2D-HELS MS Seq: Un metodo generale basato su LC-MS per il sequenziamento diretto e de novo di miscele di RNA con diverse modifiche nucleotidiche
10 luglio 2020
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per un metodo di sequenziamento basato su LC-MS che può essere utilizzato come metodo diretto per sequenziare RNA corto (<35 nt per corsa) senza un intermedio di cDNA e come metodo generale per sequenziare diverse modifiche nucleotidiche in un singolo studio con precisione a base singola.
Questo protocollo copre tutti i passaggi essenziali necessari quando si utilizza il nuovo metodo sviluppato per sequenziare direttamente l'RNA, indipendentemente dal fatto che il campione di RNA sia a filamento singolo, miscelato o modificato. Il metodo non è influenzato da errore enzimatico o complementarità di basi. Fornisce un flusso di lavoro diretto e una soluzione generale che consente di sequenziare diverse modifiche dell'RNA contemporaneamente piuttosto che una modifica specifica alla volta.
Questa tecnologia può essere sviluppata in uno strumento diagnostico per determinare i segmenti di RNA della firma per correlarli alla malattia umana e in uno strumento accurato per studiare le modifiche dell'RNA a livello epitrascrittomico. Il metodo non si basa su alcun metodo di sequenziamento precedente. Invece, si tratta di un approccio completamente nuovo e miriamo a renderlo il metodo di riferimento per il sequenziamento di qualsiasi RNA modificato.
Alcune parti di questo protocollo contengono aspetti critici che possono essere trasmessi in modo più accurato con una dimostrazione visiva, come l'etichettatura dell'estremità 3' dell'RNA LC-MS, l'acquisizione dei dati e l'analisi dei dati da parte del software MassHunter. Dimostrerò questa procedura e imposterò la LC-MS e misurerò i nostri campioni di RNA. Per eseguire una reazione di marcatura in un'unica fase, combinare 2 microlitri di 150 micromolari di AppCp-biotina, 3 microlitri di tampone di reazione ligasi 10x, 1,5 microlitri di campione di RNA 100 micromolari, 3 microlitri di DMSO anidro, 10 unità di RNA ligasi T4 e 19,5 microlitri di acqua trattata con DEPC per un volume totale di 30 microlitri.
Incubare la reazione per una notte a 16 gradi Celsius, quindi eseguire la purificazione della colonna secondo le indicazioni del manoscritto. Dopo aver diviso l'RNA in tre aliquote e aver aggiunto un volume uguale di acido formico, incubare le reazioni a 40 gradi Celsius. Una volta terminata ogni reazione, congelare immediatamente il campione su ghiaccio secco per estinguere la degradazione dell'acido.
Utilizzare un concentratore centrifugo sottovuoto per asciugare il campione per circa 30 minuti. Risospendere i campioni essiccati in 20 microlitri di acqua trattata con DEPC e combinarli. Conservare i campioni a 20 gradi Celsius fino alla misurazione LC-MS.
Trasferire il campione di RNA nella fiala del campione LC-MS dopo aver preparato le fasi mobili. Ogni iniezione dovrebbe contenere da 100 a 400 picomoli di RNA e 20 microlitri. Dopo aver acquisito i dati, utilizzare il flusso di lavoro di estrazione delle caratteristiche molecolari per estrarre le informazioni sui composti, tra cui massa, tempo di conservazione, volume e punteggio di qualità.
Utilizzare il formato dei dati del centroide nelle impostazioni di piccole molecole. Impostare l'altezza del picco su almeno 100, ma inferiore a 1.000 e il punteggio di qualità su almeno 50. Infine, esporta i dati come file Excel.
La separazione della scala 3' dalla scala 5' e da altri frammenti indesiderati è mostrata qui su un grafico del tempo di ritenzione di massa 2D. È anche possibile sequenziare campioni misti contenenti due filamenti di RNA di diverse lunghezze con un'etichetta di 5'biotina su ciascun RNA. Per differenziare l'uridina da una pseudouridina, l'RNA è stato trattato con CMC, che converte una pseudouridina in un addotto CMC-pseudouridina.
