Name: Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Impara la microiniezione di actina coniugata a rodamina in embrioni di Drosophila per studiare l'assemblaggio dei bastoncini di actina intranucleari sotto stress termico. Questo metodo consente di analizzare la risposta allo stress cellulare in vivo.

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Gli autori riconoscono con gratitudine il lavoro di Liuliu Zheng e Zenghui Xue, che hanno contribuito a pioniere di questa tecnica nel laboratorio Sokac, così come Hasan Seede che ha aiutato con l'analisi. Il lavoro per questo studio è finanziato da una sovvenzione di NIH (R01 GM115111).

<ol><li>Figard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin-mediated+Actin+Stress+Response+is+maladaptive+in+heat-stressed+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos.</a> Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).</li>
<li>Ashworth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2Fcofilin+mediates+actin+cytoskeletal+alterations+in+LLC-PK+cells+during+ATP+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).</li>
<li>Vandebrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+rod+composition+and+actin+dynamics+in+inherited+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).</li>
<li>Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+stimuli+induce+persistent+ADF%2Fcofilin-actin+rods+that+disrupt+distal+neurite+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).</li>
<li>Bamburg, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2FCofilin-actin+rods+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Alzheimer+Research%22%5BJournal%5D)">ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases.</a> Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).</li>
<li>Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+and+cofilin-actin+rods+in+alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease.</a> Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).</li>
<li>Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+actin-ADF%2Fcofilin+rods+transiently+retards+decline+of+mitochondrial+potential+and+ATP+in+stressed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22AJP%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons.</a> AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).</li>
<li>Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+nuclear-cytoplasmic+shuttling+affects+cofilin-actin+rod+formation+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress.</a> Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).</li>
<li>Iida, K., Iida, H., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+induction+of+intranuclear+actin+rods+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).</li>
<li>Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+cofilin+accompanies+heat+shock-induced+nuclear+accumulation+of+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).</li>
<li>Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+KKRKK+sequence+is+involved+in+heat+shock-induced+nuclear+translocation+of+the+18-kDa+actin-binding+protein%2C+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin.</a> Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).</li>
<li>Minamide, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+cofilin-actin+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).</li>
<li>Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin%2C+development%2C+and+nature+of+intranuclear+rodlets+and+associated+bodies+in+chicken+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons.</a> The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).</li>
<li>Feldman, M. L., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranuclear+rods+and+sheets+in+rat+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus.</a> Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).</li>
<li>Nishida, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+is+a+component+of+intranuclear+and+cytoplasmic+actin+rods+induced+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells.</a> Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).</li>
<li>Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+ADF+and+cofilin+in+intranuclear+actin+rods+of+cultured+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).</li>
<li>Xue, Z., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back-to-back+mechanisms+drive+actomyosin+ring+closure+during+Drosophila+embryo+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).</li>
<li>Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuf%2C+a+Rab11+effector%2C+maintains+cytokinetic+furrow+integrity+by+promoting+local+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization.</a> Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).</li>
<li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).</li>
<li>Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formins+filter+modified+actin+subunits+during+processive+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Formins filter modified actin subunits during processive elongation.</a> Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).</li>
<li>Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+interference+by+dsRNA+injection+into+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2477(2011).</li>
<li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+wound+assay+and+in+vivo+localization+of+epidermal+wound+response+reporters+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 81, 50750(2013).</li>
<li>Carreira-Rosario, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering+homologous+recombination+constructs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), 50346(2013).</li>
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<li>Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+properties+of+early+Drosophila+embryos+measured+by+high-speed+video+microrheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology.</a> Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).</li>
<li>Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMollinari%2C+C+%22Microinjection+and+Transgenesis%3A+Strategies+and+Protocols%22">Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols</a>. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).</li>
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<li>Powsner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+temperature+on+the+durations+of+the+developmental+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Zoology%22%5BJournal%5D)">The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster.</a> Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).</li>
<li>Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress+Orchestrates+Cell+Polarity+to+Promote+Embryonic+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing.</a> Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Il significato di questo metodo è che utilizza il protocollo ben consolidato di microiniezione negli embrioni di Drosophila 21,22, 23,24,25,26,27 per consentire nuove ricerche riguardanti l'ASR e l'assemblaggio dell'asta di actina di accompagnamento. Uno dei principali vantaggi dell...

