Analisi patologica delle metastasi polmonari a seguito di iniezione laterale della vena della coda di cellule tumorali

Attualmente non esiste un gold standard per l'analisi dei carichi di tumori polmonari metastatici indotti dall'iniezione della vena coda. Abbiamo utilizzato l'analisi digitale delle immagini per quantificare in modo accurato e riproducibile le metastasi polmonari in modo altamente efficiente. Questo metodo è efficiente in termini di tempo e costi.

E, se abbinato all'analisi digitale delle immagini, consente un'analisi estremamente accurata e completa del carico tumorale metastatico polmonare risultante. Per preparare le cellule di carcinoma mammario umano per l'iniezione, in primo luogo, posizionare un numero appropriato di cellule in un terreno di coltura cellulare adatto, in base al numero di topi e alla concentrazione di cellule da utilizzare. Quando le cellule raggiungono una confluenza dell'80-90%, lavare le piastre con PBS e staccare le cellule in un volume minimo di tripsina, secondo i protocolli standard.

Quando le cellule si sono staccate, sospenderle nuovamente in un terreno di coltura fresco per il conteggio e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Quindi, risospendere le cellule alla concentrazione appropriata in 100 microlitri di PBS per topo, su ghiaccio. Poco prima dell'iniezione, risospendere accuratamente le cellule sul ghiaccio per evitare la formazione di grumi e caricare 100 microlitri di cellule in una siringa da insulina calibro 28.

Mantenendo la siringa in posizione verticale, picchiettare lo stelo mentre si regola lentamente lo stantuffo per rimuovere eventuali bolle. Se consentito, richiudere con cura l'ago e piegare la punta dell'ago a un angolo di 20-30 gradi. Trattiene una femmina di topo di più di sei settimane in un sistema di ritenuta per topi di plastica e posiziona il topo su un lato in modo che la sua vena caudale laterale sia facilmente visibile.

Localizzare l'arteria ventrale in linea con i genitali, una vena dorsale e due vene caudali laterali e utilizzare una salvietta asettica per pulire la superficie della coda. Afferrando la coda tra l'indice e il pollice della mano non dominante, applicare una leggera tensione e, iniziando dalla parte distale della coda, inserire l'ago, con il lato smussato rivolto verso l'alto, parallelo alla vena. Erogare lentamente l'intero volume di cellule nella vena.

Un piccolo volume di sangue verrà probabilmente spostato dopo l'iniezione. Applicare una leggera pressione con una garza sterile sul sito di iniezione. Quindi gettare la siringa in un contenitore per oggetti taglienti appropriato e posizionare il topo in una gabbia pulita e ventilata con monitoraggio.

Entro non più di un'ora dall'iniezione della vena caudale, eseguire l'imaging in vivo su animali vivi per confermare il successo dell'iniezione cellulare e ottenere dati sul tempo zero. Per mantenere il formato strutturale dei polmoni per l'istopatologia, fissare il topo a una tavola da dissezione e bagnare la pelliccia con etanolo al 70%. Aprire il torace con un'incisione sulla linea mediana, estendendo l'incisione cranialmente e caudalmente attraverso il peritoneo, e afferrare il processo xifoideo per consentire la rimozione del diaframma.

Usando un secondo paio di forbici, taglia le costole lungo ciascun lato dello sterno e rimuovi con cura la gabbia toracica per lasciare spazio ai polmoni per espandersi. Per isolare la trachea, rimuovere le ghiandole salivari sottomandibolari e la muscolatura infraioidea e posizionare dei perni su entrambi i lati della trachea per evitare movimenti indesiderati durante l'inserimento dell'ago. Caricare una siringa da tre millilitri, dotata di un ago calibro 26, con due o tre millilitri di Formelina tamponata neutra al 10%, e inserire l'ago nella trachea.

Iniettare lentamente la formelina, osservando l'espansione dei polmoni. Una volta che la formlina inizia a fuoriuscire dai polmoni, usa una pinza per pizzicare la trachea e rimuovere l'ago. Quindi staccare l'intero apparato respiratorio e posizionare gli organi direttamente in un contenitore di Formelina fresca.

Per l'analisi del carico tumorale polmonare metastatico, eseguire la scansione di sezioni di tessuto polmonare colorate con H&E su uno scanner per vetrini ad alta risoluzione con un ingrandimento di 40 volte e importare le immagini in un programma software di analisi delle immagini appropriato. Regola i parametri che definiscono la forma e la scarsità per adattarli al meglio alle immagini. Per visualizzare le aree segmentate delle metastasi tumorali e del tessuto polmonare normale, utilizzando etichette colorate diverse per ogni tipo di tessuto, aprire il programma Decision Forest e seguire la serie di domande sì o no per addestrare in modo appropriato ogni classe per un'immagine.

Per regolare le funzionalità per ogni classe, applica filtri per rendere più nitida, sfocare o ordinare per forma per migliorare la precisione dell'algoritmo. In questa analisi, le metastasi tumorali appaiono in blu. Il tessuto normale è verde e l'epitelio bronchiolare è giallo.

I globuli rossi possono essere osservati in rosso e gli spazi aerei appaiono in rosa. Quando tutte le funzioni sono state impostate, salvare le impostazioni modificate e applicare l'algoritmo all'intero set o serie di tessuti colorati H&E. Quindi esportare tutte le variabili di output per consentire la quantificazione dell'area in micron al quadrato per ciascun tipo di tessuto e per consentire il calcolo delle percentuali dall'area totale del tessuto netto del campione.

La presenza di un segnale di bioluminescenza all'interno dello spazio toracico meno di due ore dopo l'iniezione della vena di coda di cellule di carcinoma mammario epiteliale umano marcate con luciferasi può essere considerata la conferma di un'iniezione accurata. In questo esperimento, il numero di fotoni nella regione toracica è aumentato nel tempo e un forte segnale di bioluminescenza era ancora presente al giorno 24 dopo l'iniezione. Al momento dell'autopsia, in questi topi sono state osservate molte lesioni polmonari macroscopiche.

Utilizzando un software di analisi delle immagini e un algoritmo personalizzato, come dimostrato, l'intero tessuto polmonare può essere segmentato in base a diverse caratteristiche del tessuto. Segmentando il tessuto polmonare in questo modo, il software può quantificare vari parametri. Qui vengono mostrati i dati grezzi di un'analisi eseguita su tessuto polmonare di topi iniettati con cellule di carcinoma mammario epiteliale umano seguita da un trattamento con un farmaco progettato per bloccare la colonizzazione metastatica.

Come dimostrato da queste immagini, una differenza nel carico tumorale metastatico tra questi gruppi di trattamento potrebbe essere stata facilmente trascurata, poiché il numero totale di noduli polmonari non è diverso. Un'analisi completa di tutti i parametri, tuttavia, ha indicato una differenza significativa nell'area percentuale netta di metastasi polmonari, sottolineando la necessità di un approccio approfondito all'analisi del carico tumorale polmonare metastatico. Una corretta risospensione cellulare senza bolle d'aria è fondamentale per prevenire le embolie polmonari e un gonfiaggio polmonare efficace aiuta a mantenere l'integrità della struttura del tessuto per un'accurata analisi dell'immagine. L'immunocolorazione del tessuto polmonare può essere eseguita per determinare la presenza di cellule o proteine di interesse all'interno delle lesioni polmonari o del microambiente polmonare.