Name: Applicazione di terapia del fago per contrastare linfezione da Pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish della fibrosi cistica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Scopri la terapia del fago contro Pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish per la fibrosi cistica. Questo metodo permette di valutare l'efficacia in vivo del cocktail virale contro l'infezione batterica.

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Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione Italiana Fibrosi Cistica (FFC#22/2017; Associazione "Gli amici della Ritty" Casnigo e FFC#23/2019; Un respiro in più Onlus La Mano tesa Onlus).

I pesci zebra adulti (Danio rerio) del ceppo AB (European Zebrafish Resource Center EZRC) sono mantenuti secondo le linee guida internazionali (Direttiva UE 2010/63/UE) e nazionali (decreto italiano 4marzo 2014, n. 26) sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici. Le condizioni standard sono fissate nell'impianto ittico con un ciclo di buio di 14 ore /10 h e una temperatura dell'acqua del serbatoio a 28 °C.
1. Preparazione di soluzioni e strumenti
<ol><li>Preparare una soluzione stock 50x e 1x soluzioni di lavoro per il mezzo embrionale E3 per la coltivazione di embrioni di zebrafish (vedi tabella 1).</li>
	<li>Fare la soluzione di blocco della pigmentazione, per bloccare la pigmentazione dell'embrione da 24 ore dopo la fecondazione (24 hpf) (vedi tabella 1).</li>
	<li>Preparare 25 volte stock e 1 soluzione anestetica Tricane funzionante come descritto nella tabella 1. NOTA: Per evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuti della soluzione che potrebbero danneggiare la soluzione di stoccaggio, effettuare aliquote di 2 mL di 25x tricaina e conservarle a -20 °C.</li>
	<li>Preparare tracce per la microiniezione embrionale sciogliendo 1 g di agarosio in 100 ml di H2O distillato in un pallone o in una bottiglia microwavable. Microonde per 1-3 minuti fino a quando l'agarosio non è completamente sciolto.</li>
	<li>Posizionare gli stampi di microiniezione zebrafish (vedi Tabella dei materiali)capovolti in una piastra di Petri (90 mm x 15 mm) e coprire l'intera superficie versando il gel di agarosio liquido con una larghezza di circa 10 mm.</li>
	<li>Rimuovere lo stampo una volta che l'agarosio si è solidificato. Riempire la piastra di Petri con 1x mezzo embrione E3. Questo può essere conservato a 4 °C per circa una settimana. Prima dell'uso, sostituire con il mezzo fresco E3 contenente Tricaine. NOTA: Gli stampi più vecchi potrebbero sviluppare funghi o contaminazioni batteriche.</li>
	<li>Utilizzare capillari borosilicati di 10 cm lucidati dal fuoco per preparare gli aghi per la microiniezione e fissarli all'estrattore di micropipette stringendo le maniglie. Impostare l'estrattore con le seguenti impostazioni: calore 500, velocità 100, tempo 150, tirare 150.</li>
</ol>2. P. aeruginosa (PAO1) preparazione dell'inoculo
<ol><li>Inoculare 1 colonia di GFP+P. aeruginosa ceppo PAO119 in 5 mL di brodo LB (vedi tabella 1) e crescere durante la notte a 37 °C con scuotimento (200 giri/min).</li>
	<li>Diluire la coltura notturna di cui sopra in OD600 = 0,1 in 10 mL di brodo LB e crescere fino a600 OD = 0,5 a 37 °C con scuotimento (200 giri/min).</li>
	<li>Centrifugare 2 mL della coltura per 2 min a 4 °C a 16.100 x g e resuspendare il pellet cellulare a OD600 = 1, equivalente a circa 1 x 109 cfu/mL, in 1 mL della soluzione fisiologica (cfr. tabella 1).</li>
	<li>Diluire la sospensione cellulare a circa 5 x 10 7 cfu/mL insoluzionefisiologica e conservare a 4 °C.</li>
</ol>3. Preparazione stock di fago
<ol><li>Inoculare 1 colonia di P. aeruginosa ceppo PAO1 in 5 mL di brodo LB e incubare durante la notte a 37 °C con scuotimento. Diluire la coltura notturna in OD600 = 0,01 in 500 mL di brodo LB e crescere a 37 °C con scuotimento a OD600 = 0,05, equivalente a circa 2,5 x 107 cfu/mL.</li>
