Name: Sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa per lanalisi dellinterazione proteina-proteina di membrana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Scopri come determinare lo stato oligomerico nativo delle proteine di membrana utilizzando nanoparticelle a membrana cellulare nativa e microscopia elettronica. Questo metodo fornisce dati strutturali accurati in un ambiente simile alla membrana cellulare nativa.

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Questa ricerca è stata supportata dal fondo di avviamento VCU (a Y.G.) e dal National Institute Of General Medical Sciences del National Institutes of Health con il numero di premio R01GM132329 (a Y.G.) Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità. Ringraziamo Montserrat Samso e Kevin McRoberts per il loro generoso supporto per la registrazione video.

1. Espressione proteica
<ol><li>Inoculare 15 ml di supporti di brodo terrificante (TB) con antibiotici specifici per i plasmidi con cellule pLysS BL21(DE3) contenenti l'AcrB che esprime plasmidi in tubi da 50 ml durante la notte a 37 °C con scuotimento a 250 giri/min.</li>
	<li>Controllare la densità ottica della coltura notturna a 600 nm (OD600) e assicurarsi che sia superiore a 2,0.</li>
	<li>Diluire 5 mL di coltura cellulare in 1 L di mezzi tb contenenti antibiotici specifici per i plasmidi e incubare a 37 °C con scuotimento fino a OD600=0,8 e quindi indurre con IPTG che ha una concentrazione finale di 1 mM.</li>
	<li>Effettuare l'induzione a 20 °C con scuotimento per 20 ore.</li>
	<li>Pellet giù per le cellule utilizzando centrifugazione per 15 min a 4 °C e 4.000 x g.</li>
</ol>2.Lisi cellulare e isolamento della membrana
<ol><li>Resuspend il pellet di cellule nel tampone A(tabella 1, utilizzare DDM Buffer A o NCMNs Buffer A a seconda dello schema di purificazione che deve seguire) utilizzando 80 mL per ogni 20 g del pellet cellulare.</li>
	<li>Omogeneizzare i pellet cellulari rimescolati utilizzando un omogeneizzatore Dounce in vetro a 4 °C o se a temperatura ambiente assicurarsi di mettere sul ghiaccio subito dopo.</li>
	<li>Trasferire il campione in un becher metallico sul ghiaccio e liscire le cellule caricandole in un omogeneizzatore ad alta pressione a 4 °C e 1.500 bar.<ol>
<li>Ripetere il processo di caricamento delle cellule nell'omogeneizzatore e consentire loro di passare attraverso l'omogeneizzatore per 3-4 cicli o fino a quando il lisato inizia a chiarire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugare il lysate a 15.000 x g per 30 min a 4 °C.</li>
	<li>Raccogliere il supernatante e caricarlo in tubi ultracentrifugo e centrifuga a 215.000 x g per 1 h a 4 °C.</li>
	<li>Scartare il supernatante e raccogliere i pellet di membrana dai tubi ultracentrifugo. Conservare il pellet di membrana in eccesso a -80 °C.</li>
</ol>3. Preparazione di nanoparticelle di membrana cellulare nativa
<ol><li>Resuspend 1 g di pellet di membrana in 10 mL NCMN Buffer A(Tabella 1).</li>
	<li>Omogeneizzare il campione di membrana cellulare rimorsied con un omogeneizzatore Dounce in vetro a 20 °C.</li>
	<li>Trasferire il campione di membrana sospesa in un tubo di polipropilene da 50 ml e aggiungere la soluzione di stock di polimeri attivi a membrana e il buffer A NCMN aggiuntivo per portare il campione a una concentrazione finale del polimero attivo a membrana 2,5% (w/v) (NCMNP1-1 o NCMNP5-2). NOTA: Le soluzioni stock di polimeri attivi a membrana devono essere realizzate in acqua distillata doppia e possono essere mantenute a concentrazioni variabili, ma in genere al 10% (w/v).</li>
	<li>Agitare il campione per 2 ore a 20 °C.</li>
	<li>Caricare il campione in un ultracentrifugo e girare a 150.000 x g per 1 h a 20 °C.</li>
	<li>Mentre il campione è ultra-centrifugato iniziano ad equilibrare una colonna Ni-NTA da 5 mL con 25 mL di NCMN Buffer A.</li>