Questo protocollo descrive come iniettare G-actinRed per visualizzare l'assemblaggio di barre di actina intranucleare in embrioni stressati dal calore che stanno subendo un'induttibile risposta allo stress actina (ASR)1. Abbiamo sviluppato questo protocollo per aiutare gli studi dell'ASR, che negli embrioni porta a morfogenesi interrotta e ridotta vitalità, e nei tipi di cellule umane adulte è associato a patologie tra cui insufficienza renale2,miopatiemuscolari 3e morbo di Alzheimer e Huntington4,5,6,7,8. Questa ASR è indotta da numerose sollecitazioni cellulari, tra cui shocktermico 9,10,11,stress ossidativo4,6,ridotta sintesi ATP12e huntingtina anomala o oligomerizzazione β-amiloide4,5,6,7,9,13,14,15,16. Un segno distintivo dell'ASR è l'assemblaggio di aste di actina aberrante nel citoplasma o nel nucleo delle cellule colpite, che è guidato dall'iperattivazione indotta dallo stress di una proteina che interagisce con l'actina, Cofilin1,5,6,10. Sfortunatamente, permangono lacune chiave in materia di conoscenze per quanto riguarda l'ASR. Ad esempio, la funzione delle aste actin non è nota. Non capiamo perché le aste si formano nel citoplasma di alcuni tipi di cellule, ma il nucleo di altri. Né è chiaro se l'ASR sia protettivo o disadattiva per cellule o embrioni sottoposti a stress. Infine, non conosciamo ancora i meccanismi dettagliati alla base dell'iperattività cofilin o dell'assemblaggio dell'asta actina. Pertanto, questo protocollo fornisce un saggio rapido e versatile per sondare l'ASR visualizzando la formazione e la dinamica dell'asta di actina nel sistema sperimentale altamente trattabile dell'embrione di mosca della frutta vivente.
Il protocollo per microiniettare G-actinRed in embrioni viventi di Drosophila è stato inizialmente sviluppato per studiare la dinamica delle normali strutture dell'actina citoplasmatica17 durante gli eventi di costruzione dei tessuti. In questi studi, abbiamo scoperto che l'iniezione di G-actinaRed non ha influito negativamente sui primi processi di sviluppo nell'embrione, tra cui citocinesi o gastrulazione17,18. Abbiamo quindi modificato il protocollo, adattando la manipolazione dell'embrione e l'iniezione G-actinRed per consentire l'imaging di aste di actina in embrioni stressati dal calore sottoposti all'ASR1. Altri metodi oltre all'iniezione di G-actinRed possono essere utilizzati per visualizzare l'actina negli embrioni. Questi metodi si basano sull'esprimere proteine fluorescenti (FP) taggate ad actina o a domini di proteine che legano l'actina, come Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP e Moesin-GFP (recensito in19). Tuttavia, l'uso di queste sonde FP richiede cautela perché possono stabilizzare o interrompere alcune strutture actina, non etichettano allo stesso modo tutte le strutture actin20e, nel caso dell'actina-GFP, sono altamente sovraespresse – problematiche per l'analisi dell'assemblaggio dell'asta che non dipende solo dallo stress, ma agisce anche nella concentrazionedipendente 1. Pertanto, G-actinRed è la sonda preferita per gli studi sulle aste negli embrioni di mosca e le grandi dimensioni dell'embrione ne consentono la facile iniezione.
Il flusso di lavoro di questo protocollo è simile ad altre consolidate tecniche di microiniezione che sono state utilizzate per iniettare proteine, acidi nucleici, farmaci e indicatori fluorescenti negli embrioni di Drosophila 21,22,23,24,25,26,27. Tuttavia, in seguito alla microiniezione di G-actinRed qui, gli embrioni sono esposti a un leggero stress termico per indurre l'ASR e l'assemblaggio intranucleare dell'asta di actina. Per i laboratori con accesso alle mosche e un impianto di iniezione, questo metodo dovrebbe essere facilmente implementabile e adattabile per specifiche linee di studio per quanto riguarda l'ASR, compresa la sua induzione da diversi stress o modulazione in contesti genetici distinti.

