Misurazione dell'edema cerebrale post-ictus, della zona infarct e della rottura della barriera ematica-encefalica in un singolo set di campioni cerebrali dei roditori
23 ottobre 2020
Questo protocollo descrive una nuova tecnica di misurazione dei tre parametri più importanti della lesione cerebrale ischemica sullo stesso set di campioni cerebrali di roditori. L'uso di un solo campione cerebrale è altamente vantaggioso in termini di costi etici ed economici.
Nel presente protocollo, presentiamo una tecnica di occlusione dell'arteria cerebrale media modificata che misura la lesione cerebrale ischemica per determinare una zona di infarto, l'edema cerebrale e la permeabilità della BBB nello stesso set di cervelli di roditori. In termini di costi etici ed economici, il vantaggio principale di questa tecnica è che è richiesto un solo campione di cervello per tutte e tre le misurazioni. Questa valutazione dei principali parametri della lesione cerebrale ischemica aiuterà a indagare in modo completo la fisiopatologia dell'ictus ischemico.
Per iniziare, rimuovi il cervello di topo e taglia sezioni orizzontali spesse 2 millimetri con una lama di rasoio in acciaio inossidabile da 0,009 pollici, non rivestita, a filo singolo. Posizionare le sezioni in TTC allo 0,005% e incubarle per 30 minuti a 37 gradi Celsius, quindi posizionare il tessuto cerebrale sui vetrini del microscopio ed eseguire la scansione ottica delle sei fette di cervello con una risoluzione di 1600 x 1600 DPI. Usa un editor di foto per aggiungere un filtro blu alle immagini.
Dopo aver aperto il software, vai su immagine, regolazioni e mixer dei canali. Selezionare blu come canale di uscita e selezionare monocromatico, quindi fare clic su OK. Salvare l'immagine nel formato di file JPEG.
Utilizzare lo strumento di selezione poligono in ImageJ versione 1.37 per selezionare ogni emisfero di ciascuna delle sei sezioni del cervello e salvarlo come file immagine separato. Per calcolare il volume dell'infarto e l'edema cerebrale, utilizzare una macro per convertire i pixel dell'immagine in bianco o nero, in base a una soglia. Quindi, chiudi tutti i file e usa una seconda macro per confrontare il numero di pixel bianchi e neri per determinare il volume dell'infarto e l'edema cerebrale.
Copia i dati grezzi in un foglio di calcolo. Quando si calcola il volume dell'infarto, correggere il gonfiore dei tessuti utilizzando i rapporti degli emisferi cerebrali omolaterali e controlaterali. Esprimere le aree di edema cerebrale come percentuale delle aree standard dell'emisfero controlaterale non interessato.
Determinare l'interruzione della barriera ematoencefalica 24 ore dopo l'occlusione. Dividere gli emisferi destro e sinistro in sei fette e mettere ogni fetta in una provetta da microcentrifuga. Omogeneizzare ogni fetta di tessuto cerebrale in acido tricloroacetico, utilizzando 4 millilitri di acido tricloroacetico al 50% per grammo di tessuto cerebrale.
Centrifugare i campioni a 10.000 volte G per 20 minuti, quindi trasferire il surnatante in una provetta nuova e diluirlo 1:3 con etanolo al 96%. Eseguire la spettrofotometria di luminescenza con un lettore di piastre. Un t-test campione indipendente ha indicato che 19 ratti sottoposti a occlusione permanente dell'arteria cerebrale media, o MCAO, hanno dimostrato un aumento significativo del volume dell'infarto cerebrale rispetto ai 16 ratti operati in simulazione.
I ratti sottoposti a MCAO permanente hanno anche dimostrato un aumento significativo dell'entità dell'edema cerebrale e della rottura della barriera ematoencefalica dopo 24 ore, rispetto agli animali operati in modo fittizio. Quando si tenta questa procedura, è importante assicurarsi che la concentrazione chimica sia conforme al protocollo. Questo protocollo consente di valutare tutti e tre i parametri del danno ischemico in un campione del cervello.