	<li>Raccogliere il supernatante al termine dell'ultracentrifugazione e caricarlo su 5 ml di colonna Ni-NTA a temperatura ambiente con una portata di 0,5 ml/min utilizzando una pompa per siringhe.</li>
	<li>Lavare le linee di cromatografia liquida proteica veloce (FPLC) con un numero sufficiente di NCMN Buffer B (Tabella 1) per sciacquare completamente il sistema e quindi collegare la colonna alla macchina FPLC.</li>
	<li>Lavare la colonna con 30 mL di NCMN Buffer B con una portata di 1 mL/min e raccogliere il flusso attraverso.</li>
	<li>Lavare la colonna con 30 mL di NCMN Buffer C (Tabella 1) con una portata di 1 mL/min e raccogliere il flusso.</li>
	<li>Elute la proteina con 20 mL di NCMNs Buffer D (Tabella 1) ad una portata di 0,5 mL/min e raccogliere il campione utilizzando un raccoglitore di frazioni e le frazioni ciascuna impostate su 1,0 mL.</li>
	<li>Conservare i campioni proteici a 4 °C.</li>
	<li>Eseguire un test di elettroforesi del gel SDS-PAGE per controllare i campioni che corrispondono ai picchi osservati sul grafico di eluizione FPLC.</li>
</ol>4. Elettroforesi gel SDS-PAGE
<ol><li>Preparare la camera di colata bloccando il vetro all'apparecchio di colata.</li>
	<li>Preparare il gel di separazione del 12% secondo la ricetta elencata nella tabella 1. NOTA: Una volta aggiunto TEMED, il gel si polimerizzerà rapidamente, quindi aggiungi questo solo una volta pronto per versare il gel.</li>
	<li>Versare il gel, lasciando 2 cm sotto il fondo del pettine per il gel impilamento.</li>
	<li>Rimuovere eventuali bolle stratificando la parte superiore del gel con isopropanolo al 100% e attendere che il gel di separazione polimerizzi.</li>
	<li>Rimuovere l'isopropanolo e lavare eventuali tracce dell'isopropanolo con acqua distillata.</li>
	<li>Preparare il gel impilamento secondo la ricetta elencata nella tabella 1. NOTA: Una volta aggiunto TEMED, il gel si polimerizzerà rapidamente, quindi aggiungi questo solo una volta pronto per versare il gel.</li>
	<li>Versare il gel impilamento sopra il gel di separazione.</li>
	<li>Aggiungere un pettine alla camera per formare i pozzi e attendere che il gel impilamento polimerizzi completamente.</li>
	<li>Posizionare 1 μL di 1 M DTT in un tubo di microcentrifugo per ogni campione di frazione che deve essere eseguito sul gel.</li>
	<li>Aggiungere anche 7 μL di tampone di carico 4x a ciascun tubo.</li>
	<li>Aggiungere 20 μL di campione dalle frazioni che devono essere eseguite sul gel a ciascun tubo di microcentrifugo.</li>
	<li>Vortice i tubi contenenti i campioni.</li>
	<li>Ruotare i tubi campione utilizzando un microcentrifugo da tavolo per 3 s e assicurarsi che tutto il campione sia tornato sul fondo dei tubi.</li>
	<li>Preparare la cella di elettroforesi in gel fissando una cassetta in gel di poliacrilammide al 12% in posizione e riempiendo le camere interne ed esterne della cella con tampone Tris-acetato-EDTA (TAE)(tabella 1).</li>
	<li>Caricare il marcatore di peso molecolare nella prima corsia del gel con il volume appropriato richiesto dalle sue istruzioni.</li>
	<li>Caricare 28 μL del campione da ciascun tubo miscelato con DTT e tampone di carico.</li>
	<li>Posizionare il coperchio della cella di elettroforesi sopra la scatola e collegare il coperchio all'alimentatore.</li>
	<li>Accendere l'alimentatore e impostarlo su 100 V e consentirgli di funzionare per 20 minuti.</li>
	<li>Dopo 20 minuti, aumentare la corrente di alimentazione a 140 V e continuare a eseguirla per altri 30-40 minuti o fino a quando la banda di carico del colorante tampone raggiunge il fondo della cassetta di gel.</li>
	<li>Dopo aver completato la macchia di elettroforesi e de-macchiare il gel per visualizzare le bande proteiche contenute all'interno del gel.</li>
</ol>5. Purificazione delle proteine con DDM
NOTA: Lo scopo di eseguire questo processo di purificazione è quello di servire da controllo per gli esperimenti che utilizzano i polimeri attivi a membrana.
