Name: Misurazione continua del rumore biologico in Escherichia Coli utilizzando la microscopia time-lapse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Scopri la misurazione continua del rumore biologico in Escherichia coli utilizzando la microscopia time-lapse. Questo metodo permette di analizzare i circuiti genici sintetici e valutarne le prestazioni.

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Ringraziamo il Sig. Gil Gelbert (Facoltà di Ingegneria Elettrica, Technion) per aver assistervi con il codice MATLAB. Ringraziamo il Dr. Ximing Li (Facoltà di Ingegneria bio-medica, Technion) per aver assistenza nella correzione di questo articolo. Questa ricerca è stata parzialmente supportata dalla Neubauer Family Foundation e dal Ministero della Scienza israeliano, sovvenzione 2027345.

1. Preparazione dei media e della cultura
<ol><li>Preparare una soluzione stock di 1.000x carbenicillina (50 mg/mL) o antibiotico pertinente.<ol>
<li>. Pesare 0,5 g di carbenicillina. Aggiungere 10 mL di sterile H2O. Sciogliere completamente.</li>
		<li>Sterilizzare lo stock di carbenicillina attraverso un filtro siringa da 0,22 μm. Aliquota la soluzione antibiotica e conservare a -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per preparare piatti di brodo di lisogenia (LB), mescolare 5 g di triptone, 5 g di NaCl, 2,5 g di estratto di lievito e 7,5 g di agar Bacto con 0,5 L di sterile H2O. Autoclave la soluzione a 121 °C per 20 min.<ol>
<li>Immergere parzialmente il gel-mix fuso in un bagno d'acqua a 50 °C. Aggiungere 1.000 μL di carbenicillina (50 mg/mL).</li>
		<li>Preparare le piastre di Petri in un ambiente sterile. Lasciare i piatti da impostare prima di conservarli in frigo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per i mezzi minimi M9, preparare soluzioni di stock separate delle seguenti: 5 sali M9 (56,4 g/L), 2 M di glucosio e 2% di casaminoacidi senza biotina. Autoclavare le soluzioni a 121 °C per 20 min.</li>
	<li>Per preparare 5 piastre di Petri, mescolare 1125 mg di agar a bassa fusione e 400 mg di agar con 89,2 mL di mezzi minimi (1x M9). Aggiungere 10 ml di 2% di casaminoacidi (2% [vol/vol]) in un pallone Erlenmeyer da 250 mL. NOTA: Assicurarsi di versare il supporto sulle labbra interne del pallone.</li>
	<li>Microonde la soluzione in brevi raffiche da 3 a 4 secondi. Ripetere fino a quando la soluzione non è chiara. NOTA: Assicurarsi di non raggiungere il punto di ebollizione.</li>
	<li>Mettere il pallone Erlenmeyer da 250 mL in un bagno di acqua calda (60 °C) per mescolare ulteriormente per diffusione e lasciarlo raffreddare fino a quando la sua temperatura scende a circa 45-50 °C.</li>
	<li>Accendere la fiamma sulla panca che versa la piastra.</li>
	<li>Aggiungere rapidamente tutte le soluzioni nell'ordine seguente: 800 μL di glicerolo al 50% (0,4% [vol/vol]) 100 μL di tiammina (B1) 1100 μL di glucosio (2M) 100 μL di carbenicillina (50 mg/mL).</li>
	<li>Ruotare il pallone Erlenmeyer per garantire una distribuzione uniforme di tutti gli ingredienti in tutto l'agar.</li>
	<li>Aprire un piatto alla volta accanto alla fiamma e iniziare a versare.<ol>
<li>Lasciare le piastre in panchina per qualche minuto fino alla solidificazione iniziale.</li>
		<li>Capovolgere le piastre per evitare che la condensa dell'acqua gocciola sul gel.</li>
		<li>Lasciare solidificare le piastre a temperatura ambiente per circa 2 ore.</li>
		<li>Una volta che le piastre si sono solidificate e asciugate, possono essere conservate a 4 °C per circa 3 mesi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Costruzione di ceppi batterici e plasmidi
NOTA:Il circuito genetico contiene una parte; una proteina fluorescente verde (GFP) guidata da un promotore PtetO con conseguente espressione costitutiva. Tutti i plasmidi in questo lavoro sono stati costruiti utilizzando tecniche di clonazione molecolare di base e sono stati trasformati in Escherichia coli 10β, utilizzando un protocollo standard di shocktermico 24. Il costrutto finale è stato trasformato in ceppo di tipo selvatico Escherichia coli MG1655 per i test.