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Panoramica
Questo protocollo descrive una tecnica modificata di occlusione dell'arteria cerebrale media per valutare la lesione cerebrale ischemica valutando le zone di infarto, l'edema cerebrale e la permeabilità della barriera emato-encefalica (BBB) negli stessi campioni di cervello di roditori. L'utilizzo di un singolo campione di cervello migliora l'efficienza etica ed economica consentendo al contempo un esame completo della fisiopatologia dell'ictus ischemico.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Lesioni cerebrali ischemiche
- Modelli di roditori
Contesto
- L'ictus ischemico è una causa significativa di morbilità e mortalità.
- La valutazione di molteplici parametri di lesione cerebrale può migliorare la comprensione dei meccanismi dell'ictus.
- I metodi attuali spesso richiedono campioni multipli, creando vincoli etici e di risorse.
- Questo studio introduce un approccio semplificato per misurare vari indicatori di danno utilizzando un singolo campione.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare una tecnica per misurare il volume di infarto, l'edema e la rottura della BBB nei cervelli dei roditori.
- Migliorare l'efficienza delle risorse e ridurre la dipendenza da più campioni animali.
- Facilitare una comprensione più completa della lesione cerebrale ischemica e della guarigione.
Metodi utilizzati
- Il metodo prevede l'uso di campioni di cervello di ratto dopo aver indotto l'ischemia tramite occlusione dell'arteria cerebrale media.
- Le sezioni del cervello vengono preparate e analizzate per vari parametri di lesione, inclusi l'edema e l'integrità della BBB.
- I passaggi chiave includono l'elaborazione delle immagini, l'analisi dei pixel per i calcoli del volume di infarto e la spettrofotometria per la valutazione della rottura della BBB.
- I dati vengono quantificati e confrontati tra i gruppi ischemici e di controllo utilizzando l'analisi statistica.
Risultati principali
- Il protocollo ha permesso la misurazione simultanea del volume di infarto, dell'edema e dell'integrità della BBB nei modelli di ratto.
- Aumenti significativi di questi parametri sono stati osservati nei ratti con ischemia indotta rispetto ai controlli.
- I risultati evidenziano l'efficacia di questa tecnica nella valutazione dei danni ischemici riducendo l'uso di animali.
Conclusioni
- Questo studio dimostra un metodo nuovo per la valutazione simultanea di parametri chiave della lesione cerebrale ischemica.
- L'approccio migliora la comprensione della patologia dell'ictus e facilita pratiche di ricerca più etiche.
- Le implicazioni si estendono a potenziali sviluppi terapeutici e alla comprensione delle strategie neuroprotettive.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Measuring multiple ischemic injury parameters in a single rodent brain sample reduces animal use and experimental variability, supporting ethical and cost-efficient preclinical stroke research. This integrated assessment enables more reliable target validation and mechanistic de-risking in neuroprotective drug discovery. The method enhances predictive confidence by correlating infarct volume, edema, and BBB permeability within the same biological system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking infarct zone, edema, and BBB breakdown in a unified pathophysiological readout.
- Operational Value: Reduces sample size requirements, improving throughput and consistency in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides standardized, quantitative outputs for infarct volume and edema via pixel-based image analysis, supporting assay reproducibility.
- Operational Value: Uses accessible tools like ImageJ macros and spectrophotometry, facilitating technology transfer across discovery teams.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling key stroke pathophysiology endpoints in a single sample.
- Operational Value: Supports longitudinal assessment of biomarker continuity from discovery through preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, offering multiparametric readouts that inform go/no-go decisions in stroke therapeutics.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by enabling concurrent measurement of structural and functional injury markers.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative data on infarct and edema through standardized image processing and normalization.
- Analytics: Generates comparable datasets via luminescence spectrophotometry for BBB integrity and corrected infarct volume calculations.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to preclinical continuity by validating edema and BBB disruption as translatable injury biomarkers.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating neuroprotective compounds across multiple injury dimensions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing biological noise from inter-animal variability in multiparametric stroke assessment.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through defined sectioning, staining, and image analysis protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing animal consumption and enabling higher-information-content experiments.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stroke therapeutics based on concordant infarct, edema, and BBB data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, image analysis (ImageJ), and spectrophotometry for accurate parameter quantification.
- Depends on precision instrumentation including microtomes, plate readers, and calibrated imaging systems.
- Necessitates cross-team standardization of staining thresholds, macro parameters, and data normalization procedures.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different rodent strains or injury models.
- Practical limitations include dependency on consistent tissue sectioning and chemical reagent purity for reliable BBB measurements.
