Name: Differenziazione guidata di podociti renali maturi da cellule staminali pluripotenti indotte umane in condizioni chimicamente definite (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Scopri un protocollo chimicamente definito per differenziare podociti maturi da cellule staminali pluripotenti indotte umane. Questo metodo offre alta efficienza senza manipolazione genetica per la ricerca sulle malattie renali.

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Questo lavoro è stato supportato dalla Pratt School of Engineering della Duke University, dalla Division of Nephrology della Duke Medical School, da A Chair's Research Award dal Dipartimento di Medicina della Duke University e da un Burroughs Wellcome Fund PDEP Career Transition Ad Hoc Award a S.M.. M.B è stato supportato dal Graduate Research Fellowship Program della National Science Foundation. Ringraziamo il Bursac Lab per averci generosamente fornito la linea di cellule staminali DU11 e il Varghese Lab della Duke University per aver temporaneamente condiviso la loro struttura di coltura tissutale con il nostro gruppo. Questa pubblicazione è dedicata alla Prof.ssa Laura L. Kiessling, Novartis Professor of Chemistry presso il Massachusetts Institute of Technology, per celebrare il suo 60° compleanno.

1. Preparazione dei reagenti
<ol><li>Integratore diluito scongelato 5x hiPS cell culture media (CCM) in terreno basale di coltura cellulare hiPS per ottenere una soluzione 1x di hiPS CCM. NOTA: L'integratore di CCM 5x hiPS congelato richiede un lento processo di scongelamento, idealmente a 4 °C per la notte. Le aliquote del CCM 1x hiPS possono essere conservate fino a 6 mesi a -20 °C.</li>
	<li>Preparazione di piastre a matrice di membrana basale (BM) 1 rivestite per la coltura cellulare hiPS: Scongelare la matrice BM 1 durante la notte su ghiaccio a 4 °C. Una volta scongelate, preparare aliquote con fattori di diluizione appropriati come suggerito dal produttore. NOTA: Tipicamente, le aliquote vengono preparate per la successiva diluizione in 25 mL di DMEM/F12 freddo in un tubo conico da 50 mL seguito da un'accurata miscelazione per sciogliere completamente la matrice BM 1 ed evitare la formazione di cristalli residui.</li>
	<li>Trasferire 1 mL della soluzione bm matrix 1 in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare a 37 °C per 1-2 ore o a 4 °C per un minimo di 24 ore, avvolto in un film di paraffina. Le piastre rivestite con matrice BM 1 possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 2 settimane.</li>
	<li>Preparazione della matrice della membrana basale (BM) 2 - piastre rivestite: diluire quantità appropriate di matrice BM 2 in 9 mL di acqua distillata sterile per preparare una concentrazione finale di 5 μg/mL. Aggiungere 700 μL della soluzione BM matrix 2 a ciascun pozzetti di una piastra da 12 pozzetti e incubare la piastra a temperatura ambiente per 2 ore o durante la notte a 4 °C.</li>
	<li>Preparare soluzioni stock da 100 μg/mL ciascuna di BMP7, Activin A e VEGF come segue: ricostituire BMP7 in acqua distillata sterile contenente lo 0,1% (wt/vol) di BSA e ricostituire Activin A e VEGF separatamente in PBS sterile contenente lo 0,1% (wt/vol) di BSA. Per evitare frequenti cicli di congelamento-disgelo, preparare aliquote da 100 μL da ciascuna soluzione stock e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi.</li>
	<li>Preparare una soluzione stock da 10 mM di Y27632 sciogliendo 10 mg di Y27632 in 3,079 mL di acqua distillata sterile. Aliquota 100 μL dal magazzino e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi.</li>
	<li>Sciogliere 2 mg di CHIR99021 in 143,4 μL di DMSO sterile per preparare una soluzione madre da 30 mM. Preparare aliquote da 5 μL e conservare a -20 °C per un massimo di 1 mese (o secondo la raccomandazione del produttore).</li>
	<li>Sciogliere 10 mg di acidoall-trans retinoico in 3,33 mL di DMSO sterile. Preparare aliquote da 500 μL e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi.</li>
</ol>2. Preparazione dei mezzi di coltura
<ol><li>Preparare il mezzo di differenziazione mesoderma ricostituendo le corrispondenti soluzioni stock a una concentrazione finale di 100 ng/mL Activin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 e 1x integratore privo di siero B27 in un volume appropriato di DMEM/12 con integratore di glutammina. NOTA: Il mezzo di differenziazione del mesoderma deve essere preparato al momento prima delle fasi di differenziazione e ad un volume appropriato per la scala dell'esperimento (in genere, 50 ml di terreno sono adeguati per due piastre da 12 pozzetti).</li>
