Name: dissezione, immunoistochimica e montaggio di cervelli larvali e adulti di Drosophila per la visualizzazione del lobo ottico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Impara a dissezionare, immunostainare e montare cervelli larvali e adulti di Drosophila per visualizzare i lobi ottici con diverse orientazioni. Questo protocollo migliora la chiarezza dell'imaging in neuroscienza.

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Vorremmo ringraziare Claude Desplan per aver condiviso con noi un'aliquota dell'anticorpo Bsh. Gli anticorpi monoclonali DE-Caderina, Bassotto, Occhi Assenti, Seven-up e Bruchpilot sono stati ottenuti dalla Developmental Studies Hybridoma Bank, creata dal NICHD del NIH e mantenuta presso l'Università dell'Iowa, Dipartimento di Biologia, Iowa City, IA 52242. Questo lavoro è stato sostenuto da un NSERC Discovery Grant assegnato a T.E.. U.A. è supportata da una borsa di studio per laureati NSERC Alexander Graham Bell Canada. P.V. è supportato da una borsa di studio per laureati dell'Ontario.

<ol><li>Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+optic+lobe+of+Drosophila+melanogaster.+I.+A+Golgi+analysis+of+wild-type+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure.</a> Cell Tissue Research. 258, (1989).</li>
<li>Hofbauer, A., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+pattern+and+early+differentiation+of+the+optic+lobes+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Roux%27s+Archives+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Proliferation pattern and early differentiation of the optic lobes in Drosophila melanogaster.</a> Roux's Archives of Developmental Biology. 198, 264-274 (1990).</li>
<li>Sanes, J. R., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+Principles+of+Insect+and+Vertebrate+Visual+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Design Principles of Insect and Vertebrate Visual Systems.</a> Neuron. 66, 15-36 (2010).</li>
<li>Nériec, N., Desplan, C. From the Eye to the Brain. Development of the Drosophila Visual System. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aN%C3%A9riec%2C+N+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22">Current Topics in Developmental Biology</a>. 116, Academic Press Inc. 247-271 (2016).</li>
<li>Apitz, H., Salecker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Challenge+of+Numbers+and+Diversity%3A+Neurogenesis+in+the+Drosophila+Optic+Lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A Challenge of Numbers and Diversity: Neurogenesis in the Drosophila Optic Lobe.</a> Journal of Neurogenetics. 28, 233-249 (2014).</li>
<li>Contreras, E. G., Sierralta, J., Oliva, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+strategies+for+the+generation+of+neuronal+diversity%3A+Lessons+from+the+fly+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Novel strategies for the generation of neuronal diversity: Lessons from the fly visual system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 140(2019).</li>
<li>Erclik, T., Hartenstein, V., Lipshitz, H. D., McInnes, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+Role+of+the+Vsx+Genes+Supports+a+Monophyletic+Origin+for+Bilaterian+Visual+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Conserved Role of the Vsx Genes Supports a Monophyletic Origin for Bilaterian Visual Systems.</a> Current Biology. 18, 1278-1287 (2008).</li>
<li>Erclik, T., Hartenstein, V., McInnes, R. R., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+evolution+at+high+resolution%3A+The+neuron+as+a+unit+of+homology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Eye evolution at high resolution: The neuron as a unit of homology.</a> Developmental Biology. 332, 70-79 (2009).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+projection+neurons+in+the+Drosophila+lobula+link+feature+detection+to+distinct+behavioral+programs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Visual projection neurons in the Drosophila lobula link feature detection to distinct behavioral programs.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Ngo, K. T., Andrade, I., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+pattern+of+neuronal+differentiation+in+the+Drosophila+visual+system%3A+A+user%27s+guide+to+the+dynamic+morphology+of+the+developing+optic+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal pattern of neuronal differentiation in the Drosophila visual system: A user's guide to the dynamic morphology of the developing optic lobe.</a> Developmental Biology. 428, 1-24 (2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+patterning+of+Drosophila+medulla+neuroblasts+controls+neural+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Temporal patterning of Drosophila medulla neuroblasts controls neural fates.</a> Nature. 498, 456-462 (2013).</li>
<li>Erclik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+temporal+and+spatial+patterning+generates+neural+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integration of temporal and spatial patterning generates neural diversity.</a> Nature. 541, 365-370 (2017).</li>