<ol><li>Trasformare il plasmide desiderato in cellule Escherichia coli MG1655 con il protocollo standard di shock termico24.</li>
	<li>Far crescere le cellule trasformate su una piastra di agar LB durante la notte a 37 °C. NOTA: È possibile mantenere le piastre di Petri dal passaggio 2.2 fino a 3 giorni per l'uso in microscopia.</li>
	<li>Inoculare una singola colonia in 5 ml di brodo LB integrato con gli antibiotici pertinenti in un tubo di vetro.</li>
	<li>Far crescere le cellule a 37 °C con una velocità di scuotimento di 250 giri/min nell'incubatrice per 2 ore fino a quando il liquido non è torbido.</li>
	<li>Preparare 1 mL di soluzione di diluizione come segue: 892 μL di supporti minimi (1x M9) 8 μL di glicerolo al 50% (0,4% [vol/vol]) 100 μL di 2% di casaminoacidi (0,2% [wt/vol]) 1 μL di tiammina (B1) 11 μL di glucosio (2 M) 1 μL di antibiotici pertinenti<ol>
<li>Mescolare e girare verso il basso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluire la coltura cellulare (1:30) dal passo 2.4 in un tubo da 2 ml aggiungendo 30 μL di crescita di Escherichia coli a 1000 μL di soluzione di diluizione (fase 2.5).</li>
	<li>Incubare il tubo per 1 h con scuotimento (250 giri/min) a 37 °C.</li>
	<li>Crescere 40 μL - 60 μL su piastre M9 preparate nella fase 1.10. Incubare la piastra a 37 °C durante la notte. NOTA: La densità ottica (OD600nm)per la placcatura deve essere di circa 0,1.</li>
	<li>Posizionare fino a tre piastre inferiori in vetro da 35 mm sulla panca. NOTA: Assicurarsi che il vetro della piastra abbia lo spessore corretto per le lenti al microscopio utilizzate.</li>
	<li>Preparare la coltura per la semina su piastre di gel, ripetere i passaggi da 2.3 a 2.6 per le colonie da piastre preparate a misure al microscopio passo 2.9.</li>
	<li>Preparare la seguente soluzione per realizzare tre lastre al microscopio.<ol>
<li>Preriscaldare il bagno d'acqua a 60 °C.</li>
		<li>Mescolare 112,5 mg di agar a bassa fusione e 40 mg di agar con 8,92 ml di mezzi minimi (1x M9) e aggiungere 1 ml di 2% di casaminoacidi (0,2% [vol/vol]) in un pallone Erlenmeyer da 25 ml. NOTA: Assicurarsi di versare il supporto sulle labbra interne del pallone.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microonde la soluzione in brevi raffiche da 2 a 3 secondi. Ripetere fino a quando la soluzione non è chiara. NOTA: Assicurarsi di non raggiungere il punto di ebollizione.</li>
	<li>Mettere il pallone Erlenmeyer da 25 mL in un bagno d'acqua calda (60 °C) per mescolare ulteriormente per diffusione e lasciarlo raffreddare sul banco fino a quando la sua temperatura scende a circa 45-50 °C.</li>
</ol>3. Preparazione di tamponi di agarosio
<ol><li>Panca pulita con 70% di etanolo. Allungare il nastro sulla panca pulita. Assicurarsi che il nastro sia liscio e livellato.</li>
	<li>Preparare due coverlips: uno sul nastro e un secondo nelle vicinanze. Preparare una coverlid.</li>
	<li>Rimuovere il pallone (preparato al passaggio 2.14) dal bagno d'acqua, pulire l'esterno del pallone e lasciarlo raffreddare fino a quando la sua temperatura scende a circa 45-50 °C.</li>
	<li>Per realizzare la soluzione gel, mescolare rapidamente tutte le soluzioni nel seguente ordine: 80 μL di glicerolo al 50% (0,4% [vol/vol]) 1 mL di 2% di casaminoacidi (0,2% [wt/vol]) 10 μL di tiammina (B1) 110 μL di glucosio (2 M) 10 μL di antibiotici pertinenti.</li>
	<li>Versare 1,5 mL di gel sul coperchio e coprirlo con il secondo pezzo facendo un "sandwich".</li>
