Istituzione e manutenzione di scarafaggi americani gnotobiotici (Periplaneta americana)

Il protocollo di generazione di scarafaggi gnotobiotici facilita il test dell'impatto della rimozione e sostituzione della comunità microbica intestinale nativa sulla salute dell'ospite e sull'assemblaggio del microbioma. Questa tecnica utilizza metodi provenienti da più fonti per formare un flusso di lavoro coeso e semplificato per generare scarafaggi gnotobiotici senza l'uso di costose attrezzature da laboratorio speciali. Considerando le molte diverse parti mobili di questo protocollo gnotobiotico, la visualizzazione aiuta i ricercatori a stabilire più facilmente le proprie strutture gnotobiotiche su piccola scala, a basso costo e da banco.

Per facilitare la raccolta del numero appropriato di femmine che trasportano ootecae per gli esperimenti previsti, utilizzare le forcep per spostare i tubi di cartone contenenti femmine gravide nel serbatoio di stoccaggio. Se un tubo di cartone contiene più insetti oltre alla femmina gravitata, agitare il contenuto del tubo in un contenitore di plastica aggiuntivo a suonato di vaselina e incoraggiare l'insetto bersaglio a risalire nel solo tubo di cartone. Al momento della raccolta, trasferire ogni donna gravita nel reparto maternità.

Una volta che le femmine hanno lasciato cadere le loro oothecae, riportare le femmine al serbatoio di stoccaggio e usare le forcep per recuperare le oothecae dalla lettiera. Per pulire le ootecae, posizionare fino a cinque casse di uova in un tubo di centrifuga da cinque millilitri contenente tre millilitri di solfato di dodecil di sodio e vortice dell'ootecae per 10 secondi. Dopo un secondo lavaggio come appena dimostrato, utilizzare una delicata salvietta per pulire delicatamente la superficie di ogni ootheca per rimuovere eventuali detriti e posizionare l'ooteca pulita in una barca di pesare.

Prima della sterilizzazione, riempire due tubi di centrifuga da 1,5 millilitri per ootheca con un millilitro di acqua sterile per tubo. Aggiungere inoltre 10 microlitri di soluzione di stock di acido peracetico al 32% a 3,2 millilitri di acqua distillata doppia in un tubo di centrifuga da cinque millilitri in una cappa aspirante. Cappuccio e invertire più volte per mescolare e posizionare fino a cinque ootece pulite nella soluzione di acido peracetico allo 0,1% preparata al momento per cinque minuti, invertendo il tubo più volte ogni 60 secondi.

L'acido peracetico è un forte ossidante un occhio, una pelle e un irritante respiratorio ed è infiammabile e corrosivo. Indossare sempre i DPI appropriati durante la manipolazione e smaltire i rifiuti in modo appropriato. Al termine dell'incubazione, utilizzare forcep sterili e una cappa di flusso laminare per trasferire ciascuna ooteca al proprio tubo di centrifuga di acqua di risciacquo sterile.

Invertire più volte per mescolare prima di trasferire le ootecae al secondo set di tubi di acqua di risciacquo. Dopo il secondo risciacquo, utilizzare forcep sterili per trasferire le ootecae ai singoli slant BHI. Posizionare le inclinazioni in un contenitore secondario sterilizzato e spostare il contenitore in un incubatore umidificato di 30 gradi Celsius per quattro o cinque settimane fino alla schiusa.

Controllare regolarmente le inclinazioni da una a due volte a settimana per la crescita fungina o batterica fino alla quarta settimana, a quel punto le inclinazioni devono essere controllate quotidianamente. Quando le ninfe iniziano a schiudersi, utilizzare forcep sterili e una cappa di flusso laminare per trasferire aseticamente un pellet di chow di ratto sterilizzato in un pallone BHI preparato. Come controllo di sterilità, posizionare il pallone nel contenitore secondario nell'incubatore di 30 gradi Celsius per 24 ore per confermare la mancanza di crescita contaminante.

Se il pallone è rimasto sterile, scuotere le ninfe dall'inclinazione, lasciandole cadere nel pallone nel cappuccio di flusso laminare. Quindi innaffia le ninfe con 300 microlitri di acqua sterile una volta alla settimana nel cappuccio del flusso laminare. Quando le feci delle ninfe iniziano a coprire il pavimento medio, trasferire le ninfe in un nuovo pallone BHI contenente chow di ratto sterilizzato aggiunto con 24 ore di anticipo, come dimostrato.

Le femmine gravide possono essere identificate dall'ootheca attaccata ai loro addome posteriori. Le ooteca si schiudono in media 34 giorni dopo la sterilizzazione. In caso di sterilizzazione non riuscita, la crescita può apparire intorno alle ooteca durante l'incubazione, compromettendo lo stato gnotobiotico dei piccoli.

Quindi il tasso di crescita ninfa può essere monitorato misurando la lunghezza del corpo dell'insetto. Il polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione del DNA ribosomiale 16S da una ninfa omogeneizzata può essere usato per confermare lo stato gnotobiotico. Gli scarafaggi gnotobiotici possono essere inoculati con comunità microbiche sintetiche o xenobiotiche.

Mentre questo particolare flusso di lavoro è nuovo, studi precedenti che utilizzano scarafaggi gnotobiotici hanno generato informazioni sull'assemblaggio del microbioma intestinale e sui ruoli microbici nel plasmare il comportamento sociale, la salute intestinale e l'immunità dei loro ospiti di insetti.