Name: Fabbricazione di una nanoma matrice biomimetica con nanotubi di base Janus e fibronectina per ladesione delle cellule staminali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Scopri come assemblare una nano-matrice biomimetica con nanotubi di base Janus e fibronectina per promuovere l'adesione delle cellule staminali mesenchimali umane. Questo metodo offre potenziale per la rigenerazione ossea.

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Questo lavoro è sostenuto finanziariamente da NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) e University of Connecticut.

1. Sintesi dei JBNT
NOTA: Il monomero JBNT è stato preparato come pubblicato in precedenza11.
<ol><li>Sintesi del composto A1<ol>
<li>Preparare una soluzione contenente 8,50 g di acido 2-cianoacetico e 9,80 g di etilcarbamato in 25 mL di toluene e 2,5 mL di N, N-dimetilformamide. Aggiungere 4,90 mL di cloruro di fosforile dropwise. Quindi scaldare la miscela a 70 °C e continuare a mescolare per 1,5 ore.</li>
		<li>Raffreddare la miscela di reazione a temperatura ambiente e versare 100 g di acqua ghiacciata. Estrarre lo strato acquoso con acetato di etile (3 x 250 mL) e lavare con 100 mL di salamoia. Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per ottenere un solido giallo pallido.</li>
		<li>Sottosoggettare la cromatografia a colonna flash del solido giallo al gel di silice (3% di metanolo/diclorometano) per produrre 15,61 g di composto A1 come polvere bianca.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A2<ol>
<li>Mescolare 3,12 g di composto A1 e 2,75 g di carbonato di potassio in 50 mL di N, N-dimetilformamide. Mescolare a temperatura ambiente per 2 ore.</li>
		<li>Aggiungere 2,6 mL di disolfuro di carbonio alla sospensione di reazione. Continuare a mescolare per 4 ore.</li>
		<li>Aggiungere l'etanolo assoluto alla miscela di reazione a 0 °C. Filtrare il precipitato giallo e lavare con etere dietile. Asciugare sotto vuoto durante la notte per produrre 6,18 g di composto A2 come solido giallo pallido.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A3<ol>
<li>Aggiungere 2,7 mL di ioduro di metile in 15 mL di acetonitrile. Inoltre, preparare separatamente una soluzione di composto A2 aggiungendo 6,18 g di A2 a 80 mL di acqua / acetonitrile (rapporto 7:3). Mescolare entrambe le soluzioni e mescolare a temperatura ambiente per 30 minuti.</li>
		<li>Scaldare la miscela di reazione a 95 °C e continuare a mescolare per 3 ore.</li>
		<li>Raffreddare la miscela di reazione a temperatura ambiente, quindi evaporare i volatili sotto vuoto.</li>
		<li>Estrarre il residuo 3x con 100 mL di acetato di etile e lavare con salamoia. Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per ottenere un solido giallo.</li>
		<li>Sottosoggettare il solido giallo alla cromatografia della colonna flash del gel di silice (30% acetato/esani etilico) per produrre 4,52 g del composto A3 come solido giallo chiaro.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A4<ol>
<li>Preparare la soluzione di alleilamina aggiungendo 925 μL di alleilamina in 20 mL di etanolo. Aggiungere questa soluzione dropwise alla soluzione del composto A3, preparato aggiungendo 3,14 g di A3 in 75 mL di etanolo assoluto, oltre 30 min. Quindi riscaldare la miscela di reazione al reflusso per 16 ore.</li>
		<li>Raffreddare la miscela di reazione a temperatura ambiente ed evaporare i volatili per dare un solido giallo.</li>
		<li>Sottosoggettare la cromatografia a colonna flash del solido giallo al gel di silice (50% di acetato/esani etilico al 2% di metanolo/diclorometano) per produrre 1,80 g di composto A4 come cristallo bianco.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A5<ol>