	<li>Alla coltura diluita di P. aeruginosa, aggiungere circa 1,25 x 107 fagi, per ottenere la molteplicità di infezione (M.O.I.) di 10-3. Incubare a 37 °C con agitazione fino a quando l'OD600 scende a circa 0,1-0,3 (in circa 3-5 ore, a seconda del fago utilizzato). NOTA: Per questo esperimento sono stati selezionati quattro fagi che infettano la tensione PAO1: due Podoviridae, i numeri di adesione genbank vB_PaeP_PYO2, MF490236 e vB_PaeP_DEV, MF490238 e due Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241 e vB_PaeM_E217, MF490240. Eseguire i passaggi seguenti per ogni fago singolarmente.</li>
	<li>Incubare il lisato con 1 mg/mL di DNasi e RNasi per 30 min a 37 °C. Centrifuga a 5.000 x g per 30 min a 4 °C e recupera con cura il supernatante (SN). Filtrare l'SN con un filtro con un diametro dei pori di 0,8 μm.</li>
	<li>All'SN aggiungere 58 g/L di NaCl e 105 g/L di PEG6000. Sciogliere con agitazione a RT 20 min e quindi tenerlo durante la notte a 4 °C. Centrifuga a 20.000 x g per 30 min a 4 °C per la precipitazione del fago. Rimuovere l'SN e sciogliere accuratamente il pellet di fago in 15 mL di tampone TN (vedere tabella 1).</li>
	<li>Purificare i fagi con gradiente di densità CsCl come descritto nei passaggi seguenti.<ol>
<li>In un tubi ad ultracentrifugo poliallomero per rotore SW41, preparare un gradiente di densità del passo CsCl stratificando 2 ml delle quattro soluzioni CsCl descritte nella tabella 1.  Aggiungere 3,5 ml di sospensione del fago in ciascuno dei 4 tubi. NOTA: CsCl è tossico, adotta procedure di sicurezza adeguate per maneggiarlo e scartarlo.</li>
		<li>Introdurre i tubi nel rotore e assicurarsi che i tubi siano bilanciati (la differenza di peso tra i due tubi rivolti deve essere ≤ 0,01 g).</li>
		<li>Centrifuga per 2 ore a 4 °C e 100.000 x g (25.000 giri/min per rotore SW41). Dopo la centrifugazione, rimuovere lentamente i tubi e immobilizzarli con cura su un supporto. Utilizzando una siringa con ago da 19 G, disegnare la banda bianca/opalescente che di solito si trova tra la regione di d=1,5 e la regione di densità d=1,4.</li>
		<li>Trasferire le sospensioni dalla siringa in nuovi tubi in poliallomero per rotore SW60 e utilizzare la soluzione d=1.4 per bilanciare con precisione i tubi.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione a 4 °C e 150.0000 x g (38.000 giri/min per il rotore SW60) per almeno 16 ore.</li>
		<li>Raccogliere la banda visibile come sopra (vedere il passaggio 3.3.3) e trasferirli in tubi di dialisi con taglio da 6.000 Da. Dializzare la banda visibile ottenuta 2x per 20 min contro 500 mL di acqua e durante la notte contro 500 mL di tampone TN. Filtrare con un filtro poro da 0,22 μm e conservare a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Preparazione cocktail di fago
<ol><li>Fare un mix di quattro fagi che infettano il ceppo PAO1, precedentemente isolato e caratterizzato8. Prima della miscelazione, stimare il titolo di ogni fago per saggio diplacca 20.</li>
	<li>Assemblare il cocktail di fago, con un ttarello complessivo di 5 × 108 pfu/mL, mescolando allo stesso modo quattro preparati di fago allo stesso pfu/mL immediatamente prima di ogni esperimento, per garantire lettori di fago accurati.</li>
</ol>5. Raccolta e preparazione di embrioni di zebrafish per la microiniezione di cftr morpholinos
NOTA: Raccogliere 1-2 embrioni cellulari da zebrafish di tipo selvatico per la microiniezione di cftr morpholinos (cftr-MOs).
<ol><li>Due giorni prima dell'esperimento di microiniezione batterica, impostare coppie riproduttive e raccogliere embrioni come descritto in precedenza21. Il pesce zebra adulto(Danio rerio)del ceppo AB è stato acquistato presso l'European Zebrafish Resource Center, EZRC.</li>
	<li>Il giorno dopo, raccogliere gli embrioni immediatamente dopo la fecondazione con una pipetta di plastica o utilizzando un colino a maglie fini. Posizionare gli embrioni raccolti in una piastra di Petri contenente mezzo embrionale E3 e rimuovere accuratamente i detriti con una pipetta di plastica per evitare contaminazioni che potrebbero danneggiare lo sviluppo dell'embrione.</li>
	<li>Preparare 5 μL di soluzione di iniezione di morfolino diluire le due soluzioni di morpholino stock (1 mM) in acqua sterile ad una concentrazione finale di 0,25 pmol/embrione ATG-MO + 0,25 pmol/embrione splice-MO. Per rintracciare l'iniezione embrionale, aggiungere 0,5 μL di rosso fenolo alla miscela di soluzione di iniezione di morfolino.</li>
