Name: Preconcentrazione su carta e isolamento di microvescicoli ed esosomi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 26 s
Description: Scopri il metodo XO Pad per preconcentrare e isolare microvescicole ed esosomi senza chimici o macchinari. Questo dispositivo su carta offre tassi di recupero superiori rispetto ai metodi convenzionali.

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Questo studio è stato sostenuto dalla National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee è stato sostenuto da una borsa di ricerca della Kwangwoon University nel 2019. Hyerin Kim è stata sostenuta dal "Programma di sviluppo delle competenze per gli specialisti dell'industria" del Ministero coreano del commercio, dell'industria e dell'energia (MOTIE), gestito dal Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (n. P0002397, programma HRD per la convergenza industriale di dispositivi intelligenti indossabili).

1. Fabbricazione del dispositivo
<ol><li>Definire la regione da stampare su carta utilizzando il software della stampante (Table of Materials). NOTA: Il disegno ha 12 strati con motivi di cera in cui i diametri delle aree campione circolari si restringono gradualmente da 5 a 2 mm (Figura 1A).</li>
	<li>Stampare la cera idrofobica sulle regioni designate su entrambi i lati della carta di cellulosa (Tabella dei materiali) utilizzando una stampante di cera commerciale ( Tabella deimateriali) (Figura 1B).</li>
	<li>Mettere la carta stampata in cera in un forno da laboratorio per 80 s a 120 gradi centigradi. NOTA: Questo passaggio consente alla cera di raggiungere l'interno della carta ottenendo un riflusso termico della cera stampata. Con questo protocollo di incubazione, la risoluzione del modello è di 2 mm. Quindi, fare attenzione a non stampare modelli di meno di 2 mm. Altrimenti i modelli saranno bloccati dalla cera.</li>
	<li>Tagliare la carta stampata in cera con una fresa per creare singoli dispositivi (Figura 1C).</li>
	<li>Cadere 5 l e 2 l di membrana permselective (ad es. Nafion; Tabella dei materiali) sulle aree di esempio nei livelli più a sinistra e più a destra, rispettivamente (Figura 1D).</li>
	<li>Posizionare gli strati rivestiti con la membrana permselective su una piastra calda a 70 gradi centigradi per 30 min per far evaporare il solvente a membrana permselettiva.</li>
	<li>Sigillare la superficie più esterna dello strato rivestito rivolto verso la soluzione tampone con nastro sensibile alla pressione, lasciando un piccolo foro.</li>
	<li>Piegare il singolo dispositivo stampato (ad esempio, Exo-PAD) avanti e indietro lungo le linee bianche. NOTA: piegando il dispositivo, tutte le aree campione diventano convergentmente connesse (Figura 1E). Questo design convergente focalizza le linee di campo elettrico quando la tensione viene applicata per ICP, ottenendo una preconcentrazione più intensiva dei microfonie e degli esosomi.</li>
</ol>2. Arricchimento e messa a fuoco spaziale di microvescicoli ed esosomi mediante polarizzazione della concentrazione iostico
<ol><li>Caricare 15 L del seme di microvessicolo ed exosoma (3 x 1011 particelle/mL in 0,1x fosfato tamponata salina [PBS] con 0,05% Tween 20) nelle aree campione convergenti mediante pipettaggio e attendere alcuni secondi per garantire la bagnatura completa di tutte le aree campione (Figura 1F).</li>
	<li>Posizionare due camere acriliche ad entrambe le estremità dell'Exo-PAD e bloccare l'Exo-PAD in modo sicuro con piccole clip legante per evitare lo svolgimento (Figura 1G).</li>
	<li>Riempire le camere con 110 xL di 0,1x PBS e inserire due elettrodi Ag/AgCl (Figura 1H).</li>
	<li>Applicare 30 V agli elettrodi per 20 min utilizzando un sistema di misurazione della sorgente di corrente-tensione (Tabella dei materiali). NOTA: La tensione applicata genera il fenomeno ICP e quindi preconcentra i microfonie e gli esosomi sugli strati 8 e 9 dell'Exo-PAD.</li>
</ol>3. Isolamento dei microvessicoli e degli esosomi arricchiti
<ol><li>Separare l'Exo-PAD piegato dalle camere acriliche e aprire il dispositivo per isolare i microvescicoli e gli esosomi arricchiti dagli altri strati (Figura 1I).</li>
	<li>Estrarre le aree campione nei livelli 8 e 9, in cui vengono arricchiti i microvicoli e gli esosomi, per l'analisi a valle (Figura 1J).</li>
</ol>4. Analisi della microscopia elettronica a scansione
<ol><li>Fissare i microvescicoli e gli esosomi arricchiti immergendo le aree perforate in glutaraldeide 2,5% in buffer di cacodilate di sodio da 0,1 M per 1 h e nell'1% di tetrossido di osmio in cacodilate di sodio da 0,1 M per 1 h. AVVISO: il tetrossido di Osmio è una sostanza chimica altamente velenosa e pericolosa. Poiché il tetrossido di osmio può penetrare nella plastica, deve essere conservato nel vetro. Qualsiasi trattamento di tetrossido di osmio deve essere eseguito in una cappa di fumi chimici con guanti a doppio nitrile.</li>
	<li>Disidratare i microvescoli fissi e gli esosomi con gradi ascendenti di 200 etanolo di prova (ad esempio, 50%, 70%, 90% e 100%) per 30 min ciascuno.</li>
	<li>Asciugare chimicamente il campione immergendolo in hexamethyldisilazane in un desiccatore per 30 min. AVVISO: l'hexamethyldisilazane è una sostanza chimica infiammabile e sensibile all'umidità. Deve essere conservato in un'area asciutta e ben ventilata lontana da fonti di accensione.</li>
	<li>Rivestire i microvescicoli e gli esosomi completamente essiccati con oro/palladio (20 nm) attraverso immagini di microscopia elettronica a scansione (SEM).</li>
</ol>5. Analisi del tracciamento delle nanoparticelle
<ol><li>Estrarre le aree campione nei livelli 6, 8 e 10 utilizzando un punzone di biopsia dopo 20 min di funzionamento del dispositivo.</li>
	<li>Immergi ogni area perforata in una soluzione buffer (0,1x PBS con 0,01% Tween 20).</li>
	<li>Vortice per 10 min e centrifuga per 30 s a 6.000 rpm per rimettere in sospensione i microvessi e gli esosomi arricchiti.</li>
	<li>Rimuovere le aree perforate dalla soluzione e misurare la concentrazione di microvissicoli ed esosomi da parte di uno strumento di analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) (Tabella dei materiali).</li>
</ol>