	<li>Riportare l'Erlenmeyer al bagno di acqua calda. Coprire il panino con il coperchio e impostare il timer per 20 minuti.</li>
	<li>Allo stesso tempo, incubare il tubo dal passaggio 2.11 per 1 h a 37 °C con scuotimento (250 giri/min)</li>
	<li>Dopo 20 minuti capovolgere il panino (passo 3.5), coprirlo e lasciare riposare per 1 h. NOTA: Per risultati migliori lasciare riposare il "sandwich" a 4 °C per tutta la durata del passaggio 3.8.</li>
	<li>Seme Escherichia coli coltura dal passo 3.7 pipettando il campione sul piatto da 35 mm. NOTA: Pipettare 6 μL di cellule come piccole gocce separate dà i migliori risultati.</li>
	<li>Lasciare asciugare le gocce, per almeno 15 minuti e fino a 30 minuti.</li>
	<li>Esporre il gel solidificato del sandwich dal passaggio 3.8 facendo scorrere via il coverslip.</li>
	<li>Tagliare il sandwich in piccoli cuscinetti singoli con punzone o punta in biopsia.</li>
	<li>Appoggiarlo delicatamente sul campione (fase 3.9). Lasciare il piatto per 20 minuti in panchina.</li>
</ol>4. Preparazione del campione per l'imaging di microscopia
<ol><li>Rimuovere il pallone dal bagno d'acqua dal passaggio 3.6. Pulire l'esterno del pallone e lasciare raffreddare a temperatura ambiente (25 °C). NOTA: Rimuovere il pallone al passaggio 4.1 circa 3 minuti prima della fine del timer.</li>
	<li>Versare costantemente 3 mL del gel sul perimetro della piastra con un movimento circolare. Lasciare solidificare per qualche minuto.</li>
	<li>Sigillare le piastre con nastro adesivo e perforare diversi fori con ago da 25 G. Capovolgere tutti i piatti per evitare che la condensa dell'acqua gocciola sul gel.</li>
	<li>Incubare tutti i piatti a 4 °C per 30 min per consentire la piena solidificazione prevenendo la mitosi cellulare. NOTA: Lasciare campioni a 4 °C per misurazioni successive, non più di un giorno.</li>
	<li>Avviare il microscopio per istruzioni del produttore.</li>
	<li>Trova la messa a fuoco iniziale usando l'obiettivo di amplificazione più basso e attiva il sistema di messa a fuoco automatica (AFS).</li>
	<li>Utilizzare l'olio se necessario, annegare l'obiettivo con olio e diffonderlo con attenzione spostando la piastra con un controller della piattaforma (non manualmente) e AFS può essere nuovamente inserito.</li>
	<li>Utilizzate la sezione trasversale relativa in direzione Z, seguendo il suggerimento di default per le sezioni trasversali del passo Z. NOTA: Abbiamo scattato immagini a campo luminoso ogni 5 minuti e immagini fluorescenti ogni 20 minuti. A volte la messa a fuoco deve essere regolata durante i primi 30 minuti. Il preriscaldamento della scatola dell'incubatore di microscopio e dell'olio, mentre la refrigerazione del campione tende a contribuire a ridurre la perdita iniziale di messa a fuoco.</li>
</ol>5. Analisi dei dati
NOTA: Per elaborare i dati della microscopia, abbiamo progettato un software basato su computer in MATLAB. Questo software facilita l'identificazione dei confini cellulari da immagini tiff a campo luminoso e segmenti e ordina le celle per area. L'output di questa analisi delle immagini può essere utilizzato come maschera su immagini tiff fluorescenti per derivare i livelli di intensità cellulare e annullare artefatti nel dominio fluorescente come l'alone cellulare a causa dei limiti di risoluzione del microscopio. Il software sviluppato è stato ispirato da operesimili 7,25,26,27,28,29,30 e fornisce una soluzione elegante su misura per il laboratorio.
