Applicazione di un sistema di bioreattore tridimensionale di stimolazione meccanica uniassiale per indurre la differenziazione tenogena delle cellule staminali derivate da Tendon

Diversi parametri di carico meccanico potrebbero indurre cellule STAMINALI derivate dal tendine differenziate in diverse cellule. Introduciamo un processo dettagliato di applicazione di questo sistema tridimensionale di stimolazione meccanica uniassiale bioreattore per indurre la differenziazione tenogenica delle cellule STAMINALI derivate dal tendine. La tendinopatia è una delle lesioni sportive comuni nel reparto ortopedico.

La presenza di tendinopatia di Achille è più comune fino al 29% per i corridori di media e lunga distanza, mentre la presenza di tendinopatia della rotula è alta anche negli atleti di pallavolo, basket, atletica e campo, pallamano e calcio. Tuttavia, a causa della limitata capacità di autoguarigione del tendine e della mancanza di un trattamento efficace, la tendinopatia ha ancora un effetto avverso significativo sulla qualità della vita dei pazienti. Le cellule STAMINALI derivate dal tendine, note come TDC come le importanti cellule precursori delle cellule tendini, svolgono un ruolo importante nello sviluppo della tendinopatia, così come nel loro ripristino funzionale e strutturale dopo la tendinopatia.

Tuttavia, diversi dai parametri di carico meccanici, come la sollecitazione di carico, la frequenza di caricamento, il tipo di carico e il periodo di caricamento possono indurre i TDC a differenziarsi in celle diverse. Pertanto, un regime di carico meccanico efficace e valido è molto significativo per la genesi del tendine. Ci sono sette fasi del presente protocollo, tra cui l'isolamento dei TDC dei topi, la coltura e l'espansione dei TDC dei topi, la preparazione del mezzo di coltura della stimolazione per la formazione di fogli cellulari, la formazione di fogli cellulari mediante coltura in mezzo di stimolazione, la preparazione del costrutto di cellule STAMINALI del tendine 3D, l'assemblaggio delle cellule uniassiali che allungano il complesso di stimolazione meccanica e la valutazione del tessuto meccanico stimolato in vitro simile al tendine.

Isolamento dei TDC dei topi. Utilizzato nei topi che hanno dai sei agli otto settimane di topi per lussazione cervicale. Raccogliere tendini di rotula e tendini d'Achille.

Digerire il tendine con sei millilitri di collagenasi di tipo 1 per tre ore. Raccogliere le cellule e raccoglierla in MEM alfa completo contenente il 10% di FBS e l'1% di streptomicina e miscela di penicillina per sette giorni. identificare i TDC utilizzando lo smistamento delle celle attivato a fluorescenza per citometria del flusso, espressione di marcatori di superficie cellulare, inclusi CD44, CD90 e Sca-1.

Mancanza dell'espressione di CD34 e CD45. Passaggio e congelamento delle cellule. Le celle passaggio verranno utilizzate per ulteriori passaggi.

Cultura ed espansione dei TDC topi. Prendi le cellule STAMINALI del tendine dei topi riscaldate. Aggiungere lentamente da quattro a cinque millilitri supplementari di MEM alfa completo.

Trasferire la miscela in un tubo di centrifuga da 15 millilitri con una pipetta. Ricaricare con un medio-totale di otto millilitri da una pipetta. Posizionare il tubo in centrifuga un equilibrio del pozzo.

Centrifugare le cellule a 347 g per cinque minuti. Eserti un tubo dalla centrifuga. Controllare il pellet nella parte inferiore.

Decantare il mezzo libero. Sospendere delicatamente le celle in un mezzo completo da uno a due millilitri. Evita di fare troppe bolle.

Trasferire le celle ri-sospese in un pallone T75 da una pipetta. Utilizzare una pipetta per aggiungere un mezzo MEM alfa completo al pallone per raggiungere un volume totale di 10 millilitri con la concentrazione finale di 13.000 celle per centimetro quadrato. Posizionare il pallone nell'incubatore e culturarlo a 37 gradi con anidride carbonica al 5%.

Cambia il mezzo ogni tre giorni. Osservare e monitorare le cellule al microscopio quando si cambia il mezzo fino a quando le cellule non sono state coltivate al 100% di confluenza. Preparazione del mezzo di coltura di stimolazione per la formazione di fogli cellulari.

Versare 15 millilitri completare il mezzo MEM alfa in un tubo sterile da 15 millilitri. Aggiungere sei microlitri di acido ascorbico in mezzo da 15 millilitri alla concentrazione finale di 4,4 microgrammi per millilitro. Mescolare delicatamente invertendo su e giù.

Formazione di fogli cellulari coltivando nel mezzo di stimolazione. Scartare con attenzione il mezzo MEM alfa completo non normale. Evitare di toccare le cellule attaccate alla parte inferiore del pallone.

Aggiungere lentamente 10 millilitri di stimolazione. Evitare di causare disturbi alle cellule completamente confluenti. Coltura delle cellule in mezzo di stimolazione per nove giorni e cambiare il mezzo ogni tre giorni per generare sufficientemente foglio cellulare a 37 gradi con il 5% di anidride carbonica.

Preparazione del costrutto di cellule STAMINALI del tendine 3D. Togliere il pallone dall'incubatrice. Scartare completamente il mezzo di stimolazione.