<ol><li>Resuspend 6-10 g di pellet di membrana, dal passaggio 2.6, in DDM Buffer A(Tabella 1)utilizzando 5 mL/g di pellet di membrana.</li>
	<li>Omogeneizzare il campione rimescolato con un omogeneizzatore Dounce in vetro a 4 °C o se a temperatura ambiente assicurarsi di mettere sul ghiaccio subito dopo.</li>
	<li>Trasferire il campione in un tubo di polipropilene da 50 ml e aggiungere DDM e tampone DDM A aggiuntivo per portare il campione a una concentrazione finale del 2% di DDM.</li>
	<li>Agitare il campione per 2 ore a 4 °C.</li>
	<li>Caricare il campione in tubi ultracentrifugo e centrifuga per 1 h a 4 °C e 150.000 x g.</li>
	<li>Mentre il campione viene ultra-centrifugato, iniziare a preparare i 5 mL della colonna Ni-NTA lavandosi con 25 mL di tampone DDM A(tabella 1).</li>
	<li>Al termine dell'ultracentrifugazione, raccogliere il supernatante e caricarlo sulla colonna Ni-NTA da 5 ml a 4 °C con una portata di 0,5 mL/min utilizzando una pompa per siringhe.</li>
	<li>Lavare le linee FPLC con un DDM Buffer B + 0,05% DDM sufficiente (Tabella 1) per svuotare completamente il sistema e quindi collegare la colonna alla macchina FPLC.</li>
	<li>Lavare la colonna con 30 mL di DDM Buffer B + 0,05% DDM con una portata di 1 mL/min e raccogliere il flusso attraverso.</li>
	<li>Lavare la colonna con 30 mL di DDM Buffer C + 0,05% DDM (Tabella 1) con una portata di 1 mL/min e raccogliere il flusso.</li>
	<li>Elute la proteina con 20 mL di DDM Buffer D + 0,05% DDM (Tabella 1) ad una portata di 0,5 mL/min e raccogliere il flusso utilizzando un raccoglitore di frazioni e le frazioni ciascuna impostate su 1,0 mL.</li>
	<li>Selezionare le frazioni contenenti il picco di eluizione per la messa in comune e la concentrazione utilizzando un concentratore centrifugo e centrifugando a 4.000 x g e 4 °C fino a raggiungere i 500 μL.</li>
	<li>Utilizzando un loop da 500 μL caricare il campione nella macchina FPLC e quindi sulla colonna di esclusione delle dimensioni di 25 mL a 4 °C. Elute utilizzando 30 mL di DDM Buffer E + 0,05% DDM (Tabella 1) ad una portata di 0,5 mL/min e raccogliere come frazioni con le dimensioni delle frazioni impostate su 0,5 mL per frazione.</li>
	<li>Prendi le frazioni e misura la concentrazione proteica usando l'assorbanza di 280 nm per confermare la curva UV-Vis dal grafico di eluizione FPLC.</li>
	<li>Raccogliere 20 μL da ogni frazione campione che corrispondono ai picchi osservati sul grafico di eluizione FPLC e sono stati confermati accurati con il test di assorbanza.</li>
	<li>Congelare il resto di tali frazioni di campione utilizzando azoto liquido o ghiaccio secco nelle aliquote desiderate e conservare campioni proteici a -80 °C.</li>
	<li>Eseguire un test di elettroforesi del gel SDS-PAGE come descritto in precedenza per controllare i campioni che corrispondono ai picchi osservati sul grafico di eluizione FPLC.</li>
</ol>6. Preparazione negativa della griglia di macchie
<ol><li>Posizionare le griglie che verranno utilizzate per la preparazione del campione su uno scivolo di vetro avvolto in carta da filtro con il lato in carbonio rivolto verso l'alto.</li>
	<li>Posizionare lo scivolo di vetro con le griglie del microscopio elettronico nella camera di uno scaricatore di bagliore tra i due elettrodi e sostituire il coperchio di vetro assicurandosi che sia centrato e ben sigillato.</li>
	<li>Eseguire la macchina di scarico del bagliore e assicurarsi che la luce viola generata dal plasma sia visibile.</li>
	<li>Al termine della macchina, attendere che la camera abbia raggiunto la pressione atmosferica per rimuovere il coperchio di vetro e quindi riportare lo scivolo con le griglie sul banco dove verranno caricati i campioni su di essi.</li>
	<li>Regolare la concentrazione dei campioni di proteine purificate a circa 0,1 mg/mL diluendo il campione con il tampone appropriato o concentrandosi utilizzando un concentratore centrifugo.</li>
	<li>Caricare 3,5 μL di campione proteico sulla griglia di carbonio spessa 10 nm e attendere 1 minuto.</li>
	<li>Rimuovere il liquido dalla superficie della griglia EM con una carta da filtro.</li>
	<li>Lavare la superficie della griglia 3 volte captando 3 μL di goccioline d'acqua con la griglia e rimuovendo l'acqua dalla griglia con carta da filtro tra il prelievo di ogni goccia.</li>
	<li>Lavare la superficie della griglia 2 volte raccogliendo 3 goccioline di acetato di uranio fresco filtrato al 2% e rimuovere le soluzioni di lavaggio sulla griglia con carta da filtro tra il prelievo di ogni goccia.</li>
	<li>Macchiare la griglia con una goccia da 3 μL di acetato di uranio fresco filtrato al 2% per 1 min.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di acetato di uranio sulla superficie della griglia EM con carta da filtro e asciugare ad aria la griglia per almeno 1 minuto.</li>
	<li>Archiviare la griglia in una casella della griglia per l'uso successivo.</li>
</ol>7. Imaging EM
<ol><li>Caricare la griglia preparata nel supporto della griglia in un workbench sicuro.</li>