<ol><li>Definire innanzitutto i seguenti parametri in main_code.m.<ol>
<li>Definire la cartella delle immagini di acquisizione.</li>
		<li>Definisci il periodo di tempo dell'immagine- passo del tempo del canale del campo luminoso in pochi minuti.</li>
		<li>Definire la frequenza GFP - tasso di acquisizione delle immagini GFP.</li>
		<li>Definire la risoluzione del microscopio (cioè quanti pixel sono uguali a 1 μm).</li>
		<li>Definire l'intervallo del contenitore dell'istogramma - intervallo di area delle celle. NOTA: Il processo di classificazione dei dati in base all'area cellulare è simile ai principi di gating nell'analisi dei dati della citometria del flusso. Le porte sono posizionate attorno a popolazioni di cellule con caratteristiche comuni, di solito sparse in avanti e sparse lateralmente, per isolare e quantificare queste popolazioni di interesse. La microscopia consente di gate, indagare e quantificare diversi gruppi cellulari.</li>
		<li>Definire il kernel di convoluzione (3,3): questo parametro rileva i limiti delle celle mediante soglia globale (count_cells.m). NOTA: questa configurazione è necessaria solo quando si modifica il laboratorio o il microscopio. Il software richiede che il canale di campo luminoso di ingresso sia etichettato con l'indice c1, canale di fluorescenza etichettato come c2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire main_code.m, che eseguirà automaticamente tutti gli altri script (count_cells.m, cell_growth_rate.m).<ol>
<li>Il programma segmenta automaticamente le immagini dei campi luminosi (vedere figura complementare 2-4).</li>
		<li>Combina l'immagine di segmentazione con l'immagine fluorescente (GFP) per estrarre il livello di intensità per cella.</li>
		<li>Calcola il grafico della quantità di cellule per tempo e adatta in base alla crescita esponenziale.</li>
		<li>Calcolare la deviazione media e standard (STD) per ogni intervallo di area della cella.</li>
		<li>Calcolare il rapporto segnale/rumore (SNR) per ogni intervallo di area cellulare.</li>
		<li>Tracciare e adattare la distribuzione della quantità di cellule per intensità.</li>
		<li>Calcolare il coefficiente di varianza (CV) e confrontarlo con i dati dell'analizzatore di flusso. NOTA: il software fornirà come output le immagini di segmentazione finali per la regolazione conv_kernel in una nuova cartella "cartella/Segmentata". Il software darà come output i grafici in una nuova cartella "yourfolder/Graphs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per confrontare tra gli esperimenti, utilizzare compare_experiments.m.<ol>
<li>Definire le directory per i grafici salvati e l'indirizzo per la directory \CompareResult.</li>
		<li>Eseguire il file.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo lavoro, abbiamo sviluppato un protocollo che consente il tracciamento computerico delle cellule vive di Escherichia coli, seguendo livelli di divisione e fluorescenti per un periodo di ore. Questo protocollo ci permette di quantificare le dinamiche stocastiche dei circuiti genetici in Escherichia coli misurando il CV e l'SNR in tempo reale. In questo protocollo, abbiamo confrontato i comportamenti stocastica di due circuiti diversi come mostrato nella Figura 10. È stato dimost...

La biologia sintetica è un campo multidisciplinare emerso nell'ultimo decennio e mira a tradurre i principi di progettazione ingegneristica in progettazione biologicarazionale 1,2,3,nel tentativo di raggiungere l'integrazione e l'elaborazione multi-segnale nelle cellule viventi per comprendere la scienza dibase 4,5,applicazioni diagnostiche, terapeutiche ebiotecnologiche 6,7,8,9,10. La nostra capacità di quantificare la risposta input-output dei circuiti genetici sintetici è stata rivoluzionata dai recenti progressi nella tecnologia a cella singola, tra cui l'analizzatore di flusso e l'imaging di cellule vive utilizzando la microscopia automatica time-lapse11. Un analizzatore di flusso viene spesso utilizzato per misurare la risposta di questi circuiti allo statostazionario 1,12e la microscopia invertita viene utilizzata per misurare la risposta dinamica dei circuiti genetici sintetici a livello di una singola cella3. Ad esempio, uno dei primi lavori in biologia sintetica ha comportato la costruzione di reti di oscillatori genetici in cellule viventi utilizzando cicli di feedback negativi con un ritardodi 3. Successivamente, i circuiti genetici dell'oscillatore sono stati applicati per comprendere il controllo metabolico nell'ambiente dinamico delle celluleviventi 4. La microscopia automatica time-lapse è un metodo per caratterizzare tali circuiti. Ipotizziamo che le cellule ospiti, Escherichia coli, si sincronizzino quando formano micro colonie, consentendo la misurazione del segnale e il calcolo del rumore senza tracciare relazioni esatte madre-figlia.