<li>Apitz, H., Salecker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+region-specific+neurogenesis+mode+requires+migratory+progenitors+in+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A region-specific neurogenesis mode requires migratory progenitors in the Drosophila visual system.</a> Nature Neuroscience. 18, 46-55 (2015).</li>
<li>Suzuki, T., Kaido, M., Takayama, R., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+temporal+mechanism+that+produces+neuronal+diversity+in+the+Drosophila+visual+center%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A temporal mechanism that produces neuronal diversity in the Drosophila visual center.</a> Developmental Biology. 380, 12-24 (2013).</li>
<li>Hara, Y., Sudo, T., Togane, Y., Akagawa, H., Tsujimura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+neural+precursor+cells+and+neurons+before+neurite+formation+prevents+the+emergence+of+abnormal+neural+structures+in+the+Drosophila+optic+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell death in neural precursor cells and neurons before neurite formation prevents the emergence of abnormal neural structures in the Drosophila optic lobe.</a> Developmental Biology. 436, 28-41 (2018).</li>
<li>Morante, J., Erclik, T., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+in+Drosophila+optic+lobe+neurons+is+controlled+by+eyeless%2FPax6%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell migration in Drosophila optic lobe neurons is controlled by eyeless/Pax6.</a> Development. 138, 687-693 (2011).</li>
<li>Millard, S. S., Pecot, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+assembling+columns+and+layers+in+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Strategies for assembling columns and layers in the Drosophila visual system.</a> Neural Development. 13, 1-17 (2018).</li>
<li>Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+circuits+of+the+Drosophila+optic+lobe%3A+The+input+terminals+to+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: The input terminals to the medulla.</a> Journal of Comparative Neurology. 509, 493-513 (2008).</li>
<li>Akin, O., Bajar, B. T., Keles, M. F., Frye, M. A., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-Specific+Patterned+Stimulus-Independent+Neuronal+Activity+in+the+Drosophila+Visual+System+during+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-type-Specific Patterned Stimulus-Independent Neuronal Activity in the Drosophila Visual System during Synapse Formation.</a> Neuron. 101, 894-904 (2019).</li>
<li>Spratford, C. M., Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+immunostaining+of+imaginal+discs+from+drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51792(2014).</li>
<li>Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atonal%2C+rough+and+the+resoluton+of+proneural+clusters+in+the+developing+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Atonal, rough and the resoluton of proneural clusters in the developing Drosophila retina.</a> Development. 122, Cambridge, England. 4139-4147 (1996).</li>
<li>Hsiao, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+immunohistochemistry+of+larval%2C+pupal+and+adult+Drosophila+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas.</a> Journal of visualized experiments. , e4347(2012).</li>
<li>Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+immunofluorescent+staining+of+mushroom+body+and+photoreceptor+neurons+in+adult+Drosophila+melanogaster+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult Drosophila melanogaster brains.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56174(2017).</li>
<li>Williamson, R. W., Hiesinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. , e1936(2010).</li>
<li>Bertet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+patterning+of+neuroblasts+controls+notch-mediated+cell+survival+through+regulation+of+hid+or+reaper%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal patterning of neuroblasts controls notch-mediated cell survival through regulation of hid or reaper.</a> Cell. 158, 1173-1186 (2014).</li>
<li>Pinto-Teixeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Concurrent+Retinotopic+Maps+in+the+Fly+Motion+Detection+Circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development of Concurrent Retinotopic Maps in the Fly Motion Detection Circuit.</a> Cell. 173, 485-498 (2018).</li>
<li>Plevock, D. A., Rusan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51756(2014).</li>
<li>Ting, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+dendritic+morphology+in+columns+and+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analyzing dendritic morphology in columns and layers.</a> Journal of Visualized Experiments. , e55410(2017).</li>
<li>Özel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> eLife. 4, (2015).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