	<li>Preparare il microscopio posizionando i microscopi dewar in una scatola di polistirolo e riempire il dewar 3/4° pieno di azoto liquido.</li>
	<li>Verificare che il coperchio in gomma della finestra del microscopio lo copra e quindi caricare il dewar al microscopio posizionando i fili di rame nel dewar fino a quando non si adatta alla piattaforma.</li>
	<li>Riempire il resto del dewar con azoto liquido e posizionare un tappo sopra il dewar per coprirlo.</li>
	<li>Accendi l'alta tensione, condiziona il microscopio e attendi che il microscopio si il riscaldamento e stabilisca un livello di vuoto sicuro per l'uso.</li>
	<li>Una volta che il microscopio è pronto aprire la valvola a colonna e confermare che il fascio è presente rimuovendo il coperchio di gomma sulla finestra del microscopio.</li>
	<li>Controllare la stigmatizzazione del fascio diffondendosi in uscita regolando l'intensità del fascio. Se l'astigmatismo è presente, la trave avrà una forma ellittica mentre ci si allontana dalla traversa e la trave dovrebbe avere la stessa forma ovale su entrambi i lati.</li>
	<li>Regolare il binocolo del microscopio in modo che sia la giusta altezza e distanza secondo gli occhi dell'osservatore.</li>
	<li>Controllare il posizionamento del fascio per le modalitàRicerca , Messaa fuoco ed Esposizione pedalando in tutte e tre le modalità fino a quando la trave non è al centro in ciascuna di essi.</li>
	<li>Chiudere la valvola a colonna e procedere al caricamento del supporto della griglia nel microscopio elettronico.</li>
	<li>Regolare il microscopio in altezza eucentrica utilizzando la funzione wobbler dei microscopi e regolando il movimento dello stadio utilizzando l'asse Z fino a quando non vi è alcun movimento laterale del campione al centro.</li>
	<li>Utilizzando la modalità di ricerca a bassa dose al microscopio cercare nella griglia un'area desiderabile di ragionevole contrasto con le molecole campione presenti per concentrarsi sul campione.</li>
	<li>Concentrati sull'esempio in modalità Messa a fuoco usando una dimensione del passaggio elevata fino a quando il campione non viene visto e quindi riduci i passaggi per trovare il livello di messa a fuoco corretto.</li>
	<li>Azzerare e spegnere il fascio e quindi assicurarsi che il cuscinetto di gomma copra la finestra del microscopio.</li>
	<li>Utilizzando la modalità Esposizione prendere l'immagine dell'area della griglia desiderata per un'esposizione di 1 s a 62.000 volte l'ingrandimento e controllare l'immagine ottenuta.</li>
	<li>Al termine dell'imaging di una griglia, chiudere le valvole della colonna e rimuovere il supporto della griglia dalla colonna.</li>
	<li>Al termine dell'imaging, tutte le reti di interesse arrestano il microscopio spegnendo la potenza del filamento e rimuovendo il dewar dell'azoto liquido dal microscopio.</li>
	<li>Posizionare qualcosa per assorbire l'umidità sul supporto dove il dewar sedeva per catturare la condensa dalle bobine di rame del microscopio.</li>
	<li>Attivare la modalità Cryo Cycle e assicurarsi che la pompa turbo sia spenta.</li>
</ol>

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</ol>

Y.G è elencato come inventore del polimero attivo a membrana NCMNP5-2 e sistema NCMN.

Le interazioni proteina-proteina sono importanti per l'integrità della struttura e della funzione delle proteine di membrana. Sono stati sviluppati molti approcci per studiare le interazioni proteina-proteina. Rispetto alle proteine solubili, le proteine di membrana e i loro IPP sono più difficili da studiare a causa delle proprietà intrinseche uniche delle proteine di membrana. Questa difficoltà deriva principalmente dal requisito che le proteine di membrana siano incorporate in un ambiente bistrato lipidico nativo per ...

Le interazioni proteina-proteina (PPI) svolgono un ruolo fondamentale in tutta la biologia, dal mantenimento della struttura e della funzione delle proteine alla regolazione di interi sistemi. Gli IPP sono disponibili in molte forme diverse e possono essere classificati in base ai tipi di interazioni che formano. Una di queste categorizzazioni è omooligomerica o eterooligomerica, basata sul fatto che le interazioni siano tra subunità identiche o proteine diverse che agiscono come subunità. Un'altra categorizzazione si basa sulla forza dell'interazione se le interazioni portano alla formazione di complessi stabili o stati complessi transitori. Le informazioni strutturali sugli IPP tra le proteine sono cruciali per comprendere il meccanismo con cui le proteine svolgono la loro funzione. È stato stimato che oltre l'80% delle proteine si basa su una formazione complessa al fine di svolgere i loro ruoli funzionali1. Data la percentuale di proteine osservate che dipendono dagli IPP per un corretto funzionamento innato, il loro significato in biologia è facilmente evidente, ma essere in grado di indagare correttamente le proteine che si impegnano in queste interazioni è rimasto impegnativo a causa dei limiti nelle tecniche disponibili per osservare sperimentalmente quando le proteine formano IPP.