	<li>Caricare un ago di microiniezione con circa 5 μL della soluzione di miscela di morfolino utilizzando una micropipetta da 20 μL con una punta di carico del gel fine. Fissare l'ago al micromanipolatore collegato a un supporto e posizionarlo sotto uno stereomicroscopio. NOTA: Non è necessario che la soluzione raggiunga la punta dell'ago poiché la pressione della pompa del microiniettore lo spingerà.</li>
	<li>Ritagliare la punta dell'ago tagliando la punta dell'ago con una pinzetta sterile fine. Misurare il diametro della goccia utilizzando una barra di scala nell'oculare del microscopio. In alternativa, creare una goccia di olio minerale su uno scivolo micrometrico e impostare il volume di microiniezione iniettando la soluzione nella goccia d'olio per valutare la dimensione della goccia. Utilizzare una goccia con un diametro di 156 μm per iniettare un volume di 2 nL.</li>
	<li>Impostare il microiniettore regolando la pressione di compensazione a 15 hPa, il tempo di iniezione a 0,5 s e la pressione di iniezione tra 300 e 600 hPa per ottenere il volume di iniezione corretto a seconda dell'ago utilizzato.</li>
	<li>Con una pipetta di plastica disporre gli embrioni dal passo 5.2 su un vetro posizionato in una piastra di Petri di 96 mm di diametro. NOTA: Troppo mezzo E3 impedirà la corretta penetrazione dell'ago di microiniezione nel corore degli embrioni.</li>
	<li>Penetrare il corore e quindi il tuorlo con l'ago per iniettare 2 nL nell'embrione come descritto inprecedenza 22.</li>
	<li>Mettere gli embrioni iniettati in una piastra di Petri con mezzo E3 e metterli in un'incubatrice a 28 °C per lasciarli sviluppare fino al giorno dopo.</li>
</ol>6. Microiniezione di embrioni di zebrafish con batteri e cocktail di fago
NOTA: Per eseguire un'infezione sistemica, l'embrione deve avere una circolazione sanguigna che di solito inizia dopo 26 HPF.
<ol><li>Dopo 26 hpf (per le fasi di sviluppo del pesce zebra si riferiscono a Kimmel21) gli embrioni di dechorionato con soluzione di pronasi preparati sciogliendo la polvere di pronasi nel mezzo E3 ad una concentrazione di 2 mg/mL. Pipettare delicatamente gli embrioni per rompere il corone. Scartare il mezzo pronasi/E3 e sciacquare il piatto più volte con E3 fresco per rimuovere tutta la pronasi.</li>
	<li>Anestetizzare embrioni di zebrafish in mezzo E3 contenente Tricaina circa 5 minuti prima delle iniezioni.</li>
	<li>Pipettare gli embrioni anesteizzati nella pista preparata al passaggio 1. Utilizzare una punta di caricamento del gel fine per allineare gli embrioni in posizione laterale.</li>
	<li>Caricare un ago di microiniezione con circa 5 μL del preparato P. aeruginosa come descritto nella parte 5.</li>
	<li>Inserire l'ago dorsalmente al punto di partenza del condotto di Cuvier dove inizia a diffondersi sul sacco del tuorlo. Iniettare un volume di 1-3 nL e assicurarsi che il volume si espanda direttamente all'interno del condotto ed entri nella circolazione.</li>
	<li>Circa dopo ogni 50 embrioni iniettati, iniettare una goccia di batteri in un tubo di centrifuga da 1,5 ml con 100 μL di PBS sterile per verificare se il volume di iniezione rimane lo stesso. Placcare l'inoculo sull'agar LB (cfr. tabella 1) a 37 °C durante la notte per valutare la CFU.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni microiniettati in due piastre di Petri pulite con mezzo E3 fresco + PTU e incubarli a 28 °C.</li>
	<li>In due punti di tempo selezionati: 30 min o 3 h dopo l'iniezione batterica, espulsi una delle piastre di Petri con embrioni iniettati battericamente dall'incubatore e allinearli in pista come descritto al punto 6.3 per l'iniezione di cocktail di fago.</li>
	<li>Caricare un ago di microiniezione con circa 5 μL del cocktail di fago (preparato nella fase 4) con una punta di caricamento del gel fine e fissarlo al microiniettore (vedere il passaggio 5).</li>
	<li>Iniettare il cocktail di fago nel condotto di Cuvier degli embrioni precedentemente iniettati con batteri.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni microiniettati in due piastre di Petri pulite con mezzo E3 fresco + PTU e incubarli a 28 °C.</li>
</ol>7. Valutazione del carico batterico degli embrioni iniettati con PAO1 e fagi