In questo protocollo, descriviamo un metodo per immunocolorare il cervello larvale e adulto di Drosophila e montarlo in diversi orientamenti. Mentre i metodi per colorare il cervello larvale e adulto sono stati precedentemente descritti 22,23,24,27,28, le strategie di montaggio per la visualizzazione ottimale di specifiche strutture del lobo ottico hanno ricevuto meno attenzione <...

Il sistema visivo di Drosophila, composto dall'occhio composto e dal lobo ottico sottostante, è stato un modello eccellente per lo studio dello sviluppo e della funzione dei circuiti neurali. Negli ultimi anni, il lobo ottico, in particolare, è emerso come un potente sistema in cui studiare i processi di sviluppo neurologico come la neurogenesi e il cablaggio dei circuiti 1,2,3,4,5,6,7,8. È costituito da quattro neuropili: la lamina, il midollo, la lobula e la placca lobula (le ultime due comprendono il complesso della lobula)1,2,3,4,5,6. I fotorecettori dell'occhio, colpiscono i neuroni della lamina e del midollo, che elaborano gli input visivi e li trasmettono ai neuropili del complesso lobula 1,2,3,4,5,6. I neuroni di proiezione nel complesso lobula inviano successivamente informazioni visive ai centri di elaborazione di ordine superiore nel cervello centrale 1,5,9. La complessa organizzazione del lobo ottico, resa necessaria dalla necessità di mantenere la retinotopia e di elaborare diversi tipi di stimoli visivi, lo rende un sistema attraente per lo studio di come vengono assemblati sofisticati circuiti neurali. In particolare, il midollo condivide sorprendenti somiglianze sia nella sua organizzazione che nel suo sviluppo con la neuroretina, che è stata a lungo un modello per lo sviluppo del circuito neurale dei vertebrati 3,8.
Lo sviluppo del lobo ottico inizia durante l'embriogenesi, con la specificazione di ~35 cellule ectodermiche che formano il placode ottico 2,4,5,6,7,8. Dopo la schiusa larvale, il placode ottico è suddiviso in due primordi distinti: 1) il centro di proliferazione esterno (OPC), che genera i neuroni della lamina e del midollo esterno e 2) il centro di proliferazione interno (IPC), che genera i neuroni del midollo interno e del complesso lobula 4,5,6,10 . Nella larva del secondo stadio tardivo, le cellule neuroepiteliali dell'OPC e dell'IPC iniziano a trasformarsi in neuroblasti che successivamente generano neuroni attraverso cellule madri gangliari intermedie 4,5,11,12. I neuroblasti del lobo ottico sono modellati da fattori di trascrizione spazialmente e temporalmente limitati, che agiscono insieme per generare diversità neurale nella loro progenie 11,12,13,14. Nella pupa, i circuiti dei neuropili del lobo ottico sono assemblati attraverso il coordinamento di diversi processi, tra cui la morte cellulare programmata11,15, la migrazione neuronale12,16, il targeting assonale/dendritico10,17, la formazione delle sinapsi18,19 e le rotazioni dei neuropili10,17.
Qui, descriviamo la metodologia con cui i cervelli larvali e adulti vengono sezionati, immunocolorati e montati per l'imaging del lobo ottico. Data la sua complessa organizzazione tridimensionale, l'analisi del lobo ottico richiede di capire come i suoi neuropili adulti e i progenitori larvali sono posizionati l'uno rispetto all'altro e al cervello centrale. Pertanto, abbiamo posto particolare enfasi su come l'orientamento della montatura si relaziona all'organizzazione spaziale delle strutture dei lobi ottici. Descriviamo tre strategie di montaggio per i cervelli larvali (anteriore, posteriore e laterale) e tre per i cervelli adulti (anteriore, posteriore e orizzontale), ognuna delle quali fornisce un angolo ottimale per l'imaging di una specifica popolazione progenitrice del lobo ottico o neuropil.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>Bioshop</td><td>PBS405</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldeide</td><td>Bioshop</td><td>FOR201</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (capra) secondario</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td>utilizzo a 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 (mouse) secondario</td><td>Invitrogen</td><td>A-31570</td><td>utilizzo a 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (cavia) secondario</td><td>Invitrogen</td><td>A-21450</td><td>utilizzo a 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (ratto) secondario</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td>uso a 1:500</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td></td></tr><tr><td>Pinze da dissezione - #5</td><td>Dumont</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinze da dissezione - #55</td><td>Dumont</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di dissezione</td><td>Corning</td><td>722085</td><td></td></tr><tr><td>Salviette asciutte</td><td>Kimbery Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo primario anti-Bgal di capra</td><td>Uso</td><td></td> della biogenesi <td>a 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo primario anti-Bsh di porcellino d'india</td><td>Dono di Claude Desplan</td><td></td><td>uso a 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo primario anti-Vsx1 di porcellino d'india</td><td>Erclik et al. 2008</td><td></td><td>uso a 1:1000</td></tr><tr><td>Pellicola di laboratorio</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Provette</td> <td>per microcentrifugaSarstedt</td><td>72.706.600</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>VWR</td><td>CA4823-180</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo primario anti-dac di topo</td><td>Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi (DSHB)</td><td>mabdac2-3</td><td>uso a 1:20</td></tr><tr><td>Anticorpo primario anti-eya di topo</td><td>DSHB</td><td>eya10H6</td><td>uso a 1:20</td></tr><tr><td>Anticorpo primario anti-nc82 di topo</td><td>DSHB</td><td>nc82</td><td>uso a 1:50</td></tr><tr><td>Topo anti-svp anticorpo primario</td><td>DSHB</td><td>Seven-up 2D3</td><td>uso a 1:100</td></tr><tr><td>Polymer Clay</td><td>Può essere utilizzato</td><td></td><td></td>Qualsiasi tipo di argilla</tr><tr><td>Coniglio anti-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A-11122</td><td>uso a 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo primario anti-DE-Caderina di ratto</td><td>DSHB</td><td>DCAD2</td><td>uso a 1:20</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio a dissolvenza lenta</td><td>Invitrogen</td><td>S36967</td><td>Il mezzo di montaggio Vectashield ( cat# H-1000) può essere utilizzato anche</td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td><td></td></tr></tbody></table>

dissezione, immunoistochimica e montaggio di cervelli larvali e adulti di drosophila per la visualizzazione del lobo ottico