<ol><li>Edgar, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q+%26+A%3A+What+are+exosomes%2C+exactly%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Q & A: What are exosomes, exactly.</a> BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).</li>
<li>Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+exosome+isolation+and+analysis%3A+Enabling+liquid+biopsy+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).</li>
<li>Simons, M., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+-+vesicular+carriers+for+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).</li>
<li>Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+microvesicles+in+normal+physiology%2C+pathophysiology%2C+and+renal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases.</a> Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).</li>
<li>Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+devices+for+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52722(2015).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origami-paper-based+device+for+microvesicle%2Fexosome+preconcentration+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+microvesicles%3A+Extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-Free+Isolation+of+Exosomes+from+Extracellular+Vesicles+by+Microfluidic+Viscoelastic+Flows%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows.</a> ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).</li>
<li>Marczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+isolation+and+preconcentration+of+exosomes+by+ion+concentration+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization.</a> Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).</li>
<li>Livshts, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation%3A+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).</li>
<li>Chiriacò, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-chip+for+exosomes+and+microvesicles+detection+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization.</a> Sensors. 18 (10), 3175(2018).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li>
<li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrokinetic+size-based+spatial+separation+of+micro%2Fnanospheres+using+paper-based+3d+origami+preconcentrator%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator.</a> Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).</li>
<li>Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+pre-concentration+with+high+enrichment+factors+at+a+fixed+location+in+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Anche se l'Exo-PAD è stato utilizzato con successo per l'arricchimento e l'isolamento di microvicoli ed esosomi, diversi punti critici devono essere attentamente considerati: 1) il tempo di incubazione del forno e la temperatura durante la preparazione del dispositivo, 2) tempo di elaborazione, 3) applicazione di tensione con diversi numeri di strato e diametri di area campione, e 4) l'applicabilità ai campioni clinici.
Il tempo di incubazione e la temperatura indicati nel protocollo sono cond...