<table><tbody><tr><td>Adenosina trifosfato (ATP)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A23835G</td><td>Componente del tampone G Succo di</td></tr><tr><td>mela, Mott's, 64 fl oz Mott's</td><td></td><td>014800000344</td><td>Componente delle piastre di succo di mela</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>Componente delle piastre di succo di mela</td></tr><tr><td>Candeggina, PureBright Germicida, ipoclorito di sodio 6,0%</td><td>KIK International</td><td>059647210020</td><td>Per embrioni dechorionanti</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C1016500G</td><td>Componente del tampone G</td></tr><tr><td>Filtro cellulare, 70 &mu; m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>Per la raccolta di embrioni dechorionati</td></tr><tr><td>Microscopio confocale, LSM 880 a 34 canali con Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>0000001994956</td><td>Per l'imaging di aste di actina intranucleari</td></tr><tr><td>Drierite</td><td>essiccante</td><td>24001</td><td>Per l'essiccazione di embrioni Microscopio</td></tr><tr><td>da dissezione, Stereoscopio Stemi 508 con zoom 8:1</td><td>Zeiss</td><td>4350649000000</td><td>Per la sistemazione di embrioni su cuneo di agar</td></tr><tr><td>Ago da dissezione, 5 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>08965A</td><td>Per la disposizione di embrioni su cuneo di agar</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1725</td><td>Componente del tampone G</td></tr><tr><td>Nastro biadesivo, Scotch permanente, 0,5 pollici x 250 in</td><td>3M</td><td>021200010323</td><td>Per fare la colla per embrioni</td></tr><tr><td>Gabbia per la raccolta di embrioni</td><td>Genessee Scientific</td><td>59100</td><td>Per alloggiare mosche adulte e raccogliere embrioni</td></tr><tr><td>Pinzette a punta fine, pinzetta Dumont, Style 5</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>72701D</td><td>Per sistemare embrioni su cuneo di agar</td></tr><tr><td>Capillari di vetro, vetro borosillicato, sottile 1 mm x 0,75 mm</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW1004</td><td>Per microaghi</td></tr><tr><td>Olio di alocarburi 27</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H8773100ML</td><td>Per l'idratazione degli embrioni</td></tr><tr><td>Incubatrice a stadio riscaldato</td><td>Zeiss</td><td>4118579020000, 4118609020000, 4118609010000</td><td>Per imaging confocale</td></tr><tr><td>Tergicristalli per tessuti da laboratorio, KimWipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>Tergicristalli per tessuti da laboratorio</td></tr><tr><td>Microscopio ottico, Invertoskop 40C Contrasto di fase invertito microscopio, ricondizionato</td><td>Zeiss</td><td>Fuori produzione</td><td>Microscopio per iniezione</td></tr><tr><td>Metil-4-idrossibenzoato</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H36471KG</td><td>Componente delle piastre per succo di mela</td></tr><tr><td>Microiniettore, FemtoJet4x</td><td>Eppendorf</td><td>5253000025</td><td>Microiniettore</td></tr><tr><td>Micro punte per caricatore, epT.I.P.S. 20 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Per il caricamento di microaghi</td></tr><tr><td>Micromanipolatore e stadio di iniezione con quadranti x,y,z per la regolazione dell'ago</td><td>Bernard Instruments, Inc (Houston, TX)</td><td>Custom</td><td>Per l'esecuzione di microiniezioni Estrattore</td></tr> per <tr><td>micropipette, modello P-97, Flaming/Brown</td><td>Sutter Instruments</td><td>P97</td><td>Per l'estrazione di tubi capillari per realizzare microaghi</td></tr><tr><td>Vetro di copertura del microscopio 24x50-1,5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>Per il montaggio di embrioni</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio, Lilac Colorfrost, Prepulito, 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22037081</td><td>Per il montaggio di embrioni per iniezione</td></tr><tr><td>n-eptano</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3601</td><td>Componente di colla per embrioni</td></tr><tr><td>Obiettivo, 10x</td><td>Zeiss</td><td>Fuori produzione</td><td>Obiettivo 10x per microscopio per iniezione</td></tr><tr><td>Obiettivo, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS</td><td>Zeiss 4217679971711</td><td></td><td>Obiettivo ad acqua 40x per Obiettivo confocale</td></tr><tr><td>, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 per immersione in olio, acqua, olio siliconico o glicerina (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm a D=0.17mm)</td><td>Zeiss</td><td>4208529871000</td><td>Obiettivo