Lavare il foglio cellulare monostrato con PBS ruotando il pallone. Scartare completamente il PBS. Utilizzare una pipetta per aggiungere un millilitro, 0,25% di tripina all'angolo del pallone.

Toccare l'angolo del pallone per staccare il foglio cellulare monostrato fino a quando l'angolo del foglio cellulare non si lava dalla parte inferiore del pallone. Aggiungere immediatamente nove millilitri di mezzo MEM alfa completo per fermare la reazione di tripsininazione. Continuare a ruotare il pallone per staccare completamente il foglio cellulare monostrato.

Versare il totale per attaccare il foglio cellulare nella piastra di Petri con mezzo. Utilizzare una pinzetta sterile per raccogliere un angolo del foglio cellulare e ruotare in senso orario per 15 volte. Raccogliere un'altra estremità del foglio cellulare e ruotare in senso antiorario per 10 volte per formulare un costrutto in vitro simile a un tendine.

Assemblaggio del complesso di stimolazione meccanica uniassiale-stretching in bioreattore dal design unico. Collegare i ganci dal connettore, quindi regolare a due centimetri tra due ganci. Avvolgere delicatamente il costrutto di TDC 3D sul gancio demo per tre volte su ciascun gancio.

Fissare i ganci con costrutto di cella sulla camera del bioreattore stringendo le viti su due estremità. Riempire la camera con il mezzo MEM alfa completo. Collegare l'acceleratore alla camera di coltura via cavo.

Tagliare il connettore dei ganci con pinzette sterili. Accendere il controller di alimentazione e canale per avviare una stimolazione meccanica. Mettere il coperchio sulla camera, tenere traccia delle spie luminose e assicurarsi che il bioreattore possa funzionare correttamente.

Mettere il bioreattore nell'incubatore e sottomettere il costrutto di cellule 3D allo stretching meccanico. Il regime di carico è del 6%, frequenza 0,25 Hertz, otto ore seguite da 16 ore di riposo per sei giorni. Valutazione del tessuto meccanico stimolato in vitro simile al tendine.

allentare le viti da un cacciavite e togliere il montaggio con attenzione. Mettere il tessuto simile al tendine nel 4%PFA per la fissazione per 15 minuti, posizionare il tessuto fisso simile al tendine in una cassetta di biopsia con biopsia degli animali domestici. Processo per disidratare un campione.

E infine, valuta con la posizione istologica della MH. Ripetere l'intero protocollo ed estrarre l'RNA dal tessuto tendineo per valutare l'espressione dei marcatori tenogenici mediante qPCR. Prima della stimolazione meccanica, i TDC cresceranno fino al 100% di confluenza in mezzo completo e mostrerà una morfologia strutturale esterna disorganizzata.

Dopo sei giorni hai visto lo stretching, il carico meccanico, la matrice cellulare extra e gli allineamenti cellulari erano ben orientati. Le celle erano ben popolate e ben avvolte in ECM dopo il caricamento meccanico. La morfologia cellulare è stata presentata per essere localizzata ed era più simile alle normali cellule tendinee rispetto a quella con senza allungamento.

La densità cellulare nel costrutto di celle con caricamento era superiore a quella senza carico. I risultati qPCR hanno mostrato che le questioni attuali hanno aumentato l'espressione di marcatori tenogenici, tra cui scleraxis, Mohawk, tenomodulina e collagene di tipo 1 rispetto a quelli trattati con coltura dichiarata. In termini di sistema di bioreattore di stimolazione meccanica, nel nostro protocollo attuale è stata utilizzata una camera separata con motore lineare.

Poiché può fornire un carico meccanico accurato ed è portatile e facile da regolare rispetto ai modi in cui il tradizionale foglio di celle 2D e l'allungamento biassiale, il costrutto di celle 3D è più simile alla forma reale del tendine. E l'allungamento uniassiale è più simile alle caratteristiche di forza delle cellule tendinee. Ciò fornisce una base teorica per l'utilizzo di un sistema allungato uniassiale 3D per stimolare la differenziazione dei TDC.

Così, il foglio cellulare 2D è stato infine instradato in un costrutto di celle 3D e sottoposto a uniassiale nel presente protocollo. Secondo il nostro sistema di bioreattori, il nostro regime di carico è del 6%, 0,25 Hertz, otto ore seguite da riposo di 16 ore per sei giorni. Infine, l'efficacia del protocollo è stata dimostrata dalla morfologia e dal livello di espressione dei marcatori tenogenici.

L'intero processo operativo è semplice, ma l'operatore deve prestare attenzione per mantenere l'ambiente di TDSC sterilizzato in ogni momento. Ci sono molte applicazioni del nostro protocollo. Il processo di stimolo dei TDC a imitare la differenziazione in vivo è utile per lo studio del processo patologico della tendinopatia.

Inoltre, questo protocollo fornisce un metodo riproducibile per la differenziazione diretta dei TDC in tessuti simili a tendini. Quindi può essere utilizzato in modo semplice ed efficace per la potenziale cultura del tendine ingegnerizzata. In sintesi, l'applicazione di un sistema di bioreattore di stimolazione meccanica uniassiale 3D è un metodo semplice, economico, riproducibile e valido per indurre la differenziazione tenogenica dei TDC.

Il nostro protocollo fornisce l'intero processo in dettaglio.