	<li>Preparare il mezzo di differenziazione del mesoderma intermedio ricostituendo le corrispondenti soluzioni stock a una concentrazione finale di 100 ng / mL BMP7, 3 μM CHIR99021 e 1x integratore privo di siero B27 in DMEM / F12 con un integratore di glutammina. NOTA: Se necessario, il mezzo può essere integrato con 1% (vol / vol) Penicillina-Streptomicina. Regolare il volume del mezzo utilizzando DMEM / F12 con integratore di glutammina. Questo mezzo può essere preparato in grandi lotti; tuttavia, si raccomanda di conservare in aliquote più piccole (ad esempio, 45 mL in tubi conici da 50 mL) per evitare ripetuti cicli di congelamento-disgelo. Questo supporto può essere conservato a -20 °C per un massimo di 3 mesi e può essere scongelato a 4 °C durante la notte prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare il mezzo di induzione podocitario ricostituendo a una concentrazione finale 100 ng/mL BMP7, 100 ng/mL activina A, 50 ng/mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 integratore senza siero e 0,1 μM di acido retinoico all-trans in DMEM/F12 con integratore di glutammina. Proteggere il mezzo dalla luce (ad esempio, avvolgendo il contenitore con carta stagnola). NOTA: Questo mezzo può essere preparato in grandi lotti e conservato al buio a -20 °C per un massimo di 3 mesi. Le aliquote congelate devono essere scongelate durante la notte a 4 °C prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare 25 mL di soluzione neutralizzante di tripsina aggiungendo il 10% (vol/vol) di FBS inattivato al calore in DMEM/F12 e filtrare in condizioni sterili.</li>
	<li>Per il mantenimento post-differenziazione dei podociti derivati da cellule staminali, preparare Complete Medium con mezzi di mantenimento podocyte aggiungendo il supplemento al mezzo basale secondo le linee guida del produttore e conservare a 4 °C per un massimo di due settimane.</li>
</ol>3. Coltura cellulare hiPS senza alimentatore utilizzando il terreno di coltura cellulare hiPS
<ol><li>Aspirare la soluzione residua di bm matrix 1 dalle piastre preverniciate e lavare i pozzi 3 volte con 1-2 ml di DMEM/F12 riscaldato.</li>
	<li>Aspirare hiPS CCM dalle cellule hiPS e risciacquare le cellule 3 volte con DMEM / F12 riscaldato. Aggiungere 1 mL di soluzione di distacco a cellule calde e incubare per 1 minuto a 37 °C per aiutare a dissociare le cellule. Eseguire l'ispezione visiva delle cellule al microscopio di coltura tissutale e assicurarsi che i bordi delle colonie cellulari appaiano arrotondati, quindi aspirare rapidamente la soluzione di distacco cellulare dalle cellule (assicurandosi che le colonie cellulari siano ancora attaccate alla piastra, anche se in modo approssimativo). Risciacquare delicatamente le cellule una volta con DMEM/F12 per rimuovere la soluzione di distacco cellulare.</li>
	<li>Aggiungere 3 ml di hiPS CCM alle cellule hiPS (in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti) che sono state trattate con la soluzione di distacco cellulare. Raschiare le colonie usando un sollevatore di cellule e pipettare delicatamente la sospensione cellulare su e giù per rimuovere le cellule liberamente aderenti. Lavare accuratamente la piastra per assicurarsi che tutte le cellule vengano raccolte. NOTA: si consiglia l'uso di una pipetta da 5 ml per evitare un eccessivo taglio sulle cellule.</li>
	<li>Trasferire 0,5 mL della sospensione cellulare in ciascun pozzetti di una nuova matrice BM a 1 piastra a 6 pozzetti rivestita contenente 2 mL di hiPS CCM per pozzetti. Spostare la piastra in modo figura otto per distribuire le colonie cellulari all'interno dei pozzetti e incubare a 37 °C in un incubatore a CO2 al 5 %. Aggiornare il mezzo ogni giorno fino a quando le cellule sono pronte per essere attraversate o utilizzate per l'esperimento di differenziazione (circa il 70 % di confluenza). NOTA: La dimensione ideale della colonia per il passaggio di routine delle iPSC è compresa tra 200-500 μm in condizioni di alimentazione libera utilizzando hiPS CCM (senza inibitore ROCK). Se le cellule vengono individualizzate durante il trattamento con enzimi di dissociazione o tamponi, l'hiPS CCM può essere integrato con l'inibitore ROCK (ad esempio, 10 μM Y27632) per migliorare la vitalità cellulare.</li>
</ol>4. Differenziazione delle cellule hiPS in cellule mesodermiche (giorni 0-2)
<ol><li>Mentre le colture cellulari hiPS sono nella fase di crescita esponenziale (approssimativamente entro 4 giorni dalla coltura dopo il passaggio e circa il 70% di confluenza), ispezionare visivamente la presenza di cellule spontaneamente differenziate all'interno e intorno ai bordi delle colonie. Se necessario, raschiare asetticamente le aree di differenziazione.</li>
	<li>Aspirare hiPS CCM da cellule hiPS e risciacquare le cellule 3 volte con DMEM / F12 caldo. Incubare le cellule con 1 mL di tampone di dissociazione cellulare privo di enzimi per 10 minuti a 37 °C e verificare la dissociazione al microscopio. A causa delle differenze intrinseche tra le diverse linee cellulari hiPS, il tempo di incubazione effettivo per il buffer di dissociazione cellulare deve essere determinato per una determinata linea cellulare.</li>