ad immersione mista 25x per Obiettivo confocale</td></tr><tr><td>, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA</td><td>Zeiss</td><td>4207829900799</td><td>63x Obiettivo ad olio per confocale</td></tr><tr><td>Pennello, Robert Simmons Espressione E85 Appuntito Rotondo misura 2</td><td>Daler-Rowney</td><td>038372016954</td><td>Per il trasferimento di embrioni</td></tr><tr><td>Tovaglioli di carta, Kleenex Tovaglioli di carta piegati a C, bianco</td><td>Kimberly-Clark</td><td>884266344845</td><td>Per tamponare il colino cellulare</td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur, 5 3/4 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820A</td><td>Per coprire gli embrioni con olio</td></tr><tr><td>Capsula di Petri, vetro, 100 x 20 mm</td><td>Corning</td><td>3160102</td><td>Per camera di incubazione umida</td></tr><tr><td>Piastra di Petri, plastica, 60 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384092</td><td>Per piastre per succo di mela</td></tr><tr><td>Pipetta, Eppendorf Riferimento 0,5-10 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>2231000604</td><td>Per il caricamento del microago</td></tr><tr><td>Puntale per pipetta, xTIP4 250 &mu; L</td><td>Biotix</td><td>63300006</td><td>Per l'aggiunta di colla embrionale al vetrino coprioggetto</td></tr><tr><td>VWR</td><td></td><td>55411050</td><td>Per il taglio di cunei di agar, nastro adesivo, punte di pipette</td></tr><tr><td>Actina globulare coniugata con rodamina Piastrine umana (non muscolare; 4x10 &; g)</td> <td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>APHR-A</td><td>G-actin^</td></tr><tr><td>Fiala di scintillazione rossa, 20 mL Borosillicato di vetro con rivestimento in polietilene e tappi di urea Fisher</td><td>Scientific</td><td>033377</td><td>Per fare la colla per embrioni</td></tr><tr><td>Barattolo con tappo a vite, 16 once</td><td>Nalgene</td><td>000194414195</td><td>Per essiccare gli embrioni</td></tr><tr><td>Micrometro da stadio</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>602104PG</td><td>Per calibrare il volume di iniezione di G-actina</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Millipore-Sigma</td><td>840971KG</td><td>Componente dei piatti di succo di mela</td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T15031KG</td><td>Componente del lievito tampone G</td></tr><tr><td>, Lievito Lesaffre Yeast Corporation, Red Star Active Dry, 32 oz</td><td>Lesaffre Yeast Corporation</td><td>117929157002</td><td>Componente della pasta di lievito</td></tr></tbody></table>

imaging intranuclear actin rods in live heat stressed drosophila embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Lo scopo di questo protocollo è quello di visualizzare le barre di actina intranucleare che si assemblano in embrioni di melanogaster Drosophila vivi a seguito dello stress termico. Le canne Actin sono un segno distintivo di una risposta allo stress actina conservata e induttibile (ASR) che accompagna patologie umane, tra cui la malattia neurodegenerativa. In precedenza, abbiamo dimostrato che l'ASR contribuisce ai fallimenti della morfogenesi e alla ridotta vitalità degli embrioni in via di sviluppo. Questo protocollo consente di continuare lo studio dei meccanismi alla base dell'assemblaggio dell'asta di actina e dell'ASR in un sistema modello altamente suscettibile di imaging, genetica e biochimica. Gli embrioni vengono raccolti e montati su una coverlip per prepararli all'iniezione. L'actina globulare coniugata con rodamina (G-actinaRossa)viene diluita e caricata in un microneedle. Una singola iniezione viene effettuata al centro di ogni embrione. Dopo l'iniezione, gli embrioni vengono incubati a temperatura elevata e le barre di actina intranucleare vengono quindi visualizzate mediante microscopia confocale. Il recupero della fluorescenza dopo esperimenti di fotobleaching (FRAP) può essere eseguito sulle barre di actina; e altre strutture ricche di actina nel citoplasma possono anche essere immagini. Scopriamo che G-actinRed polimerizza come l'endogeno G-actina e non interferisce, da solo, con il normale sviluppo embrionale. Una limitazione di questo protocollo è che occorre fare attenzione durante l'iniezione per evitare gravi lesioni all'embrione. Tuttavia, con la pratica, iniettare G-actinaRossa negli embrioni di Drosophila è un modo rapido e affidabile per visualizzare le aste di actina e può essere facilmente utilizzato con mosche di qualsiasi genotipo o con l'introduzione di altri stress cellulari, tra cui ipossia e stress ossidativo.