<ol><li>A 8 hpi, pipetta 15 embrioni anestetizzati dalla piastra di Petri a un tubo di centrifuga da 1,5 ml.</li>
	<li>Sostituire la soluzione anestetica con 300 μL dell'1% di Tritone X-100 in PBS (PBSTritonX) e omogeneizzare gli embrioni passandoli almeno 15 volte attraverso una siringa per insulina con un ago sterile da 27 G.</li>
	<li>Preparare diluizioni seriali di omogeneati in PBS sterile trasferendo 100 μL dell'omogeneato diluito in 900 μL di PBS sterile.</li>
	<li>Per selezionare la deformazione PAO1 naturalmente resistente agli amplificatori, placcare 100 μL delle diluizioni sull'agar LB aggiunte con ampicillina (100 μg/mL) e incubare a 37 °C durante la notte.</li>
	<li>Il giorno dopo, conta il numero di colonie, moltiplica per il fattore di diluizione per determinare il numero totale di CFU e dividi per il numero di embrioni omogeneizzati per ottenere il numero medio di CFU /embrione infetto.</li>
</ol>8. Valutazione della letalità degli embrioni iniettati con PAO1 e fagi
<ol><li>Per valutare la letalità dell'infezione da PAO1, segnare gli embrioni iniettati a 20 hpi sotto uno stereomicroscopio e contare per gli embrioni morti (bianchi / non trasparenti).</li>
	<li>Calcolare la dose di concentrazione letale semi-massima 50 (LD50) di PAO1 che determina la morte del 50% degli embrioni iniettati a 20 hpf.</li>
</ol>9. Preparazione dell'embrione per l'imaging stereomicroscopio time-lapse dell'infezione da GFP+ PAO1
<ol><li>Preparare lo stampo per l'imaging di embrioni vivi sciogliendo l'1,5% di agarosio a bassa fusione in 100 mL di soluzione E3.</li>
	<li>Aggiungere l'1% di tricaina (cfr. tabella 1) per anestetizzare gli embrioni.</li>
	<li>A 4 hpi trasferire un embrione con una pipetta di plastica in un piatto inferiore di vetro e aggiungere la soluzione calda di agarosio a basso punto di fusione.</li>
	<li>Posizionare la piastra inferiore in vetro sotto uno stereomicroscopio e con una punta posizionare l'embrione nell'orientamento desiderato. Utilizzare una pipetta di plastica per aggiungere con cura una goccia di agarosio sull'embrione.</li>
	<li>Lasciare raffreddare l'agarosio per 5-10 minuti e riempire delicatamente il piatto inferiore in vetro con E3 contenente la soluzione anestetica per mantenere umido l'embrione.</li>
	<li>Posizionare la piastra inferiore in vetro con l'embrione sotto lo stereomicroscopio fluorescente con un filtro fluorescente (canale 488 nm) per i batteri GFP+. Non rimuovere la piastra di Petri fino a ulteriori acquisizioni con gli stessi parametri a 9, 14 e 18 hpi.</li>
</ol>10. Analisi di espressione delle citochine pro-infiammatorie
<ol><li>A 20 hpi anestetizza gli embrioni con soluzione di tricaina 1x e trasferiscili dalla piastra di Petri a un tubo di centrifuga da 1,5 ml.</li>
	<li>Sotto una cappa aspirante rimuovere la soluzione anestetica e sostituirla con 200 μL di reagente di cloridrato di guanidio.</li>
	<li>Omogeneizzare gli embrioni tubazionandoli ripetutamente attraverso una pipetta da 200 μL prima e poi almeno 15 volte con una siringa per insulina con un ago sterile da 27 G.</li>
	<li>Estrarre l'RNA totale da embrioni di zebrafish omogeneizzati utilizzando un reagente di cloridrato di guanidio disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Trattare 1 μg di ciascun campione di RNA con 2 μL di 1U/μL di DNA I (senza RNasi), seguendo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Utilizzare 1 μg di DNasi Ho trattato l'RNA per la reazione di trascrizione inversa (RT) utilizzando il kit disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali),in un volume totale di 20 μL secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Eseguire la reazione RT qPCR in un volume totale di 10 μL contenente 1x SYBR Green mastermix usando 1,5 μL di una diluizione 1:6 della reazione RT. Ai fini della normalizzazione, utilizzare i primer per i geni di conservazione rpl8 e per le citochine pro-infiammatorie, utilizzare primer per TNF-α e IL-1β (vedi tabella 2). il protocollo qPCR era: ciclo 1 fase 1: 95 °C, 2 min, ripetere una volta; ciclo 2: fase 1 95 °C, 10 s, passo 2 55 °C, 30 s, ripetere 40x; ciclo 3: fase 1 72 °C, 15 min.</li>
</ol>

