Tracciato anatomico e funzionale combinato in vivo dei terminali del glutammato dell'area tegmentale ventrale nell'ippocampo

L'attuale protocollo analizza un metodo semplice ed economico per il tracciamento neuroanatomico ed elettrofisiologico combinato di neurocircuiti in vivo. La tecnica consente la mappatura dei terminali adiacenti da una specifica popolazione di neuroni a un sito bersaglio. Allo stesso modo, la mappa anatomica di questi terminali può essere verificata mediante stimolazione optogenetica durante la registrazione extracellulare nel sito bersaglio.

Questo protocollo può essere applicato per lo studio di più circuiti neurali associati alla funzione sensoriale, motoria e cognitiva. L'esecuzione di questa procedura richiede una certa conoscenza della chirurgia stereotassica dei roditori e della manipolazione di delicati elettrodi neurali. Il collegamento del sistema di registrazione per evitare rumori nelle registrazioni.

La dimostrazione visiva evidenzia i passaggi fondamentali per la configurazione di un sistema LED economico per l'optogenetica in vivo. Inoltre, mostra come collegare l'amplificatore con il driver LED per la registrazione sincronizzata e la stimolazione in un mouse anestetizzato. Posizionare un termoforo sul telaio stereotassico in modo che il corpo del mouse sia sdraiato su di esso, il che aiuterà a mantenere la sua temperatura corporea durante tutta la procedura, quindi fissare delicatamente la testa sull'apparato stereotassico.

Preparare l'area chirurgica pulendola prima con soluzione di iodio e poi con alcool per rimuovere lo iodio. Successivamente, applicare la lidocaina topica per bloccare la sensazione sul cuoio capelluto. Quindi, utilizzando un bisturi, praticare un'incisione sulla linea mediana che si estende dalla regione frontale a quella occipitale.

Per l'area tegmentale ventrale o l'iniezione di VTA, posizionare una siringa con ago a punta smussata ultrafine a 3,08 millimetri di coordinate anteriori posteriori e 0,5 millimetri mediali laterali rispetto al bregma. Usa uno strumento di perforazione per praticare un foro di un millimetro nel cranio alla coordinata contrassegnata. Seguire le istruzioni del produttore per fissare il supporto della siringa su un micromanipolatore e riempire la siringa con acqua distillata doppia per pulire e testare il flusso del fluido.

Quindi erogare l'acqua per testare il flusso della siringa. Scongelare aliquote di virus adeno-associato o cocktail AAV con ghiaccio. Riempire la siringa montata con 1.000 nanolitri di soluzione AAV ed erogare 10 nanolitri di soluzione per confermare il flusso del liquido.

Utilizzare il micromanipolatore per abbassare l'ago nel sito di iniezione e iniettare da 600 a 800 nanolitri di AAV nel VTA, erogando la soluzione a 60 nanolitri al minuto. Tre settimane dopo l'iniezione di AAV, fissare la testa dell'animale su un telaio stereotassico come descritto in precedenza ed eseguire una craniotomia per esporre la dura. Utilizzare uno strumento di perforazione per rimuovere parte dell'osso parietale.

Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare una punta dell'ago piegata calibro 27 per asportare la dura esposta, facendo attenzione a non separare la delicata copertura della buccia e i tessuti corticali in quest'area. Applicare gocce di liquido cerebrospinale artificiale sull'area della craniotomia per prevenire la secchezza. Praticare un foro nell'osso occipitale per tenere la vite di messa a terra e collegare un filo di terra in acciaio inossidabile.

Prima di abbassare la cannula, collegare il cavo in fibra ottica a una sorgente LED accoppiata in fibra. Abbassare la fibra ottica di 400 micrometri di diametro nel VTA alle coordinate di AP negativo 3,08 millimetri e ML 0,5 millimetri. Utilizzando un micromanipolatore, posizionare i siti di contatto dell'elettrodo nello strato di celle piramidali del CA1.

