Preconcentrazione su carta e isolamento di microvescicoli ed esosomi
29 aprile 2020
Presentato è un protocollo per fabbricare un dispositivo cartaceo per l'arricchimento efficace e l'isolamento di microvescicoli ed esosomi.
In questo protocollo, descriviamo un semplice metodo per fabbricare un dispositivo basato su carta chiamato XO Pad, progettato per l'arricchimento efficace in isolamento delle vescicole extracellulari. XO Pad è un semplice dispositivo in grado di pre-concentrare e isolare la vescicola extracellulare senza l'uso di sostanze chimiche o macchine di lavoro, mostrando al contempo tassi di recupero più elevati rispetto ai metodi convenzionali. Iniziare definendo l'area da stampare con il software della stampante.
Il design dovrebbe avere 12 strati a cera in cui i diametri delle aree circolari del campione si restringono gradualmente da cinque a due millimetri. Quindi, stampare la cera idrofobica sulle regioni designate su entrambi i lati della carta di cellulosa. Posizionare la carta stampata in cera in un forno da laboratorio per 80 secondi a 120 gradi Celsius, quindi tagliare la carta stampata in cera con una fresa per realizzare singoli dispositivi XO Pad.
Rilascia rispettivamente un cinque e due microlitri di membrana selettiva perm sulle aree campione nella maggior parte sinistra e destra della maggior parte degli strati. Posizionare gli strati codificati con la membrana selettiva perm su una piastra calda a 70 gradi Celsius per 30 minuti per evaporare il solvente. Quindi sigillare la superficie più esterna dello strato rivestito di fronte alla soluzione tampone con nastro sensibile alla pressione, lasciando un piccolo foro.
Piegare il dispositivo XO Pad avanti e indietro lungo le linee bianche per collegare conver delicatamente tutte le aree campione. Pipettare 15 microlitri della microvesicola e del campione esosoma nelle aree del campione convergenti e attendere alcuni secondi per garantire una completa bagnatura. Posizionare due camere acriliche ad entrambe le estremità del pad XO e bloccarlo saldamente con piccole clip leganti per evitare lo svolgimento.
Riempire le camere con 110 microlitri di 0,1X PBS e inserire due elettrodi d'argento. Quindi utilizzare un sistema di misurazione della sorgente di tensione di corrente per applicare 30 volt agli elettrodi per 20 minuti. Per isolare le microvesicelle ed esosomi arricchiti, separare il pad XO piegato dalle camere acriliche e aprire il dispositivo per isolare le particelle arricchite dagli altri strati.
Perforare le aree campione negli strati otto e nove in cui le microvescicole e gli esosomi sono arricchiti per l'analisi a valle. È stato eseguito un saggio di migrazione time-lapse di microvesicelle ed esosomi etichettati fluorescentmente al fine di ottimizzare il tempo di funzionamento per il massimo recupero delle particelle arricchite. Le intensità di fluorescenza in tutte le aree campione sono state quantificate con il software ImageJ.
Prima del processo di arricchimento, le microvesicelle e gli esosomi erano dispersi in tutte le aree campione con una graduale diminuzione dell'intensità. Dopo 10 minuti di elaborazione, le particelle migrarono elettro-cineticamente e una spina istantanea di pre-concentrazione apparve sullo strato sette. Quando il tempo ha raggiunto i 20 minuti, microvescicole ed esosomi erano fortemente focalizzati sugli strati otto e nove e arricchiti di cinque volte in base alle intensità di fluorescenza.
L'integrità delle microvesicelle arricchite e degli esosomi nello strato otto è stata studiata con SEM. È stata inoltre analizzata la distribuzione delle dimensioni delle microvesicelle ed esosomi arricchiti.
Successivamente, è stata analizzata l'effettiva concentrazione delle microvesicelle arricchite e degli esosomi sulle aree campione negli strati sei, otto e 10. Nello strato otto, le microvescicole e gli esosomi erano pre-concentrati di un fattore 5,58, ma non è stata osservata alcuna preconcentrzione evidente negli altri strati. Per garantire la riproducibilità di questa procedura, ha seguito con precisione il protocollo per il tempo e la temperatura di incubazione del forno durante la verifica del dispositivo e il tempo di funzionamento del dispositivo perché queste sono le condizioni ottimizzate.
L'XO Pad può anche essere usato per separare e isolare la vescicola extracellulare da campioni ricchi di proteine, come siero o plasma, usando il tampone di carbonato. Questo protocollo può fornire uno strumento di preparazione efficiente e semplice, con le sue capacità di pre-concentrazione e isolamento necessarie per la ricerca clinica, come la diagnosi, la somministrazione di farmaci, l'immunoterapia e altre terapie.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la fabbricazione di un dispositivo basato sulla carta chiamato XO Pad, progettato per l'arricchimento e l'isolamento efficaci di vescicole extracellulari. L'XO Pad consente la pre-concentrazione e l'isolamento senza l'uso di sostanze chimiche o macchinari, dimostrando tassi di recupero più elevati rispetto ai metodi tradizionali.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biotecnologia
- Vescicole extracellulari
Sfondo
- Le vescicole extracellulari svolgono un ruolo fondamentale nella comunicazione cellulare.