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<li>Balloy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+cystic+fibrosis+human+bronchial+epithelial+cells+infected+with+Pseudomonas+aeruginosa+exhibit+distinct+gene+activation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns.</a> PLoS One. 10, 0140979(2015).</li>
<li>Cafora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+therapy+against+Pseudomonas+aeruginosa+infections+in+a+cystic+fibrosis+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model.</a> Science Reports. 9, 1527(2019).</li>
<li>Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+methods+in+the+study+of+the+phage-antiphage+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction.</a> Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).</li>
<li>Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+as+a+Model+Organism+to+Study+Development+of+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System.</a> Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo manoscritto, abbiamo descritto il protocollo per eseguire l'infezione da P. aeruginosa (PAO1) negli embrioni di zebrafish e come applicare la terapia del fago con un cocktail di fagi precedentemente identificati come in grado di infettare PAO1 per risolverlo. L'uso di batteriofagi come alternativa ai trattamenti antibiotici è stato di crescente interesse dagli ultimi anni. Ciò è dovuto principalmente alla diffusione di infezioni batteriche multi-resistenti ai farmaci (MDR), che costituiscono un grave p...

La terapia del fago, l'uso dei nemici naturali dei batteri per combattere le infezioni batteriche, sta raccogliendo rinnovato interesse man mano che la resistenza batterica agli antibiotici diventadiffusa 1,,2. Questa terapia, utilizzata da decenni nell'Europa orientale, potrebbe essere considerata un trattamento complementare agli antibiotici nella cura delle infezioni polmonari nei pazienti con CF e una possibile alternativa terapeutica per i pazienti infetti da batteri resistenti a tutti gli antibiotici attualmente in uso2,,3. I vantaggi della terapia antibiotica sono che i batteriofagi si moltiplicano nel sito di infezione, mentre gli antibiotici vengono metabolizzati ed eliminati dalcorpo 4,5. In effetti, la somministrazione di cocktail di fagi virulenti isolati in diversi laboratori si è dimostrata efficace nel trattare le infezioni da Pseudomonas aeruginosa in modelli animali diversi come insetti e mammiferi6,,7,,8. La terapia del fago ha anche dimostrato di essere in grado di ridurre il carico batterico nelle ferite da ustione infettate da P. aeruginosa ed Escherichia coli in uno studio clinico randomizzato9.
Zebrafish (Danio rerio) è recentemente emerso come un modello prezioso per studiare le infezioni con diversi agenti patogeni, tra cui P. aeruginosa10,,11, Mycobacterium abscessus e Burkolderia cepacia12,,13. Microiniettando batteri direttamente nella circolazione sanguignadell'embrione 14 è facile stabilire un'infezione sistemica che viene contrastata dal sistema immunitario innato zebrafish, che è evolutivo conservato con neutrofili e generazione di macrofagi simile alla controparte umana. Inoltre, durante il primo mese di vita, gli embrioni di zebrafish mancano della risposta immunitaria adattiva, rendendoli modelli ideali per studiare l'immunità innata, che è il meccanismo di difesa critico nelle infezioni polmonariumane 15. Zebrafish è recentemente emerso come un potente sistema di modelli genetici per comprendere meglio l'insorgenza della CF e sviluppare nuovi trattamentifarmacologici 10,,16,,17. Il modello cf zebrafish di cftr knock-down generato con iniezione di morfolino nel pesce zebra ha presentato una risposta di scoppio respiratorio smorzato e una ridotta migrazione neutrofila10, mentre il knock-out cftr porta a una posizione interna dell'organo compromessa e alla distruzione del pancreas esocrina, un fenotipo che rispecchia la malattia umana16,,17. Di maggiore interesse è stato il risultato che il carico batterico P. aeruginosa è stato significativamente più elevato negli embrioni cftr-perdita di funzione che nei controlli a 8 ore dopo l'infezione (hpi), che è parallelo ai risultati ottenuti con topi e cellule epiteliali bronchialiumane 2,18.
In questo lavoro, dimostriamo che la terapia del fago è efficace contro le infezioni da P. aeruginosa negli embrioni di zebrafish.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289329</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Etile 3-amminobenzoato metansolfonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td><td>nome comune tricaina</td></tr><tr><td>Micromanipolatore Femtojet</td><td>Eppendorf</td><td>5247</td><td></td></tr><tr><td>Fleming/marrone P-97</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>LE-Agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11685660001</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Blu</td> <td>metilicoSigma-Aldrich</td><td>28983-56-4</td><td></td></tr><tr><td>Aghi per microiniezione</td><td>Apparecchio</td><td></td><td></td>di Harvard</tr><tr><td>N-Phenylthiourea >=98%</td><td>Aldrich-P7629</td><td>103-85-5</td><td></td></tr><tr><td>Oligo Morpholino</td><td>Gene Strumenti</td><td></td><td>progettati dal ricercatore</td></tr><tr><td>PEG6000</td><td>Calbiochem</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di rosso fenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 143-74-B</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Pronasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-06-0</td><td></td></tr><tr><td>Reagente ACS cloruro di sodio, &ge; 99.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica</td><td>S9I</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Triptone</td><td>Ossoide</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Ossoide</td><td>LP0021B</td><td></td></tr><tr><td>Z-MOLDS Microiniezione</td><td>Word Strumenti di</td><td></td><td></td> precisione</tr></tbody></table>