	<li>Raschiare delicatamente il pozzetto con un sollevatore di cellule per rimuovere le cellule liberamente aderenti e trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml, seguito da pipettare su e giù più volte per individualizzare le cellule hiPS.<ol>
<li>Portare la sospensione cellulare al volume di 15 ml con DMEM/F12 caldo e centrifugare per 5 minuti a 290 x g a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspirare delicatamente il surnatante e risospenare le cellule con DMEM/F12 caldo per un altro ciclo di centrifugazione per rimuovere la matrice BM residua 1 e i componenti tampone di dissociazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirare le cellule surnatante e ripresa in 1 mL di mezzo di induzione del mesoderma come descritto sopra. Contare il numero totale di cellule utilizzando un emocitometro o un contatore coulter per determinare il volume appropriato del mezzo di differenziazione del mesoderma necessario per raggiungere una concentrazione di 1 x 105 cellule / mL.</li>
	<li>Aspirare la soluzione ECM dalle piastre rivestite a matrice BM 2 e risciacquare le piastre due volte con DMEM/F12 caldo. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare hiPS pipettando un paio di volte. Trasferire 1 mL della sospensione cellulare in ciascun pozzo delle piastre a 12 pozzi rivestite in matrice BM 2 e quindi agitare delicatamente le piastre per distribuire le cellule in modo più uniforme.</li>
	<li>Incubare la piastra a 37 °C in un incubatore a CO2 al 5%. Aggiornare il mezzo di induzione del mesoderma il giorno successivo. NOTA: dopo 2 giorni, le cellule mesodermiche derivate dalle cellule hiPS sarebbero pronte per l'induzione del mesoderma intermedio.</li>
</ol>5. Differenziazione delle cellule mesodermiche derivate dalle cellule hiPS in mesoderma intermedio (giorni 2-16)
<ol><li>Il giorno 2 del protocollo di differenziazione, aspirare il mezzo di induzione del mesoderma e reintegrare con 1 mL per mezzo di induzione del mesoderma intermedio del pozzo.</li>
	<li>Aggiorna il mezzo ogni giorno per mantenere una soglia accurata di fattori di crescita e piccole molecole per le cellule metabolicamente attive. Se c'è una sostanziale crescita cellulare e un rapido esaurimento dei nutrienti dei media (indicato dall'ingiallimento dei mezzi), il volume del mezzo di differenziazione del mesoderma intermedio può essere aumentato a 1,3 ml per pozzo delle 12 piastre del pozzo.</li>
	<li>Cellule di coltura per ulteriori 14 giorni per ottenere cellule mesodermiche intermedie. Entro il giorno 16, queste cellule possono essere crioconservate per un uso successivo.</li>
</ol>6. Differenziazione delle cellule intermedie del mesoderma derivate dalle cellule hiPS in podociti (giorni da 16 a 21)
<ol><li>Risciacquare le cellule intermedie del mesoderma con DMEM/F12 caldo seguito da incubazione delle cellule con 0,5 mL per pozzet di tripsina-EDTA allo 0,05% per 3 minuti a 37 °C. Eseguire un'ispezione visiva per assicurarsi che le cellule inizino a dissociarsi.</li>
	<li>Raschiare le cellule usando un sollevatore di celle e pipettare la sospensione cellulare più volte usando una punta di pipetta da 1.000 μL per ottenere cellule individualizzate (o piccoli grumi di). NOTA: In questa fase, assicurarsi che le cellule siano completamente dissociate poiché le cellule aggregate potrebbero non riuscire ad acquisire un fenotipo differenziato terminalmente entro la tempistica del protocollo.</li>
	<li>Aggiungere circa 2 ml per pozzet di soluzione neutralizzante di tripsina per fermare l'attività della tripsina.</li>
	<li>Trasferire le celle in un tubo conico da 50 mL e portare il volume fino a 50 mL utilizzando DMEM/F12, quindi centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 201 x g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirare le cellule surnatante e risospende nel mezzo di induzione dei podociti. Per risultati ottimali, garantire una densità di semina finale di circa 100.000 cellule/pozzetti di una piastra da 12 pozzetti. Aggiungere la sospensione cellulare alle piastre rivestite in BM matrix 2 e agitare delicatamente la piastra per aiutare a distribuire le cellule in modo più uniforme.</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2 e rinfrescare il mezzo ogni giorno per un massimo di 5 giorni per ottenere podociti entro il giorno 21. NOTA: I podociti derivati da cellule hiPS risultanti possono essere mantenuti in coltura per 2-4 settimane aggiuntive utilizzando un mezzo completo con mezzi di mantenimento dei podociti. Una volta in mezzi di mantenimento dei podociti, le cellule possono essere alimentate a giorni alterni e possono essere utilizzate per studi successivi o analisi a valle.</li>
</ol>