- I metodi convenzionali per l'isolamento di queste vescicole spesso prevedono procedure complesse.
- Il XO Pad offre un'alternativa più semplice per i ricercatori.
- Tassi di recupero più elevati possono migliorare lo studio delle vescicole extracellulari.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo semplice per l'isolamento di microvescicole ed esosomi.
- Migliorare i tassi di recupero rispetto alle tecniche esistenti.
- Facilitare la ricerca nella biologia delle vescicole extracellulari.
Metodi Utilizzati
- Progettazione del XO Pad con 12 strati di modelli in cera.
- Stampa di cera idrofoba su carta di cellulosa.
- Riscaldamento della carta stampata in un forno da laboratorio.
- Taglio della carta stampata con cera in dispositivi XO Pad individuali.
Risultati principali
- La XO Pad arricchisce ed isola efficacemente le vescicole extracellulari.
- Ha dimostrato tassi di recupero superiori rispetto ai metodi convenzionali.
- Processo di fabbricazione semplice, senza necessità di sostanze chimiche.
- Potenziale per applicazioni diffuse nella ricerca.
Conclusioni
- Il XO Pad è uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano le vescicole extracellulari.
- Semplifica il processo di isolamento migliorandone l'efficienza.
- Questo metodo può favorire la comprensione delle funzioni delle vescicole extracellulari.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
L'isolamento delle vescicole extracellulari rimane un collo di bottiglia nella scoperta di biomarcatori a causa della bassa resa e del danno al campione causato dai metodi convenzionali. L'Exo-PAD basato su carta consente un arricchimento libera da sostanze chimiche di microvescicole ed esosomi fino a cinque volte maggiore, migliorando il recupero e preservando l'integrità delle vescicole. Questo approccio supporta la validazione precoce degli obiettivi e lo sviluppo di saggi fornendo un flusso di lavoro scalabile e riproducibile per analisi omiche e funzionali a valle.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle ipotesi terapeutiche mediante l'analisi del carico arricchito delle vescicole.
- Valore operativo: Riduce la perdita e il danno del campione rispetto all'ultracentrifugazione, aumentando la quantità di materiale utilizzabile per la riduzione del rischio sugli obiettivi.
- Valore predittivo: Un arricchimento cinque volte superiore migliora il rilevamento del segnale nei biomarcatori a bassa abbondanza, supportando le decisioni di selezione del portafoglio.
Screening e sviluppo di saggi
- Valore scientifico: Produce preparati standardizzati e concentrati di vescicole adatti alla standardizzazione dei saggi.
- Valore operativo: Elimina la necessità di centrifughe o sostanze chimiche, semplificando il flusso di lavoro e riducendo la complessità operativa.
- Scalabilità: La struttura basata su carta consente l'elaborazione in parallelo e il riutilizzo della piattaforma su diversi tipi di campioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: I vescicoli arricchiti mantengono l'integrità per saggi funzionali successivi e per il profilo dei biomarcatori.
- Sistemi pertinenti alle malattie: Compatibile con fluidi biologici come siero o plasma quando utilizzato con tampone al carbonato, il che ne supporta la rilevanza clinica.
- Riduzione del rischio meccanicistico: L'isolamento affidabile consente una valutazione costante dei meccanismi mediati dai vescicoli in modelli preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il dispositivo Exo-PAD si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica delle ipotesi all'identificazione di composti promettenti, consentendo la preparazione affidabile di vescicole per applicazioni analitiche e funzionali a valle.
- Biologia della scoperta: Supporta la validazione funzionale del bersaglio fornendo vescicole integre per l'analisi del carico e l'interrogazione delle vie.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili essenziali per la prontezza del saggio e le campagne di screening di composti.
- Analisi: Permette la quantificazione basata sulla fluorescenza e l'analisi della distribuzione dimensionale per la valutazione comparativa delle condizioni.
- Ricerca traslazionale: Favorisce la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica attraverso la conservazione della struttura e della funzione delle vescicole.
- Riutilizzo aziendale: La fabbricazione e l'operatività semplici consentono l'adozione come piattaforma riutilizzabile tra team e progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la fiducia nella validazione degli obiettivi grazie a un recupero più elevato e all'isolamento di vescicole intatte.
- Valore operativo: Standardizza il processo di arricchimento, riduce lo spreco di reagenti ed elimina la dipendenza da attrezzature specifiche.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione riducendo i falsi negativi nel rilevamento dei biomarcatori.
- Impatto sul portafoglio: Consente un avanzamento adeguato al rischio mediante una preparazione affidabile e scalabile di vescicole per applicazioni diagnostiche e terapeutiche.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella modellazione della cera e nei principi della polarizzazione della concentrazione ionica per la fabbricazione del dispositivo.
- Necessita dell'accesso a forno da laboratorio, piastra riscaldante, taglierina e sorgente di tensione per il funzionamento.
- Richiede la standardizzazione del volume del campione, della composizione del tampone e del tempo di elaborazione tra diversi utilizzatori.
- L'adattamento a fluidi biologici viscosi potrebbe richiedere un'ottimizzazione del tampone, come la compatibilità con siero/plasma al carbonato.
- Limitazione pratica: l'arricchimento è specifico del livello (livelli 8–9), richiedendo un'accurata selezione per l'analisi successiva.