applicazione di terapia del fago per contrastare l'infezione da pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish della fibrosi cistica

Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos

La resistenza antimicrobica, una delle principali conseguenze dell'incertezza diagnostica e della sovraprescrizione antimicrobica, è una causa sempre più riconosciuta di infezioni gravi, complicazioni e mortalità in tutto il mondo con un enorme impatto sulla nostra società e sul sistema sanitario. In particolare, i pazienti con sistema immunitario compromesso o patologie preesistenze e croniche, come la fibrosi cistica (CF), sono sottoposti a frequenti trattamenti antibiotici per controllare le infezioni con l'aspetto e la diffusione di isolati multifarmacologici resistenti. Pertanto, vi è l'urgente necessità di affrontare terapie alternative per contrastare le infezioni batteriche. L'uso di batteriofagi, i nemici naturali dei batteri, può essere una possibile soluzione. Il protocollo dettagliato in questo lavoro descrive l'applicazione della terapia del fago contro l'infezione da Pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish CF. Gli embrioni di zebrafish sono stati infettati da P. aeruginosa per dimostrare che la terapia del fago è efficace contro le infezioni da P. aeruginosa in quanto riduce la letalità, il peso batterico e la risposta immunitaria pro-infiammatoria negli embrioni CF.

I risultati e le cifre qui presentati sono riferiti agli embrioni di CF generati attraverso l'iniezione di cftr morpholinos come descritto inprecedenza 10 e nella fase 5. Per convalidare il fenotipo CF, è stata presa in considerazione la posizione compromessa di organi interni come cuore, fegato e pancreas come descritto in precedenza17 (Figura 1). Risultati analoghi sono stati ottenuti nel caso degli embrioni WT, come riportato nella ...

Presentato qui è un protocollo per l'infezione da Pseudomonas aeruginosa e l'applicazione della terapia del fago negli embrioni di zebrafish della fibrosi cistica (CF).

Applicazione di terapia del fago per contrastare l'infezione da Pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish della fibrosi cistica

Antimicrobial resistance, a major consequence of diagnostic uncertainty and antimicrobial overprescription, is an increasingly recognized cause of severe ...