I microvescicoli e gli esosomi sono piccole vesciche a membrana che misurano rispettivamente 0,2 m e 30-200 nm. Essi sono secreti nell'ambiente extracellulare da diversi tipi di cellule1,2,3,4,5. Essi contengono informazioni sulle cellule parentali sotto forma di sottoinsiemi di DNA, mRNA, miRNA, proteine e lipidi, e circolano in tutto il corpo attraverso vari fluidi corporei come siero, plasma, urina, liquido cerebrospinale, liquido amniotico, e saliva6,7,8,9. Pertanto, le tecniche per un isolamento efficiente dei microviscoli e degli esosomi dai fluidi biologici possono fornire ampie opportunità nei campi della diagnosi, della prognosi e del monitoraggio in tempo reale della malattia, nonché nello sviluppo di nuove terapie.
Tuttavia, il metodo di isolamento convenzionale per microvicoli ed esosomi a base di ultracentrifugazione è estremamente dispendioso in termini di tempo e causa una significativa perdita e contaminazione del campione. Questo perché comporta diverse fasi ingombranti di pipettaggio e caricamento e lo scarto di vari reagenti con ultracentrifugazione ripetuta5,6,10,11,12.12 Inoltre, l'elevata sollecitazione di taglio indotta dall'ultracentrifugazione (100.000 x g)può causare il lisi fisico di microvessicoli ed esosomi, producendo bassi tassi di recupero (5-23%)6,13,14. Pertanto, è necessario sviluppare una tecnica di isolamento altamente efficiente e discreta per microvicoli ed esosomi per ridurre i danni e le perdite, ottenendo così tassi di recupero più elevati.
È stato sviluppato un dispositivo basato su origami (Exo-PAD) per un isolamento più semplice, più delicato ed altamente efficiente di microvescicoli ed esosomi6. Il design dell'Exo-PAD è una carta multipiegata con aree campione collegate in serie che diminuiscono gradualmente di diametro. La tecnica di polarizzazione della concentrazione di ioni (ICP), che è un fenomeno nano-elettrocinetico che preconcentra le biomolecole cariche, è stata integrata con questo design unico. L'utilizzo dell'Exo-PAD ha portato a un arricchimento quintuplicato dei microvessicoli e degli esosomi in strati specifici e al loro isolamento semplicemente aprendo il dispositivo. In questo articolo viene descritto in dettaglio Exo-PAD, dalla fabbricazione e il funzionamento complessivo del dispositivo all'analisi del relativo utilizzo, per illustrare il metodo e mostrare risultati rappresentativi6.

<table><tbody><tr><td>Elettrodi Ag/AgCl</td><td>A-M Systems, Inc.</td><td>531500</td><td></td></tr><tr><td>Albumina da siero bovino (BSA) con diametro di 0,15", Alexa Fluor 594 coniugato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A13101</td><td>BSA coniugato con Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)</td></tr><tr><td>Tampone carbonato-bicarbonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3041-50CAP</td><td>Tampone carbonato</td></tr><tr><td>Software CorelDraw (Coral Co., Canada)</td><td>Corel Corporation</td><td></td><td>Software per stampante per definire la stampa in cera regione</td></tr><tr><td>ColorQube 8870</td><td>Xerox Corporation</td><td></td><td>Stampante a cera</td></tr><tr><td>Carta per cromatografia grado 1</td><td>Whatman</td><td>3001-861</td><td>Carta di cellulosa, dimensione: 20 * 20 cm</td></tr><tr><td>Standard esosoma marcato con fluorescenza</td><td>HansaBioMed Life Sciences, Ltd.</td><td>HBM-F-PEP-100</td><td>Esosoma marcato con FITC (Ex/Em: 490/520 nm)</td></tr><tr><td>Keithley 2410 misuratore di corrente/tensione</td><td>Keithley Instruments, Inc.</td><td></td><td>Attuale&ndash; sistema di misurazione della sorgente di tensione</td></tr><tr><td>Soluzione di resina perfluorurata Nafion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31175-20-9</td><td>Membrana permselettiva, 20% in peso nella miscela di alcoli alifatici inferiori e acqua; contiene il 34% di acqua</td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>Tecnologia NanoSight Macchina</td><td></td> per <td>l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA</td></tr><tr><td>) Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH7.4)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010001</td><td></td></tr></tbody></table>