<li>Aggiungere 2,05 g di cloridrato di guanidinio e 7,8 mL di etoossido di sodio (21 wt% in etanolo) in 14 mL di etanolo assoluto. Scaldare la miscela a 45 °C per 15 minuti.</li>
		<li>Filtrare il materiale insolubile e aggiungere il filtrato direttamente nella soluzione del composto A4, preparato aggiungendo 2,70 g di A4 in 40 mL di etanolo assoluto. Riscaldare la miscela di reazione al reflusso per 16 ore.</li>
		<li>Filtrare il precipitato per ottenere 2,65 g di composto A5 come solido bianco sconto.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A6<ol>
<li>Aggiungere lentamente 24,9 mL di trietilammina alla miscela di liquami ottenuta aggiungendo 2,11 g di composto A5 e 1,10 g di 4-dimetilaminopiridina in 120 mL di tetraidrofurano oltre 1 min. Mescolare a temperatura ambiente per 2 minuti.</li>
		<li>Aggiungere 20,7 mL di di-tert-butil dicarbonato dropwise alla miscela di reazione e continuare a mescolare a temperatura ambiente per 40 h.</li>
		<li>Aggiungere 20 mL di acqua per spegnere la reazione. Evaporare i volatili sotto vuoto.</li>
		<li>Estrarre il residuo viscoso rosso con 500 mL di acetato di etile. Quindi, lavarlo con 250 mL di acqua, 75 mL di acido citrico al 10%, 2x con 200 mL di acqua, 200 mL di bicarbonato di sodio saturo e 200 mL di salamoia. Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per dare un solido rosso/arancione.</li>
		<li>Sottosoggettare la cromatografia a colonna flash in gel di silice (acetato/esani di etile allo 0-20%) per produrre 3,87 g di composto A6 come schiuma bianca.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A7<ol>
<li>Aggiungere N-metilmorfolina N-ossido (50 wt.% in acqua, 1,64 mL) dropwise alla soluzione di composto A6 (2,93 g) in acetone/acqua (8:1, 58,5 mL) e mescolare a temperatura ambiente per 5 min.</li>
		<li>Aggiungere tetraossido di osmio (soluzione acquosa al 4%) dropwise alla miscela per un periodo di 3 minuti e continuare a mescolare a temperatura ambiente per 24 ore.</li>
		<li>Spegnere la reazione con solfito di sodio acquoso da 1,0 M fino a quando la soluzione diventa incolore. Rimuovere i volatili sotto vuoto per provocare un liquame bianco in acqua. Estrarre il residuo con 350 mL di diclorometano e quindi lavare con 150 mL di acqua seguito da un lavaggio con 150 mL di salamoia.</li>
		<li>Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per produrre 2,45 g di composto A7 come solido bianco.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A8<ol>
<li>Aggiungere 760 g di perioduro di sodio alla miscela di 1,36 g di composto A7 in 35 mL di diclorometano/acqua (6:1, 35 mL) e mescolare a temperatura ambiente per 42 ore.</li>
		<li>Filtrare il materiale insolubile e concentrare il filtrato sotto vuoto. Estrarre il residuo risultante con 250 mL di diclorometano, quindi lavare con 100 mL di acqua e 100 mL di salamoia. Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per dare il prodotto grezzo.</li>
		<li>Sottosoggettare il prodotto grezzo alla cromatografia a colonna flash in gel di silice (5-40% acetato/esani etilico, quindi 5% metanolo/diclorometano) per produrre 1,08 g di composto A8.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A9<ol>
<li>Preparare una soluzione di 830 mg di composto A8 in 15 mL di 1,2-dicloroetano. Aggiungere la soluzione di dropwise alla miscela di 6-benzilossicarbonilamino-2-L-acido ammino-esanoico trimetilsilil estere etilico (649,5 mg) e N N-diisopropiletililammina (591 μL) in 24 mL di 1,2-dicloroetano oltre 3 min e mescolare a temperatura ambiente per 15 min.</li>
		<li>Aggiungere 360,3 mg di triacetossiboroidro di sodio alla soluzione e continuare a mescolare a temperatura ambiente per 24 ore.</li>