Questo protocollo facilita la preparazione e la somministrazione di un cocktail virale e fago contro pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente una valutazione in vivo dell'efficacia del fago nel contrastare l'infezione batterica. Il cocktail di fago è efficiente sia nei modelli zebrafish di tipo selvatico che cystic fibrosi.Apertura della possibilità di applicare la terapia del fago alle infezioni batteriche nei pazienti con fibrosi cistica. La terapia del fago può anche essere applicata per contrastare specifiche infezioni batteriche in altri sistemi modello. Per preparare un fago per l'esperimento.Aggiungere 1,25 per 10 al settimo fagi a un OD 600 della cultura di 0,05 P.aeruginosa a una molteplicità di infezione da uno per 10 a tre negativi e incubare la coltura per tre o quattro ore con tremori fino a quando l'OD 600 scende a 0,1 a 0,3. Al termine dell'incubazione incubare il lisato con un microgrammo per millilitro di DNAsi e RNAsi per 30 minuti a 37 gradi Celsius. E pellettò le cellule per centrifugazione.Al termine del filtro di centrifugazione il supernatante attraverso un diametro del poro di 0,8 micrometri e aggiungere 58 grammi per litro di cloruro di sodio e 105 grammi per litro di PEG 6000. Incubare la soluzione a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina dopo, precipitare il fago per centrifugazione.Al termine della centrifugazione rimuovere il supernatante e sciogliere con cura il pellet di fago in 15 millilitri di tampone di cloruro di sodio Tris. Per purificare i fagi mediante gradiente di densità del cloruro di cesio, prima stratificare due millilitri di quattro diverse soluzioni di cloruro di cesio in tubi di poliallomero ultracentrifugo per un rotore SW 41 e aggiungere 3,5 millilitri della sospensione del fago a ciascun tubo. Il cloruro di cesio è tossico.Adottare sempre procedure di sicurezza adeguate durante la manipolazione e lo scarto di questo composto. Una volta caricati tutti i tubi, posizionare i tubi nel rotore facendo attenzione che i tubi siano bilanciati. E centrifugare i campioni per due ore a 100.000 volte g e quattro gradi Celsius.Al termine della centrifugazione, utilizzare una siringa con un ago calibro 19 per aspirare lo strato bianco tra la D uguale a 1,5 e la D è uguale a 1,4 regioni di densità. E trasferire le sospensioni in nuovi tubi in poliallomero sw 60. Centrifugare le sospensioni per almeno 16 ore a 150.000 volte g e quattro gradi Celsius.E trasferire le bande visibili in tubi di dialisi con un taglio di 6.000 Dalton. Quindi dializzare i campioni raccolti due volte contro 500 millilitri di acqua per 20 minuti per dialisi e durante la notte contro 500 millilitri di tampone di cloruro di sodio Tris. La mattina seguente, filtrare il materiale fago risultante con un filtro poro di 0,22 micro metri e conservare il magazzino a quattro gradi Celsius.Il giorno della micro iniezione diluire due soluzioni di morpholinos micromolare in acqua sterile ad una concentrazione finale di 0,25 picomolare per embrione per ottenere una soluzione di iniezione di morfolino a cinque microliter. E aggiungere 0,5 microlitri di rosso fenolo ad ogni soluzione. Successivamente utilizzare una micropipetta da 20 microliter con una punta di caricamento in gel fine per caricare un micro ago di iniezione con l'intero volume di soluzione mista di morfolino e fissare l'ago a un micro manipolatore collegato a un supporto al microscopio stereo.Quindi, con una o due cellule, embrioni di pesce zebra disposti su uno scivolo di vetro posto all'interno di una piastra di Petri di 96 millimetri di diametro, penetrano nel corore e nel tuorlo con la punta dell'ago a micro iniezione e iniettano due nanolitri della miscela di morfina nell'embrione. A 26 ore dalla fecondazione, caricare un micro ago di iniezione con circa cinque microlitri di P.aeruginosa inoculum e inserire l'ago dorsalmente al punto di partenza del condotto di Cuvier in cui il condotto inizia a diffondersi sul sacco del tuorlo. Iniettare uno o tre nanolitri dell'inoculo PAO1 nell'embrione assicurandosi che il volume si espanda direttamente all'interno del condotto ed entri nella circolazione.Dopo l'iniezione trasferire l'embrione in una delle due nuove piastre di Petri contenenti mezzo fresco E3 integrato con feniltiourea per un'incubazione di 30 minuti o tre ore a 28 gradi Celsius. Successivamente, caricare un micro ago di iniezione con circa cinque microlitri del cocktail di fago e fissare l'ago al micro iniettore. Quindi iniettare da uno a tre nanolitri di cocktail di fago nel condotto di Cuvier di ogni embrione precedentemente iniettato con batteri e posizionare gli embrioni in una delle due nuove piastre di Petri contenenti mezzo fresco E3 integrato con feniltiourea a 28 gradi Celsius.A quattro ore dalla post-infezione, utilizzare una pipetta di plastica per trasferire un embrione anestetizzato in un piatto di fondo di vetro. E riempire il piatto con una soluzione calda di agarosio a basso punto di fusione. Quando l'agarosio è freddo, riempire delicatamente il piatto con mezzo E3 integrato con soluzione anestetica.Posizionare il piatto al microscopio stereo e utilizzare una punta di pipetta per posizionare l'embrione nell'orientamento desiderato. Quindi posizionare il piatto sotto un microscopio stereo fluorescente con un filtro fluorescente per batteri positivi alla GFP per un massimo di 18 ore dopo l'infezione e l'immagine dell'embrione per la progressione dell'espressione della GFP a nove, 14 e 18 ore dopo l'infezione. Per determinare il carico batterico a otto ore dopo l'infezione, trasferire 15 embrioni microiniettati anesteti in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri e sostituire la soluzione anestetica con 300 microlitri dell'1%Triton X-100 in PBS.Passare gli aghi attraverso l'ago sterile calibro 27 di una siringa per insulina almeno 15 volte per omogeneizzare gli embrioni. E preparare le diluizioni seriali dell'omogeneato trasferendo 100 microlitri della miscela risultante in 900 microlitri di PBS sterile per diluizione. Per selezionare il ceppo P.aeruginosa naturalmente resistente all'ampicillina, placcare 10 microlitri delle diluizioni sull'agar LB integrato con ampicillina e incubarli durante la notte a 37 gradi Celsius.Il giorno dopo conta il numero di colonie. Per consentire il calcolo del numero totale di unità di formazione della colonia e del numero medio di unità di formazione della colonia per embrione infetto. Per valutare la letalità dell'infezione da P.aeruginosa segnare gli embrioni iniettati a 20 ore dopo l'infezione al microscopio stereo contando il numero di embrioni bianchi opachi morti.Quindi calcolare la mezza concentrazione letale massima 50 dose di P.aeruginosa che ha portato alla morte del 50% degli embrioni iniettati a 20 ore dopo l'infezione. Per convalidare il fenotipo della fibrosi cistica è possibile valutare la posizione compromessa degli organi interni come il fegato cardiaco e il pancreas. Il carico batterico è ridotto dalla terapia del fago negli embrioni di fibrosi cistica infettati da P.Aeruginosa.In 48 ore dopo la fecondazione gli embrioni di fibrosi cistica infettati da batteri P.Aeroginosa positivi alla GFP, una colonia di 30 unità formatrici per dose embrionale dimostra una letalità del 50% a 20 ore dopo l'infezione. La terapia del fago è altrettanto efficace a 20 ore dopo l'infezione quando viene consegnata 30 minuti o sette ore dopo l'iniezione batterica. Qui, viene mostrata una fibrosi cistica e un embrione positivo alla GFP P.Aeruginosa iniettato a quattro, nove, 14 e 18 ore dopo l'infezione.Al contrario, la fibrosi cistica più P.Aeruginosa più l'embrione iniettato di fago dimostra una ridotta fluorescenza dovuta all'azione del fago contro i batteri. La risposta infiammatoria generata dall'infezione da P.aeruginosa negli embrioni di fibrosi cistica è significativamente aumentata come rivelato dall'espressione delle citochine pro-infiammatorie, TNF alfa e interleuchina 1 beta a seguito dell'iniezione di P.aeruginosa rispetto al controllo del pesce zebra iniettato. Tuttavia, l'espressione di entrambe le citochine infiammatorie è ridotta negli animali co-iniettati di cocktail di fago.I fagi devono essere accuratamente purificati per rimuovere eventuali endotossine contaminanti che possono essere trattenute durante il preparato. I preparati del fago possono essere analizzati mediante microscopia elettronica per valutare la morfologia del virione. Sarebbe interessante verificare se l'infezione nei pazienti umani da parte di batteri diversi dalle pseudomonas aeruginosa può essere curata con la terapia del fago nel modello del pesce zebra della fibrosi cistica.