C'è un alto grado di disaccordo tra i risultati per molti IPP determinati sperimentalmente a causa dell'elevata quantità di rumore, falsi positivi e falsi negativi che derivano da molte delle tecniche di determinazione PPI attualmente disponibili. Ciò è particolarmente vero per il sistema bi-ibrido di lievito (Y2H), la spettrometria di purificazione di purificazione tandem-massa (TAP-MS) e il trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza (FRET), che rappresentano tre dei metodi più comunemente utilizzati per la determinazione PPI2,3,4,5,6,7. In confronto, le tecniche di biologia strutturale delle proteine, come la risonanza magnetica nucleare (NMR), la cristallografia a raggi X e la microscopia elettronica (EM), possono essere utilizzate per ottenere informazioni strutturali ad alta risoluzione sulle interazioni proteina-proteina fino al livello atomico e consentire la conferma visiva diretta delle interazioni che si verificano per una proteina bersaglio di interesse. Tutte le tecniche di ricerca di determinazione PPI non basate sulla struttura attualmente disponibili (ad esempio, Y2H, TAP-MS e FRET) mancano di questa capacità e soffrono inoltre di difficoltà nell'identificare interazioni deboli e transitorie tra proteine5. Queste carenze sono ulteriormente migliorate quando si studiano le proteine di membrana a causa della complessità aggiunta portata dalla variabile aggiuntiva dell'ambiente lipidico che influenza la formazione di una corretta struttura quaternaria e assemblaggio complesso eteromerico.
Le proteine di membrana covano gran parte del proteoma e sono note per svolgere molti ruoli cruciali nel corretto funzionamento cellulare all'interno di tutti gli organismi viventi. Nonostante si stima che le proteine di membrana costituiscano il 27% del genoma umano e costituiscano ~ 60% di tutti gli attuali obiettivifarmacologici,c'è una grande anomalia nel numero di modelli risolti per le proteine di membrana che costituiscono solo ~ 2,2% di tutte le strutture proteichepubblicate 8,9,10. La causa principale della discrepanza nella disponibilità di informazioni strutturali risiede nelle proprietà intrinseche delle proteine di membrana stesse. A causa della loro scarsa solubilità, della dipendenza dalle interazioni con un ambiente lipidico per mantenere la struttura e la funzione nativa e di varie proprietà fisicochimiche della membrana lipidica stessa, le proteine di membrana continuano a rappresentare un problema sostanziale quando implementano tecniche di biologia strutturale per studiarle. Di queste proprietà intrinseche, la più importante per ottenere informazioni strutturali accurate è il requisito di avere interazioni con il loro ambiente lipidico naturale per mantenere la loro struttura e funzione nativa. L'ambiente lipidico è parte integrante della struttura e della funzione delle proteine di membrana che il concetto di memteina (una combinazione delle parole membrana e proteina) è stato proposto come unità fondamentale della struttura membrana-proteina e dellafunzione 11. Nonostante l'importanza delle interazioni lipidico-proteina, le tecniche di determinazione PPI attualmente disponibili a base di struttura spesso richiedono che le proteine studiate siano solubili o solubilizzate con detergenti. L'esposizione a detergenti aggressivi può denaturare le proteine o causare falsi positivi e negativi a causa della delipidazione, che può indurre aggregazione, denaturazione delle proteine, dissociazione di interazioni non covalenti e formazione di stati oligomerici artificiali. A causa della necessità di mantenere un ambiente lipidico naturale per una determinazione accurata dello stato oligomerico nativo delle proteine di membrana abbiamo sviluppato un sistema di nanoparticelle di membrana a cellule native (NCMN)12 basato sul metodo Styrene Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13 precedentemente riportato.
SMALP utilizza il copolimero dell'acido maleico stirene come polimero attivo di membrana per estrarre e solubilizzare le proteine della membrana. Il poli(acido stirene-co-maleico) (SMA) è un polimero anfifilo unico per la sua moietà di stirene idrofobica e la moietà dell'acido maleico idrofilo diametralmente opposta. Forma nanoparticelle adsorbendo, destabilizzando e interrompendo la membrana cellulare in un meccanismo dipendente dal pH14. Questa attività funzionale di SMA è ciò che consente di utilizzarla come sistema privo di detergenti per l'estrazione e la solubilizzazione delle proteine di membrana. Il sistema NCMN è distinto dal sistema SMALP sotto diversi aspetti. La caratteristica più unica del sistema NCMN è che ha una libreria di polimeri attivi a membrana con una moltitudine di polimeri che hanno proprietà uniche che li rendono adatti all'isolamento di molte diverse proteine di membrana che richiedono condizioni diverse per la stabilità e il funzionamento nativo. Il sistema NCMN ha anche protocolli diversi rispetto al metodo SMALP quando si tratta di preparare le nanoparticelle. Uno di questi esempi è che gli NCMN utilizzano una purificazione della colonna di affinità al nichel a passo singolo per la determinazione della struttura ad alta risoluzione; l'effetto di questi diversi protocolli può essere osservato quando si confronta il protocollo NCMN, che ha generato strutture crio-EM AcrB 3.2 e 3.0 Å, con uno studio simile utilizzando il metodo SMALP, che ha portato a una struttura crio-EM AcrB con una risoluzione 8.8 Å12,15. Queste caratteristiche uniche del sistema NCMN sono i miglioramenti apportati al metodo SMALP precedentemente stabilito e lo rendono un candidato ideale per lo studio degli IPP.