		<li>Dissetare la miscela di reazione con 6 mL di acqua. Estrarre la miscela di reazione 3x con 200 mL di diclorometano e lavare con 200 mL di acido citrico 10% in acqua, 2x con 200 mL di acqua, 200 mL di bicarbonato di sodio saturo e 200 mL di salamoia in questo ordine. Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per ottenere il prodotto grezzo.</li>
		<li>Sottosoggettare il prodotto grezzo alla cromatografia a colonna flash in gel di silice (acetato/esani etilico al 5-30%) per produrre 885 mg di composto A9.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del monomero JBNT<ol>
<li>Sciogliere 0,54 g di composto A9 (0,54 g) in 10 mL di acido trifluoroacetico/soluzione di tioanisole al 94% e mescolare a temperatura ambiente per 72 ore.</li>
		<li>Aggiungere l'etere dietile (80 mL) alla miscela di reazione e centrifugare il precipitato verso il basso. Versare l'acido trifluoroacetico chiaro contenente supernatante e lavare il precipitato bianco con etere dietile e metanolo per produrre monomero JBNT grezzo da 168,6 mg(File supplementare 1).</li>
		<li>Purificare il monomero JBNT grezzo da una cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) con una colonna in fase inversa. Il programma di isolamento è elencato di seguito: SolventE A: 100% acqua; solvente B: acetonitrile al 100%; solvente C: pH=1 soluzione d'acqua HCl; portata: 3 mL/min (cfr. tabella 1).</li>
		<li>Raccogli il picco più grande a circa 7,2 minuti.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fabbricazione per JBNT/FN
<ol><li>Aggiungere 80 μL di soluzione acquosa JBNT da 1 mg/mL a 40 μL di soluzione acquosa FN da 1 mg/mL e pipetta più volte.</li>
	<li>Verificare la presenza di sospensioni solide bianche dopo pipettazione per circa 10 s. NOTA: è stato girato un video per acquisire il processo di auto-assemblaggio di NM (Supplemental File 2).</li>
</ol>3. Osservazione di esemplari lyophilizzati
NOTA: Questo passaggio viene eseguito per mostrare la struttura dell'impalcatura della MN realizzata con JBNT e FN.
<ol><li>Preparare soluzioni FN, JBNT e FN/JBNT NM per l'osservazione dei materiali lyophilizzati. Diluire 10 μL di 100 μg/mL di FN con 40 μL di acqua distillata per fare una soluzione di 20 μg/mL di FN.</li>
	<li>Preparare 100 mg/mL di soluzione di JBNT diluire 5 μL di 1 mg/mL di JBNT in 45 μL di acqua DI.</li>
	<li>Mescolare 10 μL di 100 μg/mL FN e 5 μL di 1 mg/mL di JBNT in 35 μL di acqua DI per formare la soluzione di MN.</li>
	<li>Rivestire tre pozzi di micropiatte inferiori rotonde a 96 ben chiare rispettivamente con la soluzione FN, JBNT e NM. Ogni pozzo riceve 50 μL della soluzione.</li>
	<li>Eseguire la liofilizzazione, come descritto di seguito, per visualizzare la struttura dell'impalcatura della MN.<ol>
<li>Congelare la piastra a -80 °C durante la notte.</li>
		<li>Accendere lo strumento lyophilized e la pompa per vuoto.</li>
		<li>Premere il pulsante di raffreddamento per ridurre la temperatura del sistema a -50 °C.</li>
		<li>Mettere la piastra congelata nello strumento liofilizzato e chiudere tutte le aperture degli strumenti.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante start per ridurre la pressione del sistema a 0,9 mbar.</li>
		<li>Dopo 4 ore, premere il pulsante di aerazione e aprire la valvola per aumentare la pressione del sistema alla pressione atmosferica.</li>
		<li>Estraere il piatto dal lyophilized instrument.</li>
		<li>Utilizzare un microscopio per osservare l'FN, i JBNT e la MN autoassemblata risultante. Scatta diverse fotografie con una fotocamera per i materiali.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Misurazione degli spettri di assorbimento
NOTA: utilizzare la modifica degli spettri per FN e JBNT per presentare il JBNT/FN NM12 autoassemblato.