preconcentrazione su carta e isolamento di microvescicoli ed esosomi

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

I microvescoli e gli esosomi sono piccole vesciche membranose rilasciate nell'ambiente extracellulare e circolate in tutto il corpo. Poiché contengono varie biomolecole derivate dalle cellule parentali come DNA, mRNA, miRNA, proteine e lipidi, il loro arricchimento e isolamento sono passaggi critici per il loro sfruttamento come potenziali biomarcatori per applicazioni cliniche. Tuttavia, i metodi di isolamento convenzionali (ad esempio, l'ultracentrifuga) causano perdite e danni significativi ai microvescicoli e agli esosomi. Questi metodi richiedono anche più passaggi ripetitivi di ultracentrifugazione, carico e sprechezza dei reagenti. Questo articolo descrive un metodo dettagliato per fabbricare un dispositivo basato su origami (Exo-PAD) progettato per l'arricchimento efficace e l'isolamento di microvescicoli ed esosomi in modo semplice. Il design unico dell'Exo-PAD, costituito da strati multipiegati a fisarmonica con aree campione convergenti, è integrato con la tecnica di polarizzazione della concentrazione degli ioni, consentendo così l'arricchimento di cinque volte dei microvigli e degli esosomi su strati specifici. Inoltre, i microvescicoli arricchiti e gli esosomi sono isolati semplicemente dispiegando l'Exo-PAD.

Il tempo di funzionamento deve essere ottimizzato per ottenere il massimo rendimento di recupero dei microvessicoli arricchiti e degli esosomi. Tempo insufficiente non consente una sufficiente migrazione dei microvicoli e degli esosomi, che diminuisce l'arricchimento, mentre il tempo eccessivo deteriora la messa a fuoco spaziale e quindi disperde i migameni e gli esosomi. Così, attraverso la fase di ottimizzazione del tempo, è possibile identificare il massimo fattore di preconcentrazione di microvissicoli ed esosomi e l...

Presentato è un protocollo per fabbricare un dispositivo cartaceo per l'arricchimento efficace e l'isolamento di microvescicoli ed esosomi.