Per sincronizzare l'impulso luminoso con la registrazione neurale, collegare il driver LED e l'importazione digitale del controller di registrazione a un pulsatore logico transistor-transistor con uno splitter BNC. Regolare la manopola per determinare l'intensità effettiva in grado di generare una risposta senza produrre artefatti fotoelettrici e collegare il terreno sul cranio al suolo sull'adattatore. Collegare il preamplificatore stadio principale al controller di registrazione tramite un cavo di interfaccia periferica seriale e controllare le luci colorate a LED sulle porte del controller di registrazione.

I LED verdi e gialli indicano la tensione corretta sulla scheda dell'amplificatore collegata e il led rosso indica un controllo dello stadio della testa del software funzionante. Dopo aver avviato il software, selezionare il formato del file di dati e modificare il nome del file. Passare alla porta per lo stadio di testa collegato e fare clic su disabilita tutto sulla porta se l'elettrodo ha meno canali rispetto allo stadio di testa.

Selezionare il numero appropriato di canali da visualizzare sullo schermo. Per acquisire il timestamp TTL per la registrazione neurale sincronizzata e il timestamp attivato da impulsi luminosi, fare clic sulle importazioni digitali e abilitare il digitale in zero uno. Questo deve corrispondere al collegamento BNC sull'amplificatore importazioni digitali.

Regolare la scala temporale e la scala di tensione per la visualizzazione appropriata della forma d'onda e selezionare la frequenza di campionamento, tenendo presente che una frequenza di campionamento e un numero di canali più elevati aumenteranno la dimensione del file. Quindi, impostare la larghezza di banda dell'amplificatore per la registrazione di una singola unità. Qui è stata utilizzata una frequenza di taglio da 300 a 5.000 Hertz.

Per il suono spike, fare clic sull'audio di uscita analogica e abilitare la porta analogica. Quindi regolare il guadagno e il silenziatore per un suono ottimale. Per sincronizzare la registrazione dell'amplificatore e il treno di impulsi luminosi, fare clic sulla scheda del display e abilitare la visualizzazione del marcatore.

Passare al canale appropriato che corrisponde alla connessione BNC e ispezionare nuovamente le porte per assicurarsi che i canali di registrazione e il canale di ingresso digitale siano abilitati per acquisire picchi neurali e timestamp di impulsi luminosi. Fare clic sull'oscilloscopio degli spike per visualizzare le forme d'onda che costituiscono il treno di spike registrato continuamente. Utilizzare il mouse per impostare la soglia per la visualizzazione delle forme d'onda.

Quindi ispezionare l'RMS per determinare il livello di rumore nella registrazione. L'espressione del virus adeno-associato è stata verificata mediante imaging in immunofluorescenza di EYFP nell'area tegmentale ventrale dei topi 21 giorni dopo l'iniezione. L'imaging a fluorescenza è stato utilizzato anche per rilevare proiezioni pre-sinaptiche di glutammato VTA negli strati dell'ippocampo DG, CA3 e CA1.

Una volta rilevata l'attività di tensione extracellulare, l'attività di base è stata registrata per circa 10 minuti prima di attivare l'impulso luminoso alla frequenza desiderata. Ciò ha permesso di confrontare i tassi di attivazione o burst dei neuroni putativi CA1 prima e dopo la fotostimolazione con glutammato VTA. A sostegno di questo risultato, il confronto statistico dei tassi di attivazione della rete CA1 prima e dopo la fotostimolazione ha rivelato un aumento significativo per il periodo post-stimolazione.

La successiva analisi del treno raster per rilevare i burst ha anche mostrato un aumento del tasso di burst per i neuroni piramidali putativi CA1 dopo la fotostimolazione. La risposta alla fotosimulazione è stata identificata dalla fluorescenza delle espressioni del reporter AAV nei siti di stimolo. Inoltre, la descrizione di dovrebbe essere correlata con il sito di registrazione per le unità putative responsive.

Questo metodo può essere eseguito anche in topi svegli che svolgono compiti comportamentali. In questo caso, è necessario utilizzare sonde impiantabili croniche e cannule in fibra ottica. Questa tecnica consentirà di tracciare in modo robusto i neurocircuiti attraverso una combinazione di distribuzione terminale presinaptica nel sito bersaglio e modulazione dei terminali presinaptici per rilevare la risposta del sito bersaglio in vivo.