<ol><li>Mescolare 30 μL di 100 μg/mL FN con 15 μL di acqua distillata e 5 μL di 1 mg/mL di JBNT per preparare la soluzione JBNT/FN NM. Le sospensioni solide bianche possono essere viste più volte dopo aver pipettato la soluzione. NOTA: Le concentrazioni finali di JBNT e FN nella soluzione sono rispettivamente di 100 μg/mL e 60 μg/mL. Sono state inoltre preparate come soluzioni di controllo le soluzioni JBNT e FN alla stessa concentrazione a quella utilizzata nella soluzione NM.</li>
	<li>Diluire 5 μL di 1 mg/mL di JBNT con 45 μL di acqua distillata per preparare la soluzione di controllo JBNT.</li>
	<li>Diluire 30 μL di 100 μg/mL FN con 20 μL di acqua distillata per preparare la soluzione di controllo FN.</li>
	<li>Misurare gli spettri di assorbimento UV-vis delle soluzioni FN, JBNT e JBNT/FN NM con lo spettrofotometro (vedi Tabella dei materiali)per caratterizzare l'assemblaggio di NM.<ol>
<li>Fate clic sul pulsante UV-Vis. Pulire la superficie di prova dello spettrofotometro e rilasciarvi 2 μL di acqua distillata. Misuralo come vuoto da 190-850 nm.</li>
		<li>Pulire la superficie di prova dello spettrofotometro e rilasciarla 2 μL di soluzione FN. Misurare gli spettri di assorbimento UV-Vis della soluzione FN da 190 nm a 850 nm.</li>
		<li>Pulire la superficie di prova dello spettrofotometro e rilasciarla 2 μL di soluzione JBNT. Misurare gli spettri di assorbimento della soluzione JBNT da 190 nm a 850 nm.</li>
		<li>Pulire la superficie di prova dello spettrofotometro e rilasciarla 2 μL di soluzione di NM JBNT/FN. Misurare gli spettri di assorbimento della soluzione di NM JBNT/FN da 190 nm a 850 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Preparazione della MN JBNT/FN per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
<ol><li>Pulire diverse griglie prima della colorazione negativa con un detergente al plasma di base (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Eseguire la colorazione negativa per i campioni seguendo due diversi processi.<ol>
<li>Far cadere 3 μL di 1 mg/mL di soluzione acquosa di JBNT e 3 μL di soluzione di MN JBNT/FN su griglie separate e lasciarlo per 2 min. Quindi sciacquare ogni griglia con soluzione di 100 μL di acetato di uranile (UA) 0,5%. Scolare la soluzione in eccesso con carta da filtro e asciugare all'aria le griglie.</li>
		<li>Mescolare 9 μL di soluzione di NM JBNT/FN con 3 μL di soluzione di UA al 2,0% e pipettarla più volte. Pipettare la soluzione mista sulle griglie e tenerla sulle griglie per 2 minuti. Utilizzare una carta da filtro per rimuovere la soluzione mista dalle griglie e asciugare le griglie a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infine, caratterizzare l'esemplare per JBNT, JBNT/FN NM macchiato con passo 5.2.1 e JBNT/FN NM macchiato con passo 5.2.2 con il TEM.</li>
</ol>6. Saggio di funzione biologica in vitro
<ol><li>Aggiungere 200 μL di controlli negativi (NC, PBS), JBNT, FN e le soluzioni NM JBNT/FN in un unico pozzo di una diapositiva a camera a 8 pozzi, rispettivamente.</li>
	<li>Congelare asciugare il coverglass a camera a 8 elementi con lo strumento liofilizzato per rivestire i materiali sul fondo dei pozzi. Il protocollo per la liofilizzazione è lo stesso del passaggio 3.5.</li>
	<li>Quindi aggiungere 10.000 cellule/pozzi hSPC (Passaggio 3) nei pozzi e incubarli per 24 ore a 37 °C con il 5% di CO2.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, pipettare il mezzo di coltura cellulare dai pozzi e risciacquare la coltura con soluzione 1x PBS.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL della soluzione fissante ad ogni bene con le cellule e lasciare per 5 minuti. Risciacquare delicatamente le cellule con 1x PBS due volte.</li>
	<li>Diluire dall'1% Triton-X 100 allo 0,1%. Aggiungere 100 μL dello 0,1% di Tritone-X 100 ad ogni pozzo con le cellule e lasciare per 10 minuti. Risciacquare delicatamente le cellule con 1x PBS due volte.</li>
	<li>Diluire la rodimina Phalloidin a 1,65 μM. Aggiungere 100 μL di rodimina Phalloidin ad ogni pozzo con cellule e incubare il vetro di copertura a camera tenuto lontano dalla luce a temperatura ambiente per 30 minuti. Risciacquare delicatamente le cellule con 1x PBS due volte.</li>
	<li>Cattura le immagini cellulari con un microscopio fluorescente.</li>
	<li>Contare i numeri di cella nelle immagini fluorescenti per ogni gruppo. Calcolare la densità di adesione cellulare calcolando in media tre aree casuali in ogni pozzo.</li>
	<li>Presentare tutti i dati come ± deviazione standard (SD). Eseguire analisi statistiche utilizzando un test t a una coda, seguito da un'analisi della varianza (ANOVA) con p<0.05, che è considerata statisticamente significativa.</li>
</ol>