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

Il lobo ottico di Drosophila , composto da quattro neuropili: la lamina, il midollo, la lobula e la placca della lobula, è un eccellente sistema modello per esplorare i meccanismi di sviluppo che generano la diversità neurale e l'assemblaggio dei circuiti di azionamento. Data la sua complessa organizzazione tridimensionale, l'analisi del lobo ottico richiede di capire come i suoi neuropili adulti e i progenitori larvali sono posizionati l'uno rispetto all'altro e al cervello centrale. Qui, descriviamo un protocollo per la dissezione, l'immunocolorazione e il montaggio di cervelli larvali e adulti per l'imaging del lobo ottico. Particolare enfasi è posta sulla relazione tra l'orientamento del montaggio e l'organizzazione spaziale del lobo ottico. Descriviamo tre strategie di montaggio nella larva (anteriore, posteriore e laterale) e tre nell'adulto (anteriore, posteriore e orizzontale), ognuna delle quali fornisce un angolo di imaging ideale per una struttura distinta del lobo ottico.

Le immagini confocali dei lobi ottici larvali e adulti montati negli orientamenti descritti nel protocollo sono presentate nella Figura 1 e nella Figura 2.
La Figura 1 mostra gli schemi e le fette confocali rappresentative di cervelli larvali posizionate negli orientamenti anteriore, posteriore e laterale. Nell'orientamento di montaggio anteriore, l'epitelio OPC (DE-caderina), i neuroblasti del midollo (<...

Questo protocollo descrive tre fasi per preparare i lobi ottici larvali e adulti di Drosophila per l'imaging: 1) dissezioni cerebrali, 2) immunoistochimica e 3) montaggio. L'accento è posto sul passaggio 3, poiché sono necessari orientamenti di montaggio distinti per visualizzare specifiche strutture del lobo ottico.

dissezione, immunoistochimica e montaggio di cervelli larvali e adulti di Drosophila per la visualizzazione del lobo ottico

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

Descriviamo un protocollo per sezionare, immunocolorare e montare cervelli larvali e adulti di Drosophila con particolare enfasi sui lobi ottici. Data la complessa organizzazione tridimensionale del lobo ottico, si prevede che il protocollo qui descritto fornirà ai ricercatori una maggiore comprensione della relazione tra l'orientamento di montaggio e le strutture del lobo ottico visualizzate. Questo protocollo descrive tre strategie di montaggio sia per i lobi ottici larvali che per quelli adulti, ognuna delle quali fornisce un angolo ottimale per visualizzare una specifica struttura del lobo ottico durante l'imaging.Prima di iniziare la dissezione, riempire tutti i pozzetti di una piastra a tre pozzetti con 400 microlitri di PBS per pozzetto e utilizzare una pinza per selezionare delicatamente 15 larve vaganti di terzo stadio che strisciano all'interno di una fiala o di una bottiglia di Drosophila. Metti tutte le larve nel primo pozzetto della piastra a tre pozzetti e trasferisci una larva nel pozzetto centrale della piastra. Usando la mano non dominante, trattenere il corpo della larva alla base del pozzo e usare la mano dominante per afferrare delicatamente l'uncino della bocca

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Biologia dello sviluppo

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Dissezione e immunoistochimica di larvale, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retine

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Montaggio di cervelli di Drosophila adulta: un metodo per preparare vetrini per l'imaging confocale

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Dettagli Questo protocollo un metodo semplificato utilizzato per condurre cellule vive nel contesto di un cervello larvale intatto. Approcci di imaging cellulare dal vivo hanno un valore inestimabile per lo studio delle divisioni asimmetriche di cellule staminali neurali così come altri processi neurogena e di sviluppo, in coerenza scoprendo i meccanismi che sono stati precedentemente trascurato.

Immagini dal vivo di<em&gt; Drosophila</em&gt; larvali neuroblasti

Le strutture adulte di Drosophila derivano da strutture simili a sacche chiamate dischi immaginali. L'analisi di questi dischi fornisce informazioni su molti processi di sviluppo, tra cui la determinazione dei tessuti, la definizione dei confini compartimentali, la proliferazione cellulare, la specificazione del destino cellulare e la polarità cellulare planare. Questo protocollo viene utilizzato per preparare i dischi immaginali per la microscopia ottica/fluorescente.

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Criosezione diretta delle teste di Drosophila per una migliore colorazione a fluorescenza cerebrale e immunocolorazione

Impara a dissezionare, immunostainare e montare cervelli larvali e adulti di Drosophila per visualizzare i lobi ottici con diverse orientazioni. Questo protocollo migliora la chiarezza dell'imaging in neuroscienza.

dissezione, immunoistochimica e montaggio di cervelli larvali e adulti di Drosophila per la visualizzazione del lobo ottico

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