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</ol>

S.M. è autore di un brevetto in attesa di brevetto per metodi per la generazione di podociti renali da cellule staminali pluripotenti (domanda di brevetto USA 14/950859). Gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

In questo rapporto, descriviamo un protocollo per la generazione di podociti glomerulari renali da cellule hiPS. I podociti derivati da cellule hiPS presentano caratteristiche morfologiche e molecolari associate al fenotipo13del podocita renale maturo. In precedenti pubblicazioni, abbiamo dimostrato che i podociti derivati dalle cellule hiPS possono imitare la struttura e la funzione di filtrazione selettiva del glomerulo renale quando co-coltivati con cellule endoteliali microvascolari glomerular...

I progressi nella coltura di cellule staminali pluripotenti umane sono pronti a rivoluzionare la medicina rigenerativa, la modellazione delle malattie e lo screening dei farmaci fornendo ai ricercatori una fonte rinnovabile e scalabile di materiale biologico che può essere progettato per ottenere quasi tutti i tipi di cellule all'interno del corpo umano1. Questa strategia è particolarmente utile per ricavare tipi di cellule specializzate e funzionali che altrimenti sarebbero difficili da ottenere. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPS)2,3,4,5 sono particolarmente attraenti per la loro origine cellulare somatica e il potenziale che rappresentano per la medicina personalizzata. Tuttavia, lo sviluppo di metodi per derivare altre linee cellulari da cellule hiPS rimane difficile a causa dell'uso frequente di condizioni di coltura scarsamente definite che portano a una bassa efficienza e alla generazione non specifica di popolazioni cellulari eterogenee6,7.
Qui viene presentato un metodo per la derivazione di podociti renali maturi da cellule hiPS con specificità e alta efficienza in condizioni chimicamente definite. Considerando i ruoli di molteplici fattori all'interno del microambiente cellulare, è stata sviluppata una strategia di differenziazione delle cellule staminali che ha comportato l'ottimizzazione dei fattori solubili presentati nel terreno di coltura cellulare e dei fattori insolubili, come componenti della matrice extracellulare o substrati adesivi. Data l'importanza della segnalazione dell'integrina nello sviluppo e nella funzione dei podociti, è stata inizialmente esaminata l'espressione dei recettori dell'integrina sulla superficie cellulare. Le integrine β1 erano altamente espresse non solo nelle cellule hiPS, ma anche nei loro derivati tra cui le cellule mesodermiche e mesodermicheintermedie8,9,10. Esperimenti successivi hanno confermato che i ligandi che si legano alle integrine β1 (incluso il frammento di laminina 511 o la laminina 511-E8) supportano l'adesione e la differenziazione delle cellule hiPS in podociti quando usati in combinazione con il mezzo induttivo solubile descritto di seguito.
L'induzione dell'impegno di lignaggio cellulare è stata avviata confermando innanzitutto che le cellule hiPS coltivate sulle superfici rivestite di laminina per due giorni in presenza di un mezzo contenente Activin A, CHIR99021 e Y27632 Rock inibitore possono differenziarsi in cellule che esprimono i primi marcatori del mesoderma HAND1, goosecoid e brachyury8,11. Il trattamento delle cellule del mesoderma per 14 giorni con un mezzo integrato con proteina morfogenetica ossea 7 (BMP-7) e CHIR99021 ha permesso la derivazione di cellule mesodermiche intermedie che esprimevano i marcatori delle cellule nefrone-progenitrici del tumore di Wilm 1 (WT1), della proteina correlata saltata dispari 1 (OSR1)8,11e della proteina 2 del gene 2 accoppiato (PAX2)12. Per ricavare i podociti glomerulari renali maturi, le cellule mesodermiche intermedie sono state trattate per 4-5 giorni con un nuovo mezzo costituito da BMP-7, Activin A, fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), acidoall-trans retinoico e CHIR99021. La citometria a flusso e l'immunostaining sono state utilizzate per confermare che >90% delle cellule risultanti presentava le caratteristiche molecolari, morfologiche e funzionali del podocita renale maturo8,11,13. Queste caratteristiche includono lo sviluppo di processi del piede primario e secondario; l'espressione di geni specifici del lignaggio podocitario tra cui SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 e l'espressione di proteine tra cui podocin, nefrina e WT114,15,16. Inoltre, è stato scoperto che i podociti derivati dalle cellule hiPS possono essere mantenuti in coltura fino a quattro settimane in vitro utilizzando un mezzodisponibilein commercio 8,11 che fornisce un'ulteriore flessibilità nei tempi degli esperimenti a valle. Per ulteriori informazioni sui pannelli di citometria a flusso utilizzati per determinare la purezza degli hiPS-podociti, fare riferimento alla nostra precedente pubblicazione11.