Il rumore è un aspetto fondamentale e intrinseco dei sistemi biologici spesso derivanti da più fonti. Si consideri, ad esempio, le reazioni biochimiche che coinvolgono segnali che provengono dal trasporto di vettori casuali discreti come la diffusione delle proteine13. Questi segnali si propagano con fluttuazioni casuali14. Altre fonti di rumore sono la disponibilità di risorse, la divisione cellulare e le variazioni delle condizioni ambientali come temperatura, umidità e pressione. I segnali biologici che si propagano nei circuiti genetici sintetici hanno spesso un rapporto segnale/rumore molto basso (SNR), che disturba le prestazioni di tali circuiti. Pertanto, la progettazione di circuiti genetici rimane uno degli aspetti più impegnativi dell'ingegneriagenetica 15. Ad esempio, a differenza della maggior parte degli approcci che calcolano solo l'espressione genica media (misurata sull'intera popolazione cellulare), la varianza del segnale misurato è considerata al fine di progettare un comportamento prevedibile attraverso reti genichesintetiche 12. Come tale, i livelli di variabilità o rumore nell'espressione proteica svolgono un ruolo dominante nella progettazione e nelle prestazioni dei circuiti genetici analogici e digitali1,16,17.
Sono stati sviluppati molti approcci per quantificare la variabilità da cellula a cellula, tra cui in Escherichia coli3,7,18. Questi metodi sono spesso utilizzati per studiare l'attivazione genica e le vie metaboliche, tuttavia con minore attenzione allo studio della dinamica del rumore stocastico, come la misurazione e la districazione di specifiche fonti di rumore, in particolare per i circuiti genetici nelle cellule viventi dove questa è unasfida fondamentale 19,20,21. Diversi fattori, entrambi ereditati dal circuito stesso (intrinseco) e derivati dalle cellule ospiti (estrinsece), possono disturbare le prestazioni continue dei circuiti genetici. In questo documento, abbiamo sviluppato un protocollo che mira a quantificare il rumore totale nelle cellule di Escherichia coli, comprese le fonti di rumore intrinseche ed estrinsece6,22. Quantificando il rumore totale e quindi valutando l'SNR23, è possibile migliorare la progettazione dei circuiti genetici. Questo metodo può essere modificato per misurare separatamente le fonti di rumore indipendenti, monitorando diverse proteinefluorescenti 6,20. Per il protocollo qui descritto, manteniamo le condizioni ambientali ben controllate e misuriamo continuamente l'attività delle cellule senza l'influenza di fattori esterni. Misuriamo il segnale dalle proteine fluorescenti in singole cellule nel tempo e contemporaneamente le immaginiamo sotto un substrato di agarosio. Le immagini risultanti vengono analizzate utilizzando il MATLAB personalizzato del laboratorio.
Idealmente, la misurazione continua dell'attività in tempo reale delle proteine fluorescenti all'interno di una cellula produrrà dati accurati attraverso la crescita e la divisione delle cellule. Tuttavia, è difficile acquisire tali dati. Ciò è dovuto alla degradazione delle proteine fluorescenti, note come foto-sbiancamento7, quando sono esposte a radiazioni nel processo di eccitazione. Inoltre, le cellule di Escherichia coli sono sensibili anche per l'eccitazione, che potrebbe portare alla fototossicità7. Entrambi i problemi limitano la quantità di cornici che possono essere acquisite e il tempo tra le acquisizioni. Anche il substrato e i tipi medi (ad esempio il brodo di licogenia) che viene utilizzato per far crescere le cellule durante l'imaging hanno un ruolo critico. Si consiglia vivamente di utilizzare un mezzo minimo, che riduce al minimo lo sfondo non fluorescente ed estende il tempo di divisione cellulare.