Preconcentrazione su carta e isolamento di microvescicoli ed esosomi

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

In questo protocollo, descriviamo un semplice metodo per fabbricare un dispositivo basato su carta chiamato XO Pad, progettato per l'arricchimento efficace in isolamento delle vescicole extracellulari. XO Pad è un semplice dispositivo in grado di pre-concentrare e isolare la vescicola extracellulare senza l'uso di sostanze chimiche o macchine di lavoro, mostrando al contempo tassi di recupero più elevati rispetto ai metodi convenzionali. Iniziare definendo l'area da stampare con il software della stampante.Il design dovrebbe avere 12 strati a cera in cui i diametri delle aree circolari del campione si restringono gradualmente da cinque a due millimetri. Quindi, stampare la cera idrofobica sulle regioni designate su entrambi i lati della carta di cellulosa. Posizionare la carta stampata in cera in un forno da laboratorio per 80 secondi a 120 gradi Celsius, quindi tagliare la carta stampata in cera con una fresa per realizzare singoli dispositivi XO Pad.Rilascia rispettivamente un cinque e due microlitri di membrana selettiva perm sulle aree campione nella maggior parte sinistra e destra della maggior parte degli strati. Posizionare gli strati codificati con la membrana selettiva perm su una piastra calda a 70 gradi Celsius per 30 minuti per evaporare il solvente. Quindi sigillare la superficie più esterna dello strato rivestito di fronte alla soluzione tampone con nastro sensibile alla pressione, lasciando un piccolo foro.Piegare il dispositivo XO Pad avanti e indietro lungo le linee bianche per collegare conver delicatamente tutte le aree campione. Pipettare 15 microlitri della microvesicola e del campione esosoma nelle aree del campione convergenti e attendere alcuni secondi per garantire una completa bagnatura. Posizionare due camere acriliche ad entrambe le estremità del pad XO e bloccarlo saldamente con piccole clip leganti per evitare lo svolgimento.Riempire le camere con 110 microlitri di 0,1X PBS e inserire due elettrodi d'argento. Quindi utilizzare un sistema di misurazione della sorgente di tensione di corrente per applicare 30 volt agli elettrodi per 20 minuti. Per isolare le microvesicelle ed esosomi arricchiti, separare il pad XO piegato dalle camere acriliche e aprire il dispositivo per isolare le particelle arricchite dagli altri strati.Perforare le aree campione negli strati otto e nove in cui le microvescicole e gli esosomi sono arricchiti per l'analisi a valle. È stato eseguito un saggio di migrazione time-lapse di microvesicelle ed esosomi etichettati fluorescentmente al fine di ottimizzare il tempo di funzionamento per il massimo recupero delle particelle arricchite. Le intensità di fluorescenza in tutte le aree campione sono state quantificate con il software ImageJ.Prima del processo di arricchimento, le microvesicelle e gli esosomi erano dispersi in tutte le aree campione con una graduale diminuzione dell'intensità. Dopo 10 minuti di elaborazione, le particelle migrarono elettro-cineticamente e una spina istantanea di pre-concentrazione apparve sullo strato sette. Quando il tempo ha raggiunto i 20 minuti, microvescicole ed esosomi erano fortemente focalizzati sugli strati otto e nove e arricchiti di cinque volte in base alle intensità di fluorescenza.L'integrità delle microvesicelle arricchite e degli esosomi nello strato otto è stata studiata con SEM. È stata inoltre analizzata la distribuzione delle dimensioni delle microvesicelle ed esosomi arricchiti.Successivamente, è stata analizzata l'effettiva concentrazione delle microvesicelle arricchite e degli esosomi sulle aree campione negli strati sei, otto e 10. Nello strato otto, le microvescicole e gli esosomi erano pre-concentrati di un fattore 5,58, ma non è stata osservata alcuna preconcentrzione evidente negli altri strati. Per garantire la riproducibilità di questa procedura, ha seguito con precisione il protocollo per il tempo e la temperatura di incubazione del forno durante la verifica del dispositivo e il tempo di funzionamento del dispositivo perché queste sono le condizioni ottimizzate.L'XO Pad può anche essere usato per separare e isolare la vescicola extracellulare da campioni ricchi di proteine, come siero o plasma, usando il tampone di carbonato. Questo protocollo può fornire uno strumento di preparazione efficiente e semplice, con le sue capacità di pre-concentrazione e isolamento necessarie per la ricerca clinica, come la diagnosi, la somministrazione di farmaci, l'immunoterapia e altre terapie.

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In questo documento vengono utilizzati dei metodi per la purificazione isolamento, e la rilevazione di esosomi, nonché le tecniche per l'analisi del loro contenuto molecolare. Questi metodi sono adattabili per l'isolamento exosome da supporti sia la cultura di cellule e fluidi biologici, e può al di là di analisi del contenuto molecolare essere utile anche per studi funzionali.

Isolamento e caratterizzazione di RNA contenenti esosomi

Dettagli Questo protocollo di un metodo per isolare vescicole extracellulari (EV), piccole particelle membranose rilasciate dalle cellule, da un minimo di 10 campioni di siero microlitri. Questo approccio elude la necessità di ultracentrifugazione, richiede solo pochi minuti di tempo di saggio, e permette l'isolamento di EVs da campioni di volumi limitati.

Dispositivi a base di carta per Isolamento e caratterizzazione di extracellulare vescicole

Il fluido biliare è una preziosa fonte di vescicole/esosomi extracellulari che contengono biomarcatori potenzialmente importanti. Questo protocollo rappresenta un metodo robusto per isolare gli esosomi dalla bile umana per ulteriori analisi, tra cui la profilazione dei miRNA.