L'addotto ha una massa diversa in un'uridina e può essere differenziato nella 2D-HELS MS Seq. Per calcolare la conversione percentuale, che era del 42%, è stato utilizzato il profilo HPLC del prodotto grezzo della reazione che converte la pseudouridina nel suo addotto CMC. Una miscela di cinque diversi filamenti di RNA è stata sequenziata mediante l'approccio 2D-HELS MS Seq con marcatura a 3'estremità e normalizzata per una migliore visualizzazione di più sequenze di RNA. Senza la normalizzazione, i codici delle lettere per le sequenze dei cinque RNA sarebbero ammassati insieme.
Durante il tentativo di questa procedura, impostare attentamente la reazione di marcatura per ottenere un'elevata resa di campioni di RNA marcati. Inoltre, monitora attentamente il tempo di degradazione per creare scale di massa affidabili e raccogliere la quantità massima di campioni secchi con 20 microlitri di acqua. Una domanda che ci si può porre dopo aver eseguito questo protocollo è come aumentare la larghezza, la lunghezza e la produttività del metodo di sequenziamento.
Un algoritmo migliore e uno strumento più avanzato con una risoluzione e una sensibilità più elevate possono aiutare. Dopo lo sviluppo di questo protocollo, è diventato possibile sequenziare direttamente una gamma più ampia di campioni di RNA contenenti nucleotidi sia canonici che modificati senza alcun errore correlato al sequenziamento dell'RNA basato su CDA.
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Panoramica
Questo articolo presenta un nuovo metodo di sequenziamento basato su LC-MS per RNA corti che elimina la necessità di un intermedio cDNA. Il protocollo consente il sequenziamento simultaneo di varie modifiche dell'RNA con precisione a livello di singola base.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Sequenziamento dell'RNA
- Epitrascrittomica
- Biotecnologia
Sfondo
- I metodi attuali di sequenziamento dell'RNA spesso si basano su intermedi di cDNA.
- Gli errori enzimatici possono influenzare l'accuratezza del sequenziamento.
- Il sequenziamento simultaneo delle modifiche dell'RNA è complesso.
- Comprendere le modifiche dell'RNA è fondamentale per lo studio delle malattie umane.
Scopo dello studio
- Introdurre un metodo di sequenziamento diretto per l'RNA.
- Permettere lo studio di molteplici modifiche dell'RNA in un'unica analisi.
- Fornire uno strumento affidabile per la ricerca epitrascrittomica.
Metodi Utilizzati
- Tecnica di sequenziamento basata su LC-MS.
- Sequenziamento diretto di RNA a singolo filamento, misto o modificato.
- Eliminazione del passaggio di sintesi del cDNA.
- Flusso di lavoro progettato per elevata precisione e accuratezza.
Risultati principali
- Il metodo sequenzia con successo RNA corti (<35 nt) senza cDNA.
- È stata ottenuta la rilevazione simultanea di diverse modifiche dell'RNA.
- La tecnica ha dimostrato resistenza agli errori enzimatici.
- Sono state identificate potenziali applicazioni diagnostica per le malattie umane.
Conclusioni
- Questo nuovo metodo di sequenziamento potrebbe diventare uno standard per l'analisi dell'RNA modificato.
- Offre un approccio completo allo studio delle modifiche dell'RNA.
- Il protocollo ha implicazioni per la ricerca futura in biologia dell'RNA.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo di sequenziamento dell'RNA basato su LC-MS consente il sequenziamento diretto *de novo* di miscele di RNA modificato senza sintesi di cDNA, risolvendo un collo di bottiglia fondamentale nella validazione di bersagli epitrascrittomici. Fornendo dati di sequenziamento quantitativi e risolti per modificazione, supporta la scoperta precoce di biomarcatori basati sull'RNA e la riduzione del rischio meccanicistica di oligonucleotidi terapeutici. L'approccio aumenta la sicurezza predittiva nell'identificazione dei *lead* fornendo risultati specifici per la modificazione e confermati a livello di sequenza, direttamente applicabili ai flussi di lavoro di screening e sviluppo di saggi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante il sequenziamento diretto di modifiche dell'RNA, come la pseudouridina e la 5-metilcitosina, in contesti nativi.
- Valore operativo: Offre una soluzione generale per la rilevazione simultanea di nucleotidi canonici e modificati, riducendo la necessità di saggi specifici per ciascuna modifica da eseguire in sequenza.