Inoltre, il campione deve essere preparato considerando i seguenti requisiti (1) Il basso tasso di divisione cellulare consente esposizioni meno frequenti per l'imaging da vicino del ciclo di divisione e la riduzione della probabilità di fototossicità e fotoblesaching. Abbiamo impostato il tempo di acquisizione su circa la metà del tempo di mitosi previsto (2) La bassa densità cellulare all'inizio dell'esperimento consente una migliore uniformità e tracciabilità della divisione. La densità cellulare è influenzata dal rapporto di diluizione delle cellule di Escherichia coli, che è un parametro significativo per il successo di questo protocollo e deve essere determinato per ogni laboratorio. Per stabilire il rapporto, ogni nuovo ceppo o supporto di Escherichia coli utilizzato dovrebbe essere dotato di grafici del tasso di crescita(figura complementare 1). Un rapporto appropriato è stato raggiunto se le cellule possono crescere senza ulteriori scosse dopo una breve incubazione da una densità iniziale di circa600nm di OD = 0,1. Le cellule in questa fase si divideranno solo in base alla temperatura dell'ambiente (3) Restrizione del movimento cellulare: il movimento cellulare dipende fortemente dalla compattezza del substrato (tampone di agarosio). La compattezza del substrato dipende dalla quantità di agarosio totale e dal tempo di solidificazione del gel. I gel non possono essere lasciati solidificare durante la notte a temperatura ambiente, poiché l'Escherichia coli subirà la mitosi. Altri fattori che influenzano la stabilità del substrato includono la quantità di acqua nel campione e l'umidità. Ulteriori questioni sono discusse in dettaglio nei risultati rappresentativi. Questo protocollo fornisce molti dettagli e si sposta gradualmente da un passo all'altro. Il protocollo offre una lunga stabilità per gli esperimenti di imaging e fornisce uno strumento di elaborazione delle immagini di base.

<table><tbody><tr><td>Piatto di vetro da 35 mm</td><td>opaco</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>spessore corrispondente alla lente del microscopio.</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Lonza</td><td>5004</td><td>LB preparazione</td></tr><tr><td>AHL&nbsp;</td><td>Induttore Sigma-Aldrich</td><td>K3007</td><td></td></tr><tr><td>Bacto triptone&nbsp;</td><td>BD - Becton, Dickinson e compagnia</td><td>211705</td><td>LB preperation</td></tr><tr><td>Carb</td><td>Invitrogen</td><td>10177-012</td><td>antibiotico</td></tr><tr><td>Carb</td><td>Formedium</td><td>CAR0025</td><td>antibiotico</td></tr><tr><td>Casamino acidi&nbsp;</td><td>BD - Becton, Dickinson e compagnia</td><td>223050</td><td>soluzione di media minima</td></tr><tr><td>eclipse Ti</td><td>nikon</td><td></td><td>microscopio invertito</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>soluzione di media minima</td></tr><tr><td>Glyserol</td><td>Bio-Lab</td><td>000712050100</td><td>substrato di media minimo</td></tr><tr><td>Immersol 518F</td><td>zeiss</td><td>44496000000000</td><td>olio da immersione</td></tr><tr><td>M9 soluzione salina</td><td>Soluzione minima per terreni Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio-Lab</td><td>214010</td><td>Preparazione LB</td></tr><tr><td>Noble agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5431</td><td>nastro per parafilm con substrato minimo</td></tr><tr><td></td><td>per supporti Bemis</td><td>PM-996</td><td>indicato come nastro nel testo</td></tr><tr><td>Seaplaque GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50111</td><td>substrato per supporti minimi</td></tr><tr><td>thaymine B1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0376&nbsp;</td><td>Soluzione multimediale minima</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>BD - Becton, Dickinson e compagnia&nbsp;</td><td>212750</td><td>LB preparazione</td></tr></tbody></table>

misurazione continua del rumore biologico in escherichia coli utilizzando la microscopia time-lapse

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Il protocollo qui sviluppato offre uno strumento per consentire il tracciamento informatico della divisione Escherichia coli e dei livelli fluorescenti per diverse ore. Il processo inizia attraverso lo screening per le colonie che sopravvivono su supporti minimi, supponendo che solo Escherichia coli che ospita il plasmide corretto sarà in grado di prosperare nelle condizioni specifiche. Poiché il processo di costruzione di grandi circuiti genetici, che richiedono l'assemblaggio di molte parti del DNA, è impegnativo, i componenti del circuito sono spesso distribuiti tra più plasmidi a diversi numeri di copia che richiedono l'uso di diversi antibiotici. Le mutazioni nel plasmide possono distruggere la trascrizione dei geni di resistenza agli antibiotici e interiettare con la gestione delle risorse nella cellula che porta alla necrosi. La colonia selezionata è impostata su una piastra di Petri con fondo di vetro e alcuni piani di messa a fuoco sono selezionati per il tracciamento della microscopia sia in campo luminoso che in domini fluorescenti. Il protocollo mantiene lo stato attivo dell'immagine per più di 12 ore in condizioni iniziali che non possono essere regolamentate, creando alcune difficoltà. Ad esempio, le cellule morte iniziano ad accumularsi nel campo di messa a fuoco delle lenti dopo alcune ore di imaging, il che causa l'accumulo di tossine e la sfocatura e il decadimento del segnale. L'esaurimento dei nutrienti introduce nuovi processi metabolici e ostacola la risposta desiderata del circuito. La temperatura dell'esperimento abbassa l'effettività di induttori e antibiotici, il che può danneggiare ulteriormente l'affidabilità del segnale. Il gel multimediale minimo si restringe e si asciuga e, di conseguenza, la messa a fuoco ottica cambia nel tempo. Abbiamo sviluppato questo metodo per superare queste sfide in Escherichia coli, simile ai lavori precedenti che sviluppano metodi analoghi per altri microrganismi. Inoltre, questo metodo offre un algoritmo per quantificare il rumore stocastico totale nelle celle inaltere e alterate, scoprendo che i risultati sono coerenti con le previsioni dell'analizzatore di flusso come mostrato da un coefficiente di variazione simile (CV).