Un flusso di lavoro schematico di gestione degli embrioni è illustrato nella figura 1e un calendario per un esperimento tipico è presentato nella tabella 1. Una stima per un buon risultato sperimentale è che per ogni 10 embrioni iniettati, almeno la metà degli embrioni visualizzati sarà nella fase di sviluppo corretta, integra, e mostrerà una ROBUSTA ASR con stress termico a 32 °C. Questo ASR sarà evidenziato dall'assemblaggio di barre di actina intranucleare, come mostrato...

L'obiettivo di questo protocollo è quello di iniettare l'actina globulare coniugata con rhodamina negli embrioni di Drosophila e nell'assemblaggio dell'asta di actina intranucleare dell'immagine a seguito dello stress da calore.

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Il nostro protocollo è significativo perché utilizza la tecnica consolidata della microiniezione negli embrioni di Drosophila per consentire nuove ricerche sulla risposta allo stress dell'actina e sull'assemblaggio dei bastoncelli di actina. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo studiare la risposta allo stress dell'actina in una varietà di contesti, come uno screening mutante o in diverse condizioni di stress. Un individuo che non ha mai eseguito questa tecnica prima può avere difficoltà a maneggiare gli embrioni e ad eseguire la microiniezione.Si consiglia di eseguire questi passaggi fino a quando l'utente non si sente a proprio agio. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché le fasi di manipolazione, posizionamento e montaggio degli embrioni sia per la microiniezione che per l'imaging potrebbero non essere chiare dalle sole istruzioni scritte. Preparare le coppette per la raccolta degli embrioni e le piastre per agar al succo di mela secondo le indicazioni del manoscritto.Per favorire la deposizione delle uova più generosa, allestisci delle tazze di raccolta con le mosche due giorni prima dell'esperimento. Aggiungere almeno 100 mosche femmina e 50 mosche maschio a ogni tazza di raccolta, quindi coprirla con un piatto di succo di mela. Preparare una soluzione di lavoro di G-actina rossa e conservarla in ghiaccio fino a quando non viene caricata nel microago.Lasciare che le mosche depongano gli embrioni per 30 minuti sui piatti di succo di mela con pasta di lievito a 18 gradi Celsius. Mentre le mosche sono in posa, ritagliate con una lametta uno spicchio rettangolare di succo di mela di agar di quattro x un centimetro e posizionatelo su un vetrino di 25 x 75 millimetri. Raccogliere la piastra dalla raccolta e decorioonare gli embrioni versando una soluzione di candeggina fresca sulla piastra e facendola roteare per un minuto.Inumidire le setole di un pennello con acqua distillata, quindi utilizzarlo per trasferire gli embrioni dechorionati e lavati dal cestello di raccolta sullo spicchio di agar per succo di mela preparato sul vetrino. Usa un paio di pinzette a punta sottile o un ago da dissezione per disporre 10 embrioni in linea retta lungo l'asse lungo del cuneo rettangolare per agar. Disporre gli embrioni dalla testa alla coda in modo che il loro lato dorsale sia rivolto verso il ricercatore.Tagliare mezzo centimetro dall'estremità di un puntale di pipetta P200 con una lama di rasoio e immergerlo nella colla per embrioni. Rivestire generosamente una regione di cinque millimetri lungo il bordo lungo di un vetrino coprioggetti rettangolare di 24 x 50 millimetri e lasciare asciugare la colla con la colla rivolta verso l'alto. Una volta che la colla per embrioni si è asciugata, posizionare delicatamente la colla coprioggetti con il lato rivolto verso il basso sopra la fila di embrioni allineati sull'agar, lasciando due o tre millimetri di spazio tra il bordo del vetrino coprioggetti e la fila di embrioni.Capovolgere il vetrino coprioggetti in modo che gli embrioni siano rivolti verso l'alto. Dovrebbero essere bloccati in una linea lungo un bordo lungo del vetrino coprioggetti con la loro regione ventrale rivolta verso il bordo più vicino. Metti il vetrino coprioggetti sopra 150 grammi di essiccante blu fresco in un barattolo con tappo a vite da 16 once e avvita saldamente il coperchio.Essiccare gli embrioni per 8-10 minuti, quindi rimuovere il vetrino coprioggetti dal