<ol><li>Yao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+mobilization+of+exogenous+mesenchymal+stem+cells+to+bone+for+fracture+healing+and+sex+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference.</a> Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).</li>
<li>Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+vitronectin+and+collagen+I+promotes+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).</li>
<li>Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+convergence+of+fracture+repair+and+stem+cells%3A+interplay+of+genes%2C+aging%2C+environmental+factors+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).</li>
<li>De Becker, A., Riet, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homing+and+migration+of+mesenchymal+stromal+cells%3A+How+to+improve+the+efficacy+of+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy.</a> World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).</li>
<li>Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+rosette+nanotubes+encapsulate+and+slowly+release+dexamethasone%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).</li>
<li>Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+rosette+nanotubes+for+incorporating+hydrophobic+drugs+in+physiological+environments%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).</li>
<li>Fenniri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helical+Rosette+Nanotubes%3A+Design%2C+Self-Assembly%2C+and+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+rosette+nanotube%2Fhydrogel+composites+for+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).</li>
<li>Van den Bogaerdt, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+cross-linking+by+adipose-derived+mesenchymal+stromal+cells+and+scar-derived+mesenchymal+cells%3A+Are+mesenchymal+stromal+cells+involved+in+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).</li>
<li>Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+molecule+visualized+in+electron+microscopy%3A+a+long%2C+thin%2C+flexible+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand.</a> Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).</li>
<li>Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. U. S. Patent. , 20170362238A1 (2017).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+biomimetic+Nano-Matrix+for+stem+cell+Anchorage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+and+Research%22%5BJournal%5D)">Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage.</a> Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).</li>
<li>Jones, M., Leroux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+micelles+-+a+new+generation+of+colloidal+drug+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).</li>
<li>Singh, P., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+and+stem+cell+differentiation+-+lessons+from+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis.</a> Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).</li>
<li>Martino, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+integrin+specificity+and+stem+cell+differentiation+in+2D+and+3D+environments+through+regulation+of+fibronectin+domain+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability.</a> Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).</li>
<li>Somaiah, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+promotes+higher+adhesion%2C+survival+and+proliferation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells.</a> PLoS One. 10 (12), 0145068(2015).</li>
<li>Ogura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+the+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow+and+enhancement+of+cell+attachment+by+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin.</a> Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).</li>
<li>Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Printing+of+scaffolds+for+tissue+regeneration+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).</li>
<li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structurally+and+functionally+optimized+silk-fibroin-gelatin+scaffold+using+3D+printing+to+repair+cartilage+injury+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Material%22%5BJournal%5D)">Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo.</a> Advanced Material. 29, 1701089(2017).</li>
<li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+inflammatory+activation+by+self-assembling+Rosette+nanotubes+in+human+Calu-3+pulmonary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells.</a> Small. 4 (6), 817-823 (2008).</li>
<li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosette+nanotubes+show+low+acute+pulmonary+toxicity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).</li>
</ol>

Il Dr. Yupeng Chen è co-fondatore di NanoDe Therapeutics, Inc.

