Sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa per l'analisi dell'interazione proteina-proteina di membrana

Questo protocollo aiuterà i ricercatori a determinare in modo più accurato lo stato oligomerico nativo delle proteine di membrana utilizzando il sistema di nanoparticelle della membrana cellulare nativa in combinazione con la microscopia elettronica. Il vantaggio di questa tecnica è che fornisce dati strutturali accurati delle proteine di membrana in un ambiente nativo simile alla membrana cellulare e può essere utilizzata per la futura determinazione della struttura ad alta risoluzione. A dimostrare la procedura sarà Kyle Kroeck, un borsista post-dottorato del mio laboratorio.

Per preparare le nanoparticelle native della membrana cellulare, risospendere un grammo del pellet di membrana di interesse in 10 millilitri di tampone NCMN A.Utilizzare un omogeneizzatore Dounce di vetro per omogeneizzare il campione di membrana cellulare risospeso a 20 gradi Celsius e trasferire il campione sospeso in una provetta di polipropilene da 50 millilitri. Aggiungere la soluzione madre di polimero attivo a membrana e l'ulteriore tampone A NCMN al campione fino a una concentrazione finale del 2,5% di polimero attivo sulla membrana e agitare la soluzione per due ore a 20 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, ultracentrifugare il campione.

Durante la centrifugazione, equilibrare una colonna NTA di nichel da cinque millilitri con 25 millilitri di tampone NCMN A.At la fine della centrifugazione, trasferire il surnatante sulla colonna e utilizzare una pompa a siringa impostata su una portata di 0,5 millilitri al minuto per caricare il surnatante sulla colonna a 20 gradi Celsius. Lavare le linee della macchina per cromatografia liquida di proteine veloci con una quantità sufficiente di tampone NCMN B per lavare completamente il sistema e collegare la colonna alla macchina cromatografica. Lavare la colonna con 30 millilitri di tampone B NCMN a una portata di un millilitro al minuto e raccogliere il flusso.

Lavare la colonna con 30 millilitri di tampone C NCMN a una portata di un millilitro al minuto e raccogliere il flusso. Eluire la proteina con 20 millilitri di tampone D NCMN a una velocità di flusso di 0,5 millilitri al minuto e utilizzare un collettore di frazioni per raccogliere frazioni di un millilitro del campione, quindi conservare i campioni proteici a quattro gradi Celsius utilizzando SDS-PAGE per controllare i campioni che corrispondono ai picchi osservati sul grafico di eluizione della cromatografia liquida di proteine veloci. Per preparare le griglie di colorazione negativa, avvolgere un vetrino con carta da filtro con il lato in carbonio rivolto verso l'alto e posizionare le griglie che verranno utilizzate per la preparazione del campione sul vetrino.

Posizionare il vetrino con le griglie del microscopio elettronico nella camera di uno scaricatore di incandescenza tra i due elettrodi e riposizionare il coperchio di vetro assicurandosi che il coperchio sia centrato e ben sigillato. Azionare la macchina per la scarica a bagliore e assicurarsi che la luce viola generata dal plasma sia visibile. Quando la macchina ha finito di funzionare, attendere che la camera abbia raggiunto la pressione atmosferica prima di rimuovere il coperchio in vetro e posizionare il vetrino sul banco.

Regolare la concentrazione dei campioni di proteine purificate a circa 0,1 milligrammi per millilitro e caricare 3,5 microlitri del campione di proteine sulla griglia di carbonio spessa 10 nanometri. Dopo un minuto, utilizzare un pezzo di carta da filtro per rimuovere il liquido dalla superficie della griglia di microscopia elettronica e lavare la superficie della griglia tre volte con una goccia d'acqua da tre microlitri per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio con acqua, lavare la superficie della griglia altre due volte con tre microlitri di acetato di uranio fresco filtrato al 2% per lavaggio.

Dopo l'ultimo lavaggio con acetato di uranio, colorare la griglia con una goccia da tre microlitri di acetato di uranio fresco filtrato al 2% per un minuto. Al termine dell'incubazione, utilizzare un nuovo pezzo di carta da filtro per rimuovere la gocciolina e asciugare la griglia all'aria per almeno un minuto prima di riporre la griglia in una scatola a griglia per un uso successivo. Qui, si possono osservare immagini negative di macchie ottenute utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione, come dimostrato.

L'immagine negativa della colorazione per il campione di proteina B del canale di resistenza all'acraflavina wild-type purificato con detergente rivela una soluzione omogenea di particelle monodisperse con la proteina che mostra una struttura quaternaria trimerica ben definita. Queste strutture trimeriche corrispondono al cromatogramma di esclusione dimensionale osservato dopo la purificazione. In confronto, nell'immagine della colorazione negativa per il mutante P223G anch'esso purificato con detergente, si può osservare una soluzione eterogenea di nanoparticelle polidisperse con una propensione all'aggregazione ma senza trimeri nativi osservabili.

Questi risultati sono supportati anche dalla cromatografia ad esclusione dimensionale. Risultati simili sono stati osservati per le proteine wild-type e mutanti dopo la purificazione con il polimero attivo di membrana NCMNP11. L'uso del polimero NCMNP52 facilita la generazione di nanoparticelle native della membrana cellulare in dimensioni molto più grandi, consentendo l'imaging di più trimeri della proteina B del canale di resistenza all'acraflavina in una singola particella nativa della membrana cellulare.

Nel campione mutante, tuttavia, non si osservano particelle di trimero, anche quando si osservano le grandi chiazze a doppio strato della membrana cellulare nativa. L'analisi SDS-PAGE dei campioni di proteine purificate conferma la presenza di resistenza all'acraflavina B in tutti i campioni con una purezza superiore al 95% al peso molecolare previsto della proteina. Quando si modifica questo protocollo per altre proteine, è importante determinare sperimentalmente la quantità appropriata di frazione di membrana e la lunghezza, il tempo e la temperatura per il processo di solubilizzazione.

Se le immagini del campione rivelano una soluzione omogenea di particelle monodisperse con unità strutturali ben definite, il campione può essere utilizzato per la determinazione della struttura ad alta risoluzione con la microscopia crioelettronica.