita metastatica nel fegato.

Un modello di iniezione vena porta del fegato per studiare metastasi del cancro al seno

L'obiettivo di questo articolo è di fornire una descrizione dettagliata del protocollo per il dosaggio di metastasi polmonare (PuMA). Questo modello permette ai ricercatori di studiare la crescita delle cellule di osteosarcoma metastatico (OS) nel tessuto del polmone usando un widefield fluorescenza o il microscopio confocale a scansione laser.

Considerazioni pratiche nello studio di colonizzazione del polmone metastatico nell'Osteosarcoma usando l'analisi di metastasi polmonare

Un modello animale è necessario per decifrare il ruolo di fare circolare le cellule del tumore (CTCs) nel promuovere la colonizzazione del polmone durante la metastasi del cancro. Qui, abbiamo stabilito ed effettuato con successo un in vivo analisi specificamente prova il requisito dell'Assemblea polimerici fibronectina (polyFN) su CTCs per colonizzazione del polmone.

L'istituzione di un'analisi di colonizzazione del polmone per la visualizzazione di cellule del tumore nei tessuti polmonari di circolazione

L'approccio descritto combina saggi sperimentali di metastasi della vena della coda con immagini animali vive in vivo per consentire il monitoraggio in tempo reale della formazione e della crescita della metastasi del cancro al seno, oltre alla quantificazione del numero e delle dimensioni delle metastasi nei polmoni.

Uso combinato dei saggi di metastasi della vena della coda e dell'imaging in vivo in tempo reale per quantificare la colonizzazione metastatica del cancro al seno e il carico nei polmoni

Descriviamo un modello murino di xenotrapianto di metastasi cerebrali di cancro al seno generate tramite iniezione di vena della coda di una linea cellulare di carcinoma mammario infiammatorio amplificata endogenamente da HER2.

Modellazione delle metastasi cerebrali tramite iniezione di vena della coda di cellule infiammatorie del cancro al seno

Il manoscritto descrive una metodologia per l'instaurazione e il monitoraggio longitudinale della crescita delle metastasi polmonari spontanee da tumori mammari iniettati ortotopicamente, suscettibili di intervento in tutte le fasi della cascata metastatica.

In vivo Imaging per misurare le metastasi polmonari spontanee di cellule tumorali mammarie iniettate ortotopicamente

Scopri un metodo di analisi digitale per quantificare le metastasi polmonari dopo iniezione nella vena della coda in modelli murini. Questa tecnica offre misurazioni accurate e riproducibili del carico tumorale.

Analisi patologica delle metastasi polmonari a seguito di iniezione laterale della vena della coda di cellule tumorali

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