Isolamento e Profiling di MicroRNA contenenti Esosomi da bile umana

Le vescicole extracellulari presenti nel sangue sono state suggerite come nuovi biomarcatori per varie malattie. Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento di microvescicole derivate da grandi membrane plasmatiche da campioni di sangue periferico e la loro successiva analisi mediante citometria a flusso convenzionale e Western Blotting.

Isolamento e caratterizzazione di microvescicole da sangue periferico

Qui, presentiamo un protocollo per purificare gli esosomi da siero con ridotta co-purificazione non-exosomal di proteine del sangue e del plasma. Il protocollo ottimizzato include ultrafiltrazione, trattamento con proteasi e cromatografia di esclusione di formato. Una maggiore purificazione di esosomi analisi a valle di vantaggi, tra cui più accurata quantificazione delle vescicole e caratterizzazione proteomica.

Digestione delle proteine, ultrafiltrazione e cromatografia di esclusione di formato per ottimizzare l'isolamento degli esosomi da siero e Plasma sanguigno umano

Questo è un protocollo per isolare le vesciche extracellulari del tessuto (EV) dal fegato. Il protocollo descrive un processo in due fasi che coinvolge la perfusione di collagenasi seguito da ultracentrifugazione differenziale per isolare gli EV del tessuto epatico.

Isolamento dei Tessuti Vescicoli Extracellulari dal Fegato

Questo protocollo isola le vesciche extracellulari (EV) lontano dai virioni con elevata efficienza e resa incorporando precipitazioni EV, ultracentrifugazione del gradiente di densità e cattura di particelle per consentire un flusso di lavoro semplificato e una riduzione dell'avvio volume, con conseguente preparazione riproducibile per l'uso in tutte le ricerche EV.

Purificazione dei preparati vescicoli extracellulari ad alto rendimento lontano dal virus

Questo protocollo dimostra come isolare le piccole vescicole extracellulari derivate dal cordone ombelicale umano (hUC-MSC-sEV) con una semplice impostazione da banco su scala di laboratorio. La distribuzione dimensionale, la concentrazione proteica, i marcatori sEVs e la morfologia degli hUC-MSC-sEV isolati sono caratterizzati rispettivamente dall'analisi del tracciamento delle nanoparticelle, dal saggio della proteina BCA, dal western blot e dal microscopio elettronico a trasmissione.

Un semplice metodo di filtrazione da banco per isolare piccole vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane

Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento rapido e specifico per le dimensioni delle piccole vescicole extracellulari ottimizzando le dimensioni dell'ugello di nebulizzazione dell'aria, la pressione del fluido della guaina, la pressione del flusso del campione, la tensione, il guadagno e i parametri di soglia di attivazione.

Ottimizzazione dei parametri di selezione citometrica a flusso per l'isolamento e la purificazione ad alta produttività di piccole vescicole extracellulari

Le vescicole extracellulari sono estremamente promettenti per le applicazioni biomediche, ma gli attuali metodi di isolamento richiedono molto tempo e non sono pratici per l'uso clinico. In questo studio, presentiamo un dispositivo microfluidico che consente l'isolamento diretto di vescicole extracellulari da grandi volumi di biofluidi in modo continuo con passaggi minimi.

Isolamento in un'unica fase di vescicole extracellulari da campioni di grande volume con un dispositivo microfluidico A4F biforcato

Questo protocollo descrive l'isolamento di piccole vescicole extracellulari da muscoli scheletrici murini e midollo osseo tramite digestione enzimatica e cromatografia a esclusione di dimensioni, consentendo il recupero riproducibile di frazioni arricchite da vescicole da tessuti strutturalmente complessi e a basso rendimento per l'analisi molecolare a valle.

Isolamento di piccole vescicole extracellulari da muscolo scheletrico murino e midollo osseo tramite cromatografia a esclusione di dimensioni

Scopri il metodo XO Pad per preconcentrare e isolare microvescicole ed esosomi senza chimici o macchinari. Questo dispositivo su carta offre tassi di recupero superiori rispetto ai metodi convenzionali.

Preconcentrazione su carta e isolamento di microvescicoli ed esosomi

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