Il software analizza le immagini del dominio di campo luminoso che sono bianche e nere. L'Escherichia coli sarà simile a forme oblunghe nere su uno sfondo bianco troppo bianco e la gamma dinamica di luminanza dovrebbe mostrare un picco al centro (Figura 1). Nelle immagini fluorescenti le cellule possono avere un piccolo alone, ma le singole cellule con forme oblunghe possono ancora essere risolte. Un evento di mitosi deve essere rilevato per la prima volta dopo 30 minuti. La messa a...

Questo lavoro presenta un metodo di microscopia che consente l'imaging vivo di una singola cellula di Escherichia coli per l'analisi e la quantificazione del comportamento stocastico dei circuiti genetici sintetici.

Misurazione continua del rumore biologico in Escherichia Coli utilizzando la microscopia time-lapse

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Questo protocollo nelle erbe misura continua dei circuiti genetici in E.coli e il calcolo della variabilità del segnale e del rapporto segnale-rumore nelle singole cellule batteriche per valutare le prestazioni del circuito. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è facilmente adattabile a diversi ceppi e laboratori, richiede un allenamento minimo e nessuna attrezzatura speciale ed è relativamente economico. Il rumore è un ruolo significativo nel determinare la funzionalità dei sistemi biologici.Attualmente, c'è interesse a costruire circuiti genetici su larga scala. Questi sistemi possono essere inibiti dal rumore Assicurarsi di asciugare bene i campioni, di mantenere i tamponi a freddo a quattro gradi Celsius il più a lungo possibile e di tagliare e dividere le parti con pazienza e delicatezza. Per preparare i batteri per l'analisi inoculare una singola colonia da una coltura E.coli trasfettata.Ad esempio, un circuito con un reporter GFP. In un tubo di vetro contenente cinque millilitri di brodo LB completarlo con gli antibiotici pertinenti. Far crescere le cellule a 37 gradi Celsius e 250 giri al minuto in un'incubatrice di scuotimento per due ore fino a quando il brodo non è torbido.Al termine dell'incubazione, spingi un millilitro di soluzione di diluizione in una mini micro centrifuga da due millilitri e trasferisci 30 microlitri di batteri e l'intero volume della soluzione di diluizione in un nuovo tubo da due millilitri. Quindi, incubare la coltura per un'ora con tremori prima di seminare da 40 a 60 microlitri di questa sospensione su piastre di coltura M9. Per preparare i batteri per l'analisi, inoculare una singola colonia da una coltura E.Coli trasfettata.Ad esempio, un circuito con un reporter GFP in un tubo di vetro contenente cinque millilitri di brodo LB integrati con gli antibiotici pertinenti. Far crescere le cellule a 37 gradi Celsius e 250 giri al minuto in un'incubatrice di scuotimento per due ore fino a quando il brodo non è torbido. Al termine dell'incubazione, far scendere un millilitro di soluzione di diluizione in un mini tubo di micro centrifuga a due millilitri e trasferire 30 microlitri di batteri e l'intero volume della soluzione di diluizione in un nuovo tubo da due millilitri.Quindi incubare la coltura per un'ora con tremori. Per preparare lastre al microscopio, mescolare 112,5 milligrammi di agar a bassa fusione con 40 milligrammi di agar e un millilitro di 2%casaminoacido in un pallone Erlenmeyer da 25 millilitri. Successivamente, aggiungere 8,92 millilitri di mezzo minimo sulle labbra interne di un pallone Erlenmeyer da 25 millilitri e microonde la soluzione risultante in brevi raffiche da due a tre secondi.Quindi impostare il bagno d'acqua a 55 gradi Celsius. Quando la soluzione è chiara, posizionare il pallone Erlenmeyer da 25 millilitri in un bagno d'acqua di 60 gradi Celsius e lasciare raffreddare la soluzione di agar fino a quando la sua temperatura scende a circa 45-50 gradi Celsius. Durante il raffreddamento dell'agar, pulire il banco da