<table><tbody><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DU11 cellule iPS</td><td></td><td></td> umane <td>La linea cellulare iPS DU11 (clone #11 della Duke University) è stata generata presso la Duke University iPSC Core Facility e ci ha fornito il Bursac Lab della Duke University. Questa linea è stata testata per il micoplasma ed è stata cariotipizzata l'ultima volta nel luglio 2019 dal nostro laboratorio ed è risultata cariotipicamente normale.</td></tr><tr><td>Fattori di crescita e integratori di terreni</acido retinoico ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>forteAll-trans (500 mg)</td><td>72262</td><td>Stem Cell Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Integratore senza siero B27</td><td>17504044</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>04-0004</td><td>Stemgent</td><td>Può mostrare variazioni da lotto a lotto</td></tr><tr><td>Kit completo di terreno con CultureBoost-R</td><td>4Z0-500-R</td><td>Sistemi di</td><td>celle Terreni di manutenzione dei podociti</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>12634028</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 con integratore GlutaMAX</td><td>10565042</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>DMEM/F12 con integratore di glutammina</td></tr><tr><td>FBS inattivato termicamente</td><td>10082147</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Activina umana A</td><td>PHC9564</td><td>Thermo/Life Tecnologie</td><td></td></tr><tr><td>BMP7 umano</td><td>PHC9544</td><td>Tecnologie Thermo/Life VEGF</td><td></td></tr><tr><td>umano</td><td>PHC9394</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>05850</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>terreni di coltura cellulare hiPS (CCM)</td></tr><tr><td>Penicillina... streptomicina, liquida (100&volte;)</td><td>15140-163</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Y27632 Inibitore ROCK</td><td>1254</td><td>Tocris</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 594 anticorpi secondari coniugati</td><td>A32744; A32754; A-11076; A32790</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury(T)</td><td>ab20680</td><td>Abcam</td><td></td></tr><tr><td>Nephrin</td><td>GP-N2</td><td>Progen</td><td></td></tr><tr><td>OCT4</td><td>AF1759</td><td>R& D Systems</td><td></td></tr><tr><td>PAX2</td><td>71-6000</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>WT1</td><td>MAB4234</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>ECM Molecole</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMatrix-511 Frammento di laminina-E8 (LM-E8)</td><td>N-892012</td><td>Iwai North America</td><td>Matrice della membrana basale (BM) 2</td></tr><tr><td>Matrigel matrice qualificata hESC, fiala da 5 mL</td><td>354277</td><td>BD Bioscienze</td><td>Matrice della membrana basale (BM) 1. Può mostrare variazioni da lotto a lotto</td></tr><tr><td><forte>Enzimi e altri reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutasi</td><td>A1110501</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>Soluzione di distacco cellulare</td></tr><tr><td>BSA</td><td>A9418</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>D2438</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DMSO è tossico. Deve essere maneggiato in una cappa di sicurezza chimica</td></tr><tr><td>Tampone di dissociazione cellulare privo di enzimi, Hank' Soluzione</td> di <td></td> etanolo, 70% (vol/vol), grado biotecnologico 97065-058 VWR L <td>13150016'etanolo</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>è infiammabile e tossico</td></tr><tr><td>FBS</td><td>431097</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>28906</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>Il PFA deve essere maneggiato in una cappa chimica con adeguati dispositivi di protezione individuale, inclusi guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza. Evitare l'inalazione e il contatto con la pelle.</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>14190-250</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata sterile</td><td>15230162</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>97062-208</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA, 0,05%</td><td>25300-120</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette di aspirazione, confezionate singolarmente</td><td>29442-462</td><td>Centrifuga Corning</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-15R</td><td>B99516</td><td>Beckman Coulter</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga conica, 15 mL</td><td>352097</td><td>Provetta da centrifuga conica Corning</td><td></td></tr><tr><td>, 50 mL</td><td>352098</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Cryobox</td><td>3395465</td><td>Tecnologie Thermo/Life Per</td><td>la conservazione di prodotti congelati aliquote</td></tr><tr><td>EVOS M7000</td><td>AMF7000</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>Microscopio fluorescente utilizzato per acquisire immagini di cellule iPS fissate e colorate e dei loro derivati</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>100503-092</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i Incubatore a CO2</td><td>51030403</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>Per la coltura e la manutenzione di routine di cellule iPS e loro derivati</td></tr><tr><td>Osservatore Zeiss Axio invertito dotato di fotocamera AxioCam 503</td><td>491916-0001-000 (microscopio) ; 426558-0000-000 (fotocamera)</td> <td>Microscopia Carl Zeiss</td><td>Utilizzato per acquisire immagini a contrasto di fase di cellule iPS vive e dei loro derivati in ogni fase della differenziazione dei podociti</td></tr><tr><td>Guanti in nitrile Kimberly-Clark</td><td>40101-346</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes, grandi</td><td>21905-049</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes, piccoli</td><td>21905-026</td><td>Puntali</td> per pipette barriera di precisione VWR <td></td></tr><tr><td>P10</td><td>P1096-FR</td> Puntali per pipette barriera <td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>P100</td><td>P1125</td> Puntali per pipette barriera <td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>P1000</td><td>P1126</td> Puntali per pipette barriera <td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>P20</td><td>P1121</td><td>Puntali</td> per pipette barriera Denville Scientific <td></td></tr><tr><td>P200</td><td>P1122</td> Pipetta sierologica <td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>, 10 mL, confezionata singolarmente</td><td>356551</td><td>Pipetta</td> sierologica Corning<td></td></tr><tr><td>, 25 mL, confezionata</td><td>singolarmente 356525</td><td>Pipetta</td> sierologica Corning<td></td></tr><tr><td>, 5 mL, confezionata singolarmente</td><td>356543</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip, 0,22 &mu; m, PES</td><td>SCGP00525</td><td>EMD Millipore</td> sterile provette per microcentrifuga <td></td></tr><tr><td></td><td>1138W14</td><td>Thomas Scientific</td><td>Per aliquotare fattori</td></tr><tr><td>di crescita Coltura tissutale&ndash; piastre a 12 pozzetti trattate</td><td>353043</td><td>coltura di tessuti Corning</td><td></td></tr><tr><td>... piastre a sei pozzetti trattate</td><td>353046</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>VWR camice da laboratorio techuni bianco</td><td>10141-342</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Sollevatore di celle ad ampia smussatura</td><td>3008</td><td>Corning</td><td></td></tr></tbody></table>