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Il video dimostra la tecnica di terapia fagica mirata all'infezione da Pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish con fibrosi cistica. La terapia fagica riduce efficacemente la carica batterica e mitiga le risposte immunitarie proinfiammatorie negli embrioni di pesce zebra FC infettati da batteri, portando a una riduzione della letalità degli embrioni FC.

Una terapia fagica contro l'infezione da Pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish

In questo articolo video descrive l'alta velocità oleodotto che è stato stabilito con successo per infettare e analizzare un gran numero di embrioni di zebrafish fornire un nuovo potente strumento per il test composto e la scoperta di farmaci utilizzando un intero organismo vertebrato.

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Vengono dimostrati modelli di infezione sistemica e localizzata da zebrafish per il virus dell'influenza umana A. Utilizzando un modello di infezione sistemica, il pesce zebra può essere utilizzato per lo screening di farmaci antivirali. Utilizzando un modello di infezione localizzata, il pesce zebra può essere utilizzato per caratterizzare le risposte delle cellule immunitarie dell'ospite.

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Questo protocollo descrive l'uso di tamponi di pozzetto e analisi dei fanghi, dei sistemi di zebrafish, che conduce alla rilevazione aumentata rispetto all'utilizzo esclusivo di sentinelle per rilevare gli agenti patogeni quali Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. e  Tomentosa di Pseudocapillaria. Viene proposto anche un sistema per monitorare le uova p. tomentosa in quarantena.

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Qui descriviamo un protocollo per l'immunizzazione del adulto zebrafish (Danio rerio) con un vaccino basato su DNA e dimostrare la convalida di un evento di successo vaccinazione. Questo metodo è adatto per lo screening preclinico di candidati vaccinali in vari modelli di infezione.

Immunizzazione di Zebrafish adulto per lo Screening preclinico di vaccini basati sul DNA

Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per la generazione e la risoluzione dei problemi di xenotrapianti di leucemia linfoblastica acuta umana (ALL) da linee cellulari e materiale fresco del paziente in embrioni di zebrafish transitoriamente immunosoppressi, insieme a linee guida per la valutazione della risposta ai farmaci mediante citometria a flusso. La pipeline sperimentale può essere adattata anche per i tumori solidi.

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Attualmente mancano modelli in vivo suscettibili di screening farmacologico contro le infezioni batteriche croniche. Qui, descriviamo un protocollo per l'infezione della ferita da parte di un isolato clinico di Pseudomonas aeruginosa per generare un'infezione persistente nelle larve di zebrafish.

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Scopri la terapia del fago contro Pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish per la fibrosi cistica. Questo metodo permette di valutare l'efficacia in vivo del cocktail virale contro l'infezione batterica.

Applicazione di terapia del fago per contrastare linfezione da Pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish della fibrosi cistica (Video) | JoVE Journal

Applicazione di terapia del fago per contrastare l'infezione da Pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish della fibrosi cistica

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