laboratorio con il 70% di etanolo e lisciare un pezzo di nastro da laboratorio sulla panca pulita.Posizionare una copertura di vetro scivolare sul nastro e posizionare un secondo coperchio scivolare nelle vicinanze. Aggiungere la soluzione di agar raffreddata agli antibiotici e alla soluzione appropriati. Versare 1,5 millilitri di soluzione di gel appena preparata sul coperchio del nastro e posizionare il secondo coperchio scivolare sul gel, facendo attenzione ad evitare bolle.Riportare l'Erlenmeyer al bagno di acqua calda e coprire le copertine per 20 minuti. Capovolgere la copertura scivola per un'incubazione di un'ora a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, rimuovere i coperchi dal gel secco e tagliare un piccolo tampone dall'agarosio.Durante l'incubazione, aggiungere sei goccioline di microlitri della sospensione batterica preparata in un piatto da 35 millimetri e lasciare asciugare le gocce per almeno 15-30 minuti. Quindi posizionare con cura il pad alla volta su una goccia di batteri e consentire ai campioni di impostare per 20 minuti a temperatura ambiente. Per posizionare il letto di agar senza spalmare il campione, posizionare con cura il cuscinetto fresco sulla goccia con una delicata maschiatura.Per immaginire i campioni, rimuovere il pallone dall'acqua e lasciare raffreddare la soluzione di gel alla temperatura corporea. Versare tre millimetri del gel sul perimetro della piastra del campione. Quando l'agarosio si è solidificato, sigillare la piastra con nastro adesivo e utilizzare un ago calibro 25 per infilare diversi fori nel nastro.Quindi posizionare la piastra capovolta a quattro gradi Celsius per almeno 30 minuti per consentire all'agarosio di solidificarsi completamente, prevenendo al contempo la mitosi cellulare. Entro 24 ore, utilizzare un microscopio confocale a fluorescenza per localizzare il campione all'ingrandimento più basso e attivare il sistema di messa a fuoco automatica del microscopio. Applicare l'olio sull'obiettivo appropriato e utilizzare il controller della piattaforma per spostare la piastra per stendere con cura l'olio.Quindi attivare nuovamente lo stato attivo automatico e seguire il suggerimento predefinito per le sezioni trasversali del passaggio Z per l'immagine dell'esempio. L'E.coli dovrebbe apparire come forme oblunghe nere su uno sfondo bianco nevroico. E la gamma dinamica della luminanza dovrebbe mostrare un picco al centro.Gli eventi di mitosi possono essere rilevati per la prima volta dalla microscopia a fluorescenza dopo 30 minuti. Sebbene le singole celle possano essere difficili da rilevare a basso ingrandimento. Le colture cellulari batteriche preparate con un rapporto di diluizione errato possono dimostrare un numero immutabile di cellule e i campioni preparati senza tenuta delle lastre possono presentare un eccessivo restringimento, con conseguente perdita di messa a fuoco.Le cellule possono anche indentare il gel nella loro ricerca di nutrienti, con conseguente impilamento delle cellule batteriche l'una sopra l'altra e compromettendo il monostrato cellulare, prevenendo efficacemente il rilevamento cellulare e la misurazione affidabile del segnale fluorescente. Come suggerito da questi dati, lo stadio della cella nel ciclo di divisione non influisce sul livello di rumore, poiché diversi intervalli di area dimostrano la stessa tendenza. Inoltre, non si osserva alcuna modifica sostanziale del rapporto segnale/rumore tra GFP e FPG superfold, come illustrato da questi dati rappresentativi.Quando si esegue questa procedura, fare attenzione a determinare il corretto rapporto di diluizione per il ceppo batterico utilizzato per l'esperimento. Il confronto tra il rapporto segnale/rumore di ogni circuito regolato con questa linea di base consente di scegliere il miglior circuito di prestazioni e può rivelare fenomeni interessanti

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