differenziazione guidata di podociti renali maturi da cellule staminali pluripotenti indotte umane in condizioni chimicamente definite

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

La malattia renale colpisce più del 10% della popolazione mondiale e costa miliardi di dollari in spese federali. Le forme più gravi di malattia renale e l'eventuale insufficienza renale allo stadio terminale sono spesso causate dal danno ai podociti glomerulari, che sono le cellule epiteliali altamente specializzate che funzionano insieme alle cellule endoteliali e alla membrana basale glomerulare per formare la barriera di filtrazione del rene. I progressi nella medicina renale sono stati ostacolati dalla limitata disponibilità di tessuti primari e dalla mancanza di metodi robusti per la derivazione di cellule renali umane funzionali, come i podociti. La capacità di derivare podociti da fonti rinnovabili, come le cellule staminali, potrebbe aiutare a far progredire l'attuale comprensione dei meccanismi dello sviluppo e della malattia del rene umano, oltre a fornire nuovi strumenti per la scoperta terapeutica. L'obiettivo di questo protocollo era quello di sviluppare un metodo per derivare podociti maturi e post-mitotici da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPS) con alta efficienza e specificità e in condizioni chimicamente definite. I podociti derivati da cellule hiPS prodotti con questo metodo esprimono marcatori specifici del lignaggio (tra cui nefrina, podocin e tumore di Wilm 1) e mostrano le caratteristiche morfologiche specializzate (compresi i processi primari e secondari del piede) associate ai podociti maturi e funzionali. Curiosamente, queste caratteristiche specializzate sono notevolmente assenti nella linea cellulare di podociti immortalizzati ampiamente utilizzata nel campo, il che suggerisce che il protocollo qui descritto produce podociti renali umani che hanno un fenotipo evolutivamente più maturo rispetto alle linee cellulari podocitarie esistenti tipicamente utilizzate per studiare la biologia renale umana.

L'obiettivo di questo protocollo era dimostrare che i podociti umani maturi possono essere derivati da cellule hiPS in condizioni chimicamente definite. I dati presentati in questo manoscritto sono stati generati utilizzando la linea cellulare DU11 hiPS17, che è stata testata per la prima volta e si è scoperta priva di micoplasma. È stata eseguita anche l'analisi cromosomica e le cellule sono risultate essere cariotipicamente normali. Partendo dalle cellule hiPS DU11 indifferenziate, la strategia ...

Qui viene presentato un protocollo chimicamente definito per la derivazione di podociti renali umani da cellule staminali pluripotenti indotte ad alta efficienza (>90%) e indipendenti da manipolazioni genetiche o selezione di sottopopolazioni. Questo protocollo produce il tipo di cellula desiderato entro 26 giorni e potrebbe essere utile per i test di nefrotossicità e la modellazione della malattia.