Il trasportatore multifarmaco Efflux AcrB esiste come omotrimero funzionale in E. coli12. Un'analisi mutagena ha suggerito che una singola mutazione puntino P223G, situata su un circuito responsabile della stabilità del trimer AcrB, destabilizza lo stato del trimer e produce un monomero AcrB quando preparato con il detergente DDM, che potrebbe essere rilevato con elettroforesi del gel blu nativo16. Tuttavia, l'analisi FRET del mutante AcrB-P223G suggerì che quando nell'ambiente bistrato lipidico della membrana cellulare nativa, la maggior parte dell'AcrB-P223G mutante esisteva ancora come trimestre e che i livelli di espressione sia per il tipo selvaggio AcrB che per L'AcrB-P223G sono simili. Tuttavia, nonostante i risultati dell'analisi FRET, un test di attività per il trasportatore mutante ha mostrato che l'attività è diminuita drasticamente rispetto al tiposelvaggio 16. Sebbene la tecnologia FRET sia stata popolarmente utilizzata per l'analisi delle interazioni proteina-proteina, la ricerca ha dimostrato che può spesso dare falsi positivi17,18,19,20.
Recentemente, sono state determinate strutture crio-EM ad alta risoluzione del trimer AcrB che hanno mostrato l'interazione di AcrB con il suo bistrato lipidico a membrana cellulare nativa associata attraverso l'uso delle NCMN12. In linea di principio, gli NCMN possono essere facilmente utilizzati per l'analisi delle interazioni proteina-proteina trovate sulla membrana cellulare nativa. In un test di questo sistema, sono stati effettuati esperimenti per osservare direttamente lo stato oligomerico di AcrB-P223G con l'uso di nanoparticelle di membrana cellulare nativa e microscopia elettronica di colorazione negativa. Al fine di confrontare con le nanoparticelle AcrB di tipo selvatico, abbiamo utilizzato lo stesso polimero attivo a membrana (SMA2000 realizzato nel nostro laboratorio, che è indicizzato come NCMNP1-1 nella libreria NCMN) utilizzato per la determinazione della struttura crio-EM ad alta risoluzione di AcrB e polimeri alternativi trovati nella libreria NCMNs12. Sulla base dei risultati precedentemente riportati, ci si aspettava che la maggior parte del mutante AcrB-P223G esistesse sotto forma di nanoparticelle di membrana cellulare nativa trimerica21. Tuttavia, nel campione non sono stati trovati trimer AcrB, come quelli osservati con il tipo selvaggio AcrB. Ciò suggerisce che la maggior parte dell'AcrB-P223G non forma trimer sulla membrana cellulare nativa come suggerito in precedenza.
Qui riferiamo un'analisi dettagliata del mutante E. coli AcrB-P223G in confronto al tipo selvatico E. coli AcrB utilizzando le NCMN. Questo caso di studio dell'AcrB suggerisce che gli NCMN sono un buon sistema per l'analisi dell'interazione proteina-proteina.