barattolo essiccante e fissare con del nastro adesivo ogni lato corto del vetrino coprioggetti a un vetrino da microscopio con l'embrione rivolto verso l'alto. Aggiungi due o tre gocce di olio di carbonio 27 cavo con una pipetta Pasteur per coprire gli embrioni allineati e proteggerli da un'ulteriore disidratazione. Mentre gli embrioni si stanno essiccando, caricare nuovamente il surnatante rosso G-actina precedentemente preparato nel microago con una punta del microcaricatore.Fissare il microago al supporto dell'ago e serrare la vite. Posizionare il vetrino con gli embrioni montati sul tavolino del microscopio e utilizzare i controlli con microaghi per portare l'ago sullo stesso piano focale degli embrioni. Inserisci il microago nell'embrione in modo che colpisca l'embrione al centro della sua regione ventrale all'equatore dell'embrione.Quando la punta del microago è visibile all'interno del centro dell'embrione, innescare l'iniezione. Dopo l'iniezione, rimuovere lentamente il microago. Sposta il tavolino ed esegui l'iniezione sugli altri embrioni.Dopo che tutti gli embrioni sono stati iniettati, posizionare il vetrino con gli embrioni in una camera di incubazione umida e chiudere il coperchio. Rimuovere il vetrino con gli embrioni iniettati dalla camera di incubazione umida. Lavorando rapidamente, staccare delicatamente i pezzi di nastro biadesivo che sono stati utilizzati per far aderire il vetrino coprioggetti al vetrino.Incolla insieme due pezzi di nastro biadesivo lunghi 2,5 centimetri e taglia il nastro a metà nel senso della lunghezza per formare due strisce. Incollare 2/3 della lunghezza di ogni striscia di nastro adesivo sul primo vetrino coprioggetti, eliminando ogni lato degli embrioni. Lascia 1/3 delle strisce di nastro adesivo che pendono dal bordo del primo vetrino coprioggetti dove sono bloccati gli embrioni.Posiziona delicatamente un secondo vetrino coprioggetti rettangolare sopra le strisce di nastro adesivo per inserire gli embrioni tra i vetrini, allineando i bordi di 25 millimetri ma mantenendo i bordi di 50 millimetri sfalsati l'uno dall'altro di un centimetro. Verificare che il riscaldato stage è alla temperatura appropriata. E se si utilizza un microscopio invertito, aggiungere il liquido di immersione sulla lente dell'obiettivo selezionata.Posizionare con cura il sandwich del vetrino coprioggetto sul tavolino, assicurandosi che la nuova superficie di imaging sia quella a contatto con il liquido di immersione. Concentrati su un embrione in cellularizzazione, quindi passa alla modalità di acquisizione laser sul microscopio confocale e regola la potenza e il guadagno del laser, le dimensioni del fotogramma, la piastrellatura e le impostazioni di proiezione come desiderato. Scatta immagini di superficie attraverso i piani focali dei nuclei dell'embrione per trovare i bastoncelli di actina intranucleari.I bastoncelli dovrebbero apparire in più orientamenti come strisce luminose o punti all'interno dei nuclei relativamente scuri. La risposta allo stress di actina e gli embrioni stressati dal calore sono evidenti dall'assemblaggio di barre di actina intranucleari. I bastoncelli di actina appaiono in diversi orientamenti all'interno dei nuclei e possono essere ripresi attraverso diversi piani focali.In confronto, gli embrioni di controllo incubati a 18 gradi Celsius non mostrano bastoncelli di actina. La percentuale di nuclei contenenti barre può essere quantificata e gli esperimenti FRAP possono essere eseguiti sulle barre. Di seguito è mostrato un esempio di un grafico di recupero della fluorescenza per una regione sbiancata rispetto a una regione non sbiancata di un bastoncello di actina.Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che la formazione dei bastoncelli di actina dipende dalla temperatura. Per le fasi successive alla microiniezione, è fondamentale mantenere gli embrioni alla temperatura di incubazione desiderata. Dopo la microiniezione, il ricercatore può eseguire FRAP per confermare la mancanza di turnover di F-actina nei bastoncelli di actina o per quantificare i cambiamenti nel turnover di F-actina che si verificano in altre strutture ricche di actina.

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