Differenziazione guidata di podociti renali maturi da cellule staminali pluripotenti indotte umane in condizioni chimicamente definite

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

I protocolli per la differenziazione delle cellule staminali in cellule renali funzionali rimangono sfuggenti. Questo metodo produce podociti maturi con specificità ed efficienza, fornendo nuovi strumenti per lo studio dei meccanismi delle malattie renali. Questo metodo impiega terreni di coltura cellulare e proteine della matrice extracellulare con una composizione chimicamente definita per produrre podociti derivati da cellule iPS umane con un'elevata purezza senza utilizzare la selezione di sottopopolazioni o la manipolazione genetica.Le opzioni terapeutiche per i pazienti con malattie renali sono limitate. Questo metodo ha implicazioni per la modellazione e la comprensione dei meccanismi della malattia, che potrebbero facilitare lo sviluppo di nuovi biomarcatori e terapie. Per impostare una coltura di iPSC umana priva di alimentatore, aspirare la soluzione residua della matrice della membrana basale 1 da piastre pre-rivestite e lavare i pozzetti tre volte con uno o due millilitri per pozzetto di terreno basale riscaldato.Aspirare il terreno di coltura cellulare esaurito da una coltura di iPSC umana e sciacquare le cellule tre volte con terreno riscaldato. Aggiungere un millilitro di soluzione calda per il distacco delle cellule in ciascun pozzetto per un'incubazione di un minuto a 37 gradi Celsius. Dopo aver confermato i bordi arrotondati delle colonie cellulari al microscopio per colture tissutali, aspirare rapidamente la soluzione di distacco cellulare e sciacquare delicatamente le cellule con il terreno di coltura cellulare.Aggiungere tre millilitri di terreno di coltura iPSC umano alle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e utilizzare un sollevatore di cellule per raschiare le colonie. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare per rimuovere eventuali cellule aderenti in modo lasco e lavare accuratamente la piastra per garantire la raccolta di tutte le cellule. Trasferire 500 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di una nuova matrice di membrana basale 1 piastra a sei pozzetti rivestita contenente due millilitri di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per pozzetto e spostare la piastra a forma di otto per distribuire uniformemente le colonie cellulari all'interno dei pozzetti.Posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari, rinfrescando il terreno ogni giorno fino a quando le cellule raggiungono circa il 70% di confluenza. Se necessario, raschiare asetticamente le aree di differenziazione prima di aspirare il surnatante dai pozzetti. Dopo aver lavato i pozzetti tre volte, dissociare le cellule come dimostrato e tirare le sospensioni cellulari risultanti in un tubo conico da 15 millilitri.Dopo la miscelazione mediante pipettaggio, portare il volume finale nella provetta a 15 millilitri con terreno caldo e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in terreno fresco per una seconda centrifugazione e risospendere le cellule in un millilitro di terreno di induzione del mesoderma per il conteggio. Dopo il conteggio, risospendere le cellule a una volta 10 per la quinta cellula per millilitro di concentrazione del mezzo di induzione del mesoderma e aspirare la soluzione della matrice extracellulare dalle piastre rivestite della matrice della membrana basale 2.Sciacquare le piastre due volte con un terreno caldo e miscelare la sospensione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo con un pipettaggio delicato. Aggiungere un millilitro di cellule a ciascun pozzetto della matrice della membrana basale 2 piastre rivestite a 12 pozzetti e agitare delicatamente le piastre per distribuire le cellule in modo più uniforme. Quindi posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari.Nei giorni 2-15 della differenziazione, sostituire il mezzo di induzione del mesoderma con un millilitro di terreno di induzione intermedio del mesoderma per pozzetto. Se si osserva una crescita cellulare sostanziale e un rapido esaurimento dei nutrienti, come indicato dall'ingiallimento del terreno, il volume del mezzo di differenziazione del mesoderma intermedio può essere aumentato a 1,3 millilitri per pozzetto. Il 16° giorno di coltura, sciacquare le cellule intermedie del mesoderma con un terreno caldo e incubare le cellule con 500 microlitri di tripsina EDTA allo 0,05% per pozzetto per tre minuti a 37 gradi Celsius.Quando le cellule iniziano a dissociarsi, raschiare le cellule con un sollevatore cellulare e mescolare delicatamente le cellule mediante pipettaggio. Arrestare la reazione con circa due millilitri di soluzione neutralizzante della tripsina per pozzetto e trasferire le cellule in una provetta conica da 50 millilitri. Portare il volume fino a 50 millilitri con il terreno e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.Risospendere il pellet nel mezzo di induzione dei podociti a una volta da 10 a una quinta cellula per millilitro di concentrazione media e aggiungere le cellule alla matrice della membrana basale 2 piastre rivestite. Quindi agitare delicatamente la piastra per distribuire le cellule in modo più uniforme e posizionare le cellule nell'incubatore per un massimo di cinque giorni. Utilizzando la strategia di coltura come dimostrato, le cellule staminali possono essere prima differenziate in cellule del mesoderma che esprimono Brachiuria, seguite dalla differenziazione in cellule del mesoderma intermedio PAX2 positive e infine in podociti glomerulari renali maturi.I podociti derivati da cellule staminali si colorano positivamente per WT1, così come per il marcatore di identificazione del lignaggio nefrina. Curiosamente, la localizzazione subcellulare della nefrina è prevalentemente all'interno dei processi del piede dei podociti e del citoplasma cellulare, coerentemente con un fenotipo podocitario maturo. Le cellule seminate a densità che superano significativamente la densità raccomandata di una volta per 10 a una quinta cellula per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti producono grandi gruppi di cellule prive del fenotipo morfologico atteso dei podociti maturi entro la linea temporale standard del protocollo.La semina alle densità raccomandate in questo protocollo, tuttavia, si traduce in colture di cellule con la morfologia desiderata. Si consiglia di utilizzare la proteina della membrana basale appropriata per il distacco cellulare e di mantenere la corretta densità di semina cellulare per l'induzione del mesoderma e dei podociti. Questo metodo di differenziazione dei podociti può essere integrato con sistemi microfluidici organs-on-chip o tecnologie di bioprinting 3D per sviluppare modelli funzionali del rene umano per lo screening dei farmaci e i test di nefrotossicità.La mancanza di modelli di coltura cellulare appropriati ha ostacolato i progressi nella comprensione dei meccanismi delle malattie renali. Questo protocollo fornisce ai ricercatori una fonte inesauribile di podociti derivati da pazienti per la modellazione della malattia.