<table><tbody><tr><td><forte>Sostanze chimiche</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% acrilammide/BIS SOL (37,5:1)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0158</td><td></td></tr><tr><td>4x tampone per campioni Laemmli (tampone di caricamento)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>acido acetico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A38S-212</td><td></td></tr><tr><td>persolfato di ammonio (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Goldbio</td><td>C-105-5</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 polvere proteica</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Ditiotreitolo) (> puro al 99%) Senza proteasi</td><td>Goldbio</td><td>DTT10</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Affymetrix</td><td>17525 1 KG</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Goldbio</td><td>I2481C100</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Goldbio</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AA3622636</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetiletilendiammina (EDTA)</td><td>Merck</td><td>8.03779.0100</td><td></td></tr><tr><td>NCMNS-P5-2</td><td>Non ancora disponibile in commercio</td><td>Invia la richiesta per ottenerlo all'autore</td><td></td>corrispondente</tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>SMA2000</td><td>Cray Valley</td><td>Invia la richiesta per l'ottenimento all'autore</td><td></td> corrispondente</tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Goldbio</td><td>TCEP25</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Brodo Media</td><td>Affymetrix</td><td>75856 1 KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0719</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di uranile</td><td>Ambinter Ambb22348393</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26S XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td>B14538</td><td></td></tr><tr><td>Avanti JXN-30</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34193</td><td></td></tr><tr><td>Griglie per microscopio elettronico al carbonio (10 nm)</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Sciences CF300-Cu-TH</td> Omogeneizzatore tissutale Con-Torque <td></td></tr><tr><td></td><td>Eberbach</td><td>E7265</td><td></td></tr><tr><td>Corning LSE Mini Microcentrifuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>07-203-954</td><td></td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C3</td> Collettore di frazioni <td>di avezina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F9-R</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29003875</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8004</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spettrofotometro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN LL-IM-12AB</td><td></td></tr><tr><td>PELCO easiGlow Glow Glow Discharge Cleaning System</td><td>Ted Pella</td><td>91000S-230</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem Macinatura sicura Grinder per tessuti</td><td>Wheaton</td><td>358013</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Alimentatore di base</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>Razel R99-E Pompa</td> <td>a siringa a velocità variabileRazel Scientific Instruments Superdex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai F20 200kV</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tipo 70 Ti Rotore ad angolo fisso</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>General Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Provette per microcentrifuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>AKTA pure 25 L1 FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29018225</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)pLysS Cells</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C606003</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Tubo da centrifuga conico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap HP 5 Colonna ml</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17524802</td><td></td></tr><tr><td>pET-24a</td><td>EMD Biosciences</td><td>69749-3</td><td></td></tr></tbody></table>

sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa per l'analisi dell'interazione proteina-proteina di membrana

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Le interazioni proteina-proteina nei sistemi a membrana cellulare svolgono un ruolo cruciale in un'ampia gamma di processi biologici, dalle interazioni cellula-cellula alla trasduzione del segnale; dal rilevamento dei segnali ambientali alla risposta biologica; dalla regolazione metabolica al controllo dello sviluppo. Informazioni strutturali accurate sulle interazioni proteina-proteina sono cruciali per comprendere i meccanismi molecolari dei complessi proteici di membrana e per la progettazione di molecole altamente specifiche per modulare queste proteine. Sono stati sviluppati molti approcci in vivo e in vitro per il rilevamento e l'analisi delle interazioni proteina-proteina. Tra questi l'approccio della biologia strutturale è unico in quanto può fornire informazioni strutturali dirette sulle interazioni proteina-proteina a livello atomico. Tuttavia, l'attuale biologia strutturale delle proteine di membrana è ancora in gran parte limitata ai metodi a base di detergenti. Il principale svantaggio dei metodi a base di detergenti è che spesso dissociano o denaturano i complessi proteici della membrana una volta che il loro ambiente bistrato lipidico nativo viene rimosso dalle molecole di detergente. Abbiamo sviluppato un sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa per la biologia strutturale delle proteine di membrana. Qui, dimostriamo l'uso di questo sistema nell'analisi delle interazioni proteina-proteina sulla membrana cellulare con un caso di studio dello stato oligomerico di AcrB.

Utilizzando le procedure qui presentate, sono stati purificati campioni di tipo selvatico E. coli AcrB e AcrB-P223G mutante E. coli. I campioni sono stati quindi adsorbiti alle griglie di microscopia elettronica a macchia negativa di carbonio e macchiati usando acetato di uranile con il metodo di soffiatura laterale22. Le immagini delle macchie negative sono state raccolte usando la microscopia elettronica a trasmissione. L'immagine di macchia negativa per il campione di tipo sel...

Presentato qui è un protocollo per la determinazione dello stato oligomerico delle proteine di membrana che utilizza un sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa in combinazione con la microscopia elettronica.

Sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa per l'analisi dell'interazione proteina-proteina di membrana

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Questo protocollo aiuterà i ricercatori a determinare in modo più accurato lo stato oligomerico nativo delle proteine di membrana utilizzando il sistema di nanoparticelle della membrana cellulare nativa in combinazione con la microscopia elettronica. Il vantaggio di questa tecnica è che fornisce dati strutturali accurati delle proteine di membrana in un ambiente nativo simile alla membrana cellulare e può essere utilizzata per la futura determinazione della struttura ad alta risoluzione. A dimostrare la procedura sarà Kyle Kroeck, un borsista post-dottorato del mio laboratorio.Per preparare le nanoparticelle native della membrana cellulare, risospendere un grammo del pellet di membrana di interesse in 10 millilitri di tampone NCMN A.Utilizzare un omogeneizzatore Dounce di vetro per omogeneizzare il campione di membrana cellulare risospeso a 20 gradi Celsius e trasferire il campione sospeso in una provetta di polipropilene da 50 millilitri. Aggiungere la soluzione madre di polimero attivo a membrana e l'ulteriore tampone A NCMN al campione fino a una concentrazione finale del 2,5% di polimero attivo sulla membrana e agitare la soluzione per due ore a 20 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, ultracentrifugare il campione.Durante la centrifugazione, equilibrare una colonna NTA di nichel da cinque millilitri con 25 millilitri di tampone NCMN A.At la fine della centrifugazione, trasferire il surnatante sulla colonna e utilizzare una pompa a siringa impostata su una portata di 0,5 millilitri al minuto per caricare il surnatante sulla colonna a 20 gradi Celsius. Lavare le linee della macchina per cromatografia liquida di proteine veloci con una quantità sufficiente di tampone NCMN B per lavare completamente il sistema e collegare la colonna alla macchina cromatografica. Lavare la colonna con 30 millilitri di tampone B NCMN a una portata di un millilitro al minuto e raccogliere il flusso.Lavare la colonna con 30 millilitri di tampone C NCMN a una portata di un millilitro al minuto e raccogliere il flusso. Eluire la proteina con 20 millilitri di tampone D NCMN a una velocità di flusso di 0,5 millilitri al minuto e utilizzare un collettore di frazioni per raccogliere frazioni di un millilitro del campione, quindi conservare i campioni proteici a quattro gradi Celsius utilizzando SDS-PAGE per controllare i campioni che corrispondono ai picchi osservati sul grafico di eluizione della cromatografia liquida di proteine veloci. Per preparare le griglie di colorazione negativa, avvolgere un vetrino con carta da filtro con il lato in carbonio rivolto verso l'alto e posizionare le griglie che verranno utilizzate per la preparazione del campione sul vetrino.Posizionare il vetrino con le griglie del microscopio elettronico nella camera di uno scaricatore di incandescenza tra i due elettrodi e riposizionare il coperchio di vetro assicurandosi che il coperchio sia centrato e ben sigillato. Azionare la macchina per la scarica a bagliore e assicurarsi che la luce viola generata dal plasma sia visibile. Quando la macchina ha finito di funzionare, attendere che la camera abbia raggiunto la pressione atmosferica prima di rimuovere il coperchio in vetro e posizionare il vetrino sul banco.Regolare la concentrazione dei campioni di proteine purificate a circa 0,1 milligrammi per millilitro e caricare 3,5 microlitri del campione di proteine sulla griglia di carbonio spessa 10 nanometri. Dopo un minuto, utilizzare un pezzo di carta da filtro per rimuovere il liquido dalla superficie della griglia di microscopia elettronica e lavare la superficie della griglia tre volte con una goccia d'acqua da tre microlitri per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio con acqua, lavare la superficie della griglia altre due volte con tre microlitri di acetato di uranio fresco filtrato al 2% per lavaggio.Dopo l'ultimo lavaggio con acetato di uranio, colorare la griglia con una goccia da tre microlitri di acetato di uranio fresco filtrato al 2% per un minuto. Al termine dell'incubazione, utilizzare un nuovo pezzo di carta da filtro per rimuovere la gocciolina e asciugare la griglia all'aria per almeno un minuto prima di riporre la griglia in una scatola a griglia per un uso successivo. Qui, si possono osservare immagini negative di macchie ottenute utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione, come dimostrato.L'immagine negativa della colorazione per il campione di proteina B del canale di resistenza all'acraflavina wild-type purificato con detergente rivela una soluzione omogenea di particelle monodisperse con la proteina che mostra una struttura quaternaria trimerica ben definita. Queste strutture trimeriche corrispondono al cromatogramma di esclusione dimensionale osservato dopo la purificazione. In confronto, nell'immagine della colorazione negativa per il mutante P223G anch'esso purificato con detergente, si può osservare una soluzione eterogenea di nanoparticelle polidisperse con una propensione all'aggregazione ma senza trimeri nativi osservabili.Questi risultati sono supportati anche dalla cromatografia ad esclusione dimensionale. Risultati simili sono stati osservati per le proteine wild-type e mutanti dopo la purificazione con il polimero attivo di membrana NCMNP11. L'uso del polimero NCMNP52 facilita la generazione di nanoparticelle native della membrana cellulare in dimensioni molto più grandi, consentendo l'imaging di più trimeri della proteina B del canale di resistenza all'acraflavina in una singola particella nativa della membrana cellulare.Nel campione mutante, tuttavia, non si osservano particelle di trimero, anche quando si osservano le grandi chiazze a doppio strato della membrana cellulare nativa. L'analisi SDS-PAGE dei campioni di proteine purificate conferma la presenza di resistenza all'acraflavina B in tutti i campioni con una purezza superiore al 95% al peso molecolare previsto della proteina. Quando si modifica questo protocollo per altre proteine, è importante determinare sperimentalmente la quantità appropriata di frazione di membrana e la lunghezza, il tempo e la temperatura per il processo di solubilizzazione.Se le immagini del campione rivelano una soluzione omogenea di particelle monodisperse con unità strutturali ben definite, il campione può essere utilizzato per la determinazione della struttura ad alta risoluzione con la microscopia crioelettronica.

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