- Valore predittivo: Supporta l'affidabilità del bersaglio attraverso la correlazione diretta tra massa e tempo di ritenzione delle basi azotate modificate, facilitando una mappatura precisa delle modifiche a livello di singolo sito.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera output quantitativi di massa e tempo di ritenzione che consentono una discriminazione affidabile di sequenze di RNA in miscele contenenti fino a 12 oligonucleotidi distinti.
- Valore operativo: Fornisce dati riproducibili e pronti per la normalizzazione, compatibili con sistemi standard di LC-MS ad alta risoluzione, supportando la standardizzazione dei saggi su pannelli di RNA corti.
- Scalabilità: Facilita la preparazione di sistemi biologici validati per analisi successive, producendo standard di RNA con sequenze verificate e schemi di modifiche definiti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Supporta la verifica della sequenza di oligonucleotidi di RNA terapeutici modificati, collegando le modifiche della fase di scoperta alla valutazione dei candidati preclinici.
- De-risking meccanicistico: Permette il rilevamento di spostamenti di massa indotti da modifiche (ad esempio, addotto CMC-pseudouridina) per distinguere il segnale reale da artefatti di degradazione in campioni complessi.
- Avanzamento basato sul rischio: Fornisce la conferma della sequenza senza bias enzimatici, riducendo i falsi negativi nel screening delle modifiche e migliorando l'affidabilità delle decisioni di avanzamento o interruzione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta come strumento di sequenziamento iniziale per l'analisi dell'RNA guidata da ipotesi, contribuendo all'identificazione dei candidati confermando la sequenza e lo stato di modificazione degli RNA sintetici o endogeni prima dello screening funzionale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi fornendo prove dirette della co-occorrenza di sequenze e modifiche dell'RNA in miscele naturali o sintetiche.
- Screening: Consente la prontezza del saggio generando scale di massa-tempo di ritenzione che fungono da riferimenti quantitativi per il profilo delle modifiche o degradazione dell'RNA indotte da composti.
- Analisi: Produce dati centroidali di caratteristiche molecolari (massa, tempo di ritenzione, volume, punteggio di qualità) esportabili in Excel, consentendo il confronto tra diverse condizioni e la valutazione statistica della stabilità delle modifiche.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica fornendo standard di RNA modificato con sequenza verificata, adatti all'allineamento di biomarcatori e alla validazione funzionale in sistemi pertinenti alle malattie.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità riutilizzabile basata su LC-MS per il sequenziamento rapido di varianti di RNA corto (<35 nt), riducendo la dipendenza dal sequenziamento esternalizzato e accelerando i cicli interni di screening delle modifiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione del bersaglio eliminando gli errori mediati dal cDNA e consentendo l'osservazione diretta delle firme di massa specifiche per la modificazione.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso fasi standardizzate di etichettatura, arresto della reazione acida e normalizzazione, che riducono la variabilità tra diversi esperimenti in miscele complesse di RNA.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale permettendo il sequenziamento interno dell'RNA modificato, riducendo la dipendenza da fornitori esterni e accelerando i cicli di ottimizzazione dei candidati.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta rispetto al rischio fornendo dati inequivocabili sulla sequenza e sulle modificazioni, riducendo l'abbandono in fasi avanzate dovuto a eterogeneità dell'RNA non rilevata o a errori di annotazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel trattamento dell'RNA, nell'uso della spettrometria di massa accoppiata a cromatografia liquida (LC-MS) e nell'estrazione di caratteristiche molecolari basata su MassHunter per un'interpretazione accurata dei dati.
- È subordinato all'accesso a sistemi LC-MS ad alta risoluzione in grado di acquisire dati centroidi con soglie definite per l'altezza dei picchi (100–1000) e per il punteggio di qualità (≥50).
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra gruppi di lavoro riguardo l'efficienza di marcatura, i tempi di degradazione e i protocolli di normalizzazione, al fine di garantire una generazione coerente delle scale di massa tra diversi utenti e piattaforme.
- Richiede considerazioni di adattamento qualora si voglia estendere il metodo oltre l'RNA corto (<35 nt) o a campioni biologici complessi, in attesa di futuri miglioramenti degli algoritmi e degli strumenti.
- Comporta limitazioni pratiche, tra cui i vincoli attuali sulla capacità di analisi e la dipendenza dall'ottimizzazione manuale delle reazioni di marcatura (ad esempio, AppCp-biotina, ligasi T4, DMSO) per massimizzare il rendimento e la risoluzione della scala di massa.