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In questo video, descriviamo il protocollo per derivare podociti renali umani da cellule staminali pluripotenti indotte attraverso la differenziazione cellulare in condizioni chimiche definite. I podociti generati possono essere utilizzati per i test di nefrotossicità e la modellazione delle malattie.

Derivazione di podociti renali umani da cellule staminali pluripotenti indotte: una procedura per la differenziazione diretta di podociti renali maturi da cellule staminali

Qui descriviamo un protocollo per generare organoidi renali da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC). Questo protocollo genera organoidi renali entro due settimane. Gli organoidi renali risultanti possono essere coltivati in fiaschi spinner su larga scala o piastre magnetiche multi-pozzo per approcci paralleli di test antidroga.

Un metodo semplificato per la generazione di organoidi renali da cellule staminali pluripotenti umane

Presentato qui è un protocollo per progettare un sistema organo-on-a-chip personalizzato che ricapitola la struttura e la funzione della barriera di filtrazione glomerulare renale integrando cellule endoteliali epiteliali e vascolari geneticamente abbinate differenziate dalle cellule staminali pluripotenti indotte umane. Questo sistema bioingegnerizzato può far progredire la medicina di precisione renale e le applicazioni correlate.

Chip glomerulo renale isogenico ingegnerizzato da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Questo manoscritto descrive un protocollo in due fasi per generare podociti specifici del paziente dai fibroblasti dermici attraverso la riprogrammazione episomiale in cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) e la successiva differenziazione in podociti.

Generazione di podociti derivati dal paziente da biopsie cutanee

Questo protocollo presenta un metodo completo ed efficiente per la produzione di organoidi renali da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) utilizzando condizioni di coltura in sospensione. L'enfasi principale di questo studio risiede nella determinazione della densità cellulare iniziale e della concentrazione dell'agonista WNT, avvantaggiando così i ricercatori interessati alla ricerca sugli organoidi renali.

Generazione di organoidi renali in sospensione da cellule staminali pluripotenti indotte

Abbiamo ottimizzato una tecnica di microincapsulazione come una piattaforma efficace 3D per la propagazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali per endoderma e dopaminergici (DA) neuroni. Esso fornisce inoltre l'opportunità di immuno-isolamento di cellule dall'host durante il trapianto. Questa piattaforma può essere adattato per altri tipi di cellule.

Microcapsule di alginato come piattaforma 3D per la propagazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) per diverse linee

Questo protocollo descrive lo sviluppo, l'espansione e immagini in vivo di cellule NK derivate da hESCs e iPSCs.

Sviluppo, di espansione, e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoraggio delle cellule NK umane da cellule staminali embrionali umane (hESC) ed e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs)

I progenitori miogenici derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono promettenti candidati per le strategie di terapia cellulare per il trattamento delle distrofie muscolari. Questo protocollo descrive i trapianti e le misurazioni funzionali necessarie per valutare l'innesto e la differenziazione dei mesoangioblasti derivati dall'iPSC (un tipo di progenitori muscolari) nei modelli di topo di rigenerazione muscolare acuta e cronica.

Trapianto di progenitori miogenici pluripotenti derivati da cellule staminali indotte simili a mesoangioblasti nei modelli di topo di rigenerazione muscolare

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Un protocollo è presentato per preparare polivinil alcool-co-itaconico acido idrogel con rigidità variabile, che sono stati innestati con e senza oligopeptidi, per studiare l'effetto della rigidità dei biomateriali sulla differenziazione e proliferazione delle cellule staminali. La rigidità nel caso degli idrogeli fu controllata dal tempo di reticolazione.

Cultura di cellule staminali pluripotenti umane il polivinil alcool-Co-itaconico acido idrogel con diverse rigidità nelle circostanze senza Xeno

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Differenziazione guidata di podociti renali maturi da cellule staminali pluripotenti indotte umane in condizioni chimicamente definite (Video) | JoVE Journal

Differenziazione guidata di podociti renali maturi da cellule staminali pluripotenti indotte umane in condizioni chimicamente definite

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