In questo studio, abbiamo sviluppato una MN biomimetica auto-assemblata, che è stata formata con JBNT e FN ispirati al DNA. Durante la preparazione della soluzione JBNT, la polvere liofilizzata JBNT deve essere sciolta nell'acqua al posto del PBS perché pbs causerà l'agglomerazione di JBNT, che inibisce il loro assemblaggio. Inoltre, la MN dovrebbe anche essere assemblata in acqua se vogliamo osservare le strutture nano-fibrille della MN, perché il sale in PBS si impacchelerà con le fibre nm, il che può ridurre notevolme...

Le cellule staminali mesenchimali umane (hSPC) hanno mostrato il potenziale di auto-rinnovamento e auto-differenziazione lungo diversi lignaggi mesenchimali, il che aiuta nella rigenerazione e nel mantenimento dei tessuti1. In base al potenziale di differenziazione, gli hMSC sono considerati candidati per lesioni mesenchimali del tessuto e terapia del disturbo ematopoietico2. hSPC hanno dimostrato la capacità di promuovere la guarigione delle ferite aumentando la riparazione dei tessuti, l'angiogenesi e riducendo l'infiammazione3. Tuttavia, senza assistenza biochimica o biomateriale, l'efficienza per gli hMSC di raggiungere un tessuto bersaglio e funzionare nella posizione desiderata è bassa4. Sebbene varie impalcature ingegnerizzate siano state utilizzate per attirare gli HMSC ad aderire alle lesioni, alcuni siti come la frattura della piastra di crescita, nel mezzo di un osso lungo, non sono facilmente accessibili dalle impalcature prefabburate convenzionali, che potrebbero non adattarsi perfettamente a un sito ferito di forma irregolare.
Qui, abbiamo sviluppato un nanomateriale biomimetico che può auto-assemblarsi in situ ed essere iniettato in un'area bersaglio difficile da raggiungere. La bio-impalcatura iniettabile NM è composta da nanotubi di base janus (JBNT) e fibronectina (FN). I JBNT, noti anche come Nanotubi di Rosetta (RTT), derivano da coppie di basi di DNA, in particolare timina e adenina,qui 5,6,7. Come si vede nella Figura 1, i nanotubi si formano quando sei molecole delle coppie di basi di DNA derivate si auto-assemblano tramite legami idrogeno per formare unpiano 6. Sei molecole vengono quindi impilate l'una sull'altra in un piano attraverso una forte interazione di pi-stacking7, che può essere lunga fino a 200-300 μm. I JBNT sono progettati per imitare morfologicamente le fibre di collagene in modo che FN reagisca con loro.
FN è una glicoproteina adesiva ad alto peso molecolare, che può essere trovata nella matrice extracellulare (ECM)9. Questi possono mediare l'attaccamento delle cellule staminali ad altri componenti dell'ECM, in particolarecollagene 10. Abbiamo progettato JBNT per imitare morfologicamente le fibre di collagene in modo che FN possa reagire con loro per formare la MN in pochi secondi attraverso il legame non covalente. Pertanto, la MN è una promettente bio-impalcatura da iniettare in un sito di frattura ossea che non potrebbe essere accessibile dalle impalcature fabbricate convenzionalmente. Qui, la MN iniettabile presenta un'eccellente capacità di migliorare l'ancoraggio hMSC in vitro, esibendo il loro potenziale di servire come impalcatura per la rigenerazione dei tessuti.

