Differenziazione guidata di podociti renali maturi da cellule staminali pluripotenti indotte umane in condizioni chimicamente definite

I protocolli per la differenziazione delle cellule staminali in cellule renali funzionali rimangono sfuggenti. Questo metodo produce podociti maturi con specificità ed efficienza, fornendo nuovi strumenti per lo studio dei meccanismi delle malattie renali. Questo metodo impiega terreni di coltura cellulare e proteine della matrice extracellulare con una composizione chimicamente definita per produrre podociti derivati da cellule iPS umane con un'elevata purezza senza utilizzare la selezione di sottopopolazioni o la manipolazione genetica.

Le opzioni terapeutiche per i pazienti con malattie renali sono limitate. Questo metodo ha implicazioni per la modellazione e la comprensione dei meccanismi della malattia, che potrebbero facilitare lo sviluppo di nuovi biomarcatori e terapie. Per impostare una coltura di iPSC umana priva di alimentatore, aspirare la soluzione residua della matrice della membrana basale 1 da piastre pre-rivestite e lavare i pozzetti tre volte con uno o due millilitri per pozzetto di terreno basale riscaldato.

Aspirare il terreno di coltura cellulare esaurito da una coltura di iPSC umana e sciacquare le cellule tre volte con terreno riscaldato. Aggiungere un millilitro di soluzione calda per il distacco delle cellule in ciascun pozzetto per un'incubazione di un minuto a 37 gradi Celsius. Dopo aver confermato i bordi arrotondati delle colonie cellulari al microscopio per colture tissutali, aspirare rapidamente la soluzione di distacco cellulare e sciacquare delicatamente le cellule con il terreno di coltura cellulare.

Aggiungere tre millilitri di terreno di coltura iPSC umano alle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e utilizzare un sollevatore di cellule per raschiare le colonie. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare per rimuovere eventuali cellule aderenti in modo lasco e lavare accuratamente la piastra per garantire la raccolta di tutte le cellule. Trasferire 500 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di una nuova matrice di membrana basale 1 piastra a sei pozzetti rivestita contenente due millilitri di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per pozzetto e spostare la piastra a forma di otto per distribuire uniformemente le colonie cellulari all'interno dei pozzetti.

Posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari, rinfrescando il terreno ogni giorno fino a quando le cellule raggiungono circa il 70% di confluenza. Se necessario, raschiare asetticamente le aree di differenziazione prima di aspirare il surnatante dai pozzetti. Dopo aver lavato i pozzetti tre volte, dissociare le cellule come dimostrato e tirare le sospensioni cellulari risultanti in un tubo conico da 15 millilitri.

Dopo la miscelazione mediante pipettaggio, portare il volume finale nella provetta a 15 millilitri con terreno caldo e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in terreno fresco per una seconda centrifugazione e risospendere le cellule in un millilitro di terreno di induzione del mesoderma per il conteggio. Dopo il conteggio, risospendere le cellule a una volta 10 per la quinta cellula per millilitro di concentrazione del mezzo di induzione del mesoderma e aspirare la soluzione della matrice extracellulare dalle piastre rivestite della matrice della membrana basale 2

Sciacquare le piastre due volte con un terreno caldo e miscelare la sospensione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo con un pipettaggio delicato. Aggiungere un millilitro di cellule a ciascun pozzetto della matrice della membrana basale 2 piastre rivestite a 12 pozzetti e agitare delicatamente le piastre per distribuire le cellule in modo più uniforme. Quindi posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari.

Nei giorni 2-15 della differenziazione, sostituire il mezzo di induzione del mesoderma con un millilitro di terreno di induzione intermedio del mesoderma per pozzetto. Se si osserva una crescita cellulare sostanziale e un rapido esaurimento dei nutrienti, come indicato dall'ingiallimento del terreno, il volume del mezzo di differenziazione del mesoderma intermedio può essere aumentato a 1,3 millilitri per pozzetto. Il 16° giorno di coltura, sciacquare le cellule intermedie del mesoderma con un terreno caldo e incubare le cellule con 500 microlitri di tripsina EDTA allo 0,05% per pozzetto per tre minuti a 37 gradi Celsius.

Quando le cellule iniziano a dissociarsi, raschiare le cellule con un sollevatore cellulare e mescolare delicatamente le cellule mediante pipettaggio. Arrestare la reazione con circa due millilitri di soluzione neutralizzante della tripsina per pozzetto e trasferire le cellule in una provetta conica da 50 millilitri. Portare il volume fino a 50 millilitri con il terreno e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.

Risospendere il pellet nel mezzo di induzione dei podociti a una volta da 10 a una quinta cellula per millilitro di concentrazione media e aggiungere le cellule alla matrice della membrana basale 2 piastre rivestite. Quindi agitare delicatamente la piastra per distribuire le cellule in modo più uniforme e posizionare le cellule nell'incubatore per un massimo di cinque giorni. Utilizzando la strategia di coltura come dimostrato, le cellule staminali possono essere prima differenziate in cellule del mesoderma che esprimono Brachiuria, seguite dalla differenziazione in cellule del mesoderma intermedio PAX2 positive e infine in podociti glomerulari renali maturi.

I podociti derivati da cellule staminali si colorano positivamente per WT1, così come per il marcatore di identificazione del lignaggio nefrina. Curiosamente, la localizzazione subcellulare della nefrina è prevalentemente all'interno dei processi del piede dei podociti e del citoplasma cellulare, coerentemente con un fenotipo podocitario maturo. Le cellule seminate a densità che superano significativamente la densità raccomandata di una volta per 10 a una quinta cellula per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti producono grandi gruppi di cellule prive del fenotipo morfologico atteso dei podociti maturi entro la linea temporale standard del protocollo.

La semina alle densità raccomandate in questo protocollo, tuttavia, si traduce in colture di cellule con la morfologia desiderata. Si consiglia di utilizzare la proteina della membrana basale appropriata per il distacco cellulare e di mantenere la corretta densità di semina cellulare per l'induzione del mesoderma e dei podociti. Questo metodo di differenziazione dei podociti può essere integrato con sistemi microfluidici organs-on-chip o tecnologie di bioprinting 3D per sviluppare modelli funzionali del rene umano per lo screening dei farmaci e i test di nefrotossicità.

La mancanza di modelli di coltura cellulare appropriati ha ostacolato i progressi nella comprensione dei meccanismi delle malattie renali. Questo protocollo fornisce ai ricercatori una fonte inesauribile di podociti derivati da pazienti per la modellazione della malattia.