<table><tbody><tr><td>1,2-dicloroetano</td><td>Alfa Aesar</td><td>39121</td><td></td></tr><tr><td>acido 2-cianoacetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C88505</td><td></td></tr><tr><td>4-dimetilamminopiridina</td><td>TCI America</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>8 pozzetti Coverglass a camera</td><td>Thermo Fisher</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>etanolo</td> <td>assolutoThermo Fisher</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>allilamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>145831</td><td></td></tr><tr><td>Detergente al plasma di base</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC32G</td><td></td></tr> acido <tr><td>citrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>concentrato acido cloridrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Acqua deionizzata</td><td>Thermo Fisher</td><td>15230147</td><td></td></tr><tr><td>diclorometano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>etere etilico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>Di-terz-butil dicarbonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>361941</td><td></td></tr><tr><td>acetato di etile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319902</td><td></td></tr><tr><td>etilcarbammato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione fissativa (4% formaldeide preparata in PBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R37814</td><td></td></tr><tr><td>guanidinio cloridrato</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13543</td><td></td></tr><tr><td>esani</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227064</td><td></td></tr><tr><td>umano cellule staminali mesenchimali</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>metanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>ioduro di metile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289566</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diisopropiletilammina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17114</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetilformammide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>N-metilmorfolina N-ossido</td><td>Alfa Aesar</td><td>A19802</td><td></td></tr><tr><td>Tetraossido di osmio</td><td>Alfa Aesar</td><td>45385</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tampone fosfato</td><td>Thermo Fisher</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di fosforile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201170</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>347825</td><td></td></tr><tr><td>colonna di fase inversa</td><td>Thermo Fisher</td><td>25305-154630</td><td></td></tr><tr><td>Budamina Falloidina</td><td>Thermo Fisher</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>gel di silice</td><td>TCI America</td><td>S0821</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>etossido di sodio</td><td>Alfa Aesar</td><td>L13083</td><td></td></tr><tr><td>periodide di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71859</td><td></td></tr><tr><td>solfato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>solfito di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0505</td><td></td></tr><tr><td>triacetossiboroidruro di sodio</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22060</td><td></td></tr><tr><td>spettrofotometro (NanoDrop One/Onec UV-Vis)</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>BulletKit</td><td></td><td>Lonza PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>tetraidrofurano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>tioanisolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T28002</td><td></td></tr><tr><td>toluene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179418</td><td></td></tr><tr><td>trietilammina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12646</td><td></td></tr><tr><td>acido trifluoroacetico</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12198</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

fabbricazione di una nanoma matrice biomimetica con nanotubi di base janus e fibronectina per l'adesione delle cellule staminali

Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

Una MN biomimetica è stata sviluppata per fungere da impalcatura biologica di ingegneria tissutale, che può migliorare l'ancoraggio delle cellule staminali. La MN biomimetica è formata da JBNT e FN attraverso l'auto-assemblaggio in una soluzione acquosa. I JBNT misurano 200-300 μm di lunghezza con canali cavi idrofobici interni e superfici idrofile esterne. I JBNT sono caricati positivamente e le FN sono addebitate negativamente. Pertanto, quando iniettati in una soluzione acquosa neutra, vengono legati insieme tramite incollaggio non covalente per formare i fasci di MN. Il processo di auto-assemblaggio viene completato in pochi secondi senza alcun iniziatore chimico, fonte di calore o luce UV. Quando il pH della soluzione NM è inferiore al punto isoelettrico delle FN (pI 5.5-6.0), i bundle nm si auto-rilasciano a causa della presenza di FN caricato positivamente.
La MN è nota per imitare morfologicamente la matrice extracellulare (ECM) e quindi può essere utilizzata come impalcatura iniettabile, che fornisce un'eccellente piattaforma per migliorare l'adesione hMSC. L'analisi della densità cellulare e gli esperimenti di imaging a fluorescenza hanno indicato che gli NMS hanno aumentato significativamente l'ancoraggio degli HMS rispetto al controllo negativo.

I nostri studi hanno scoperto che la formazione della MN di JBNT e FN è veloce, cosa che è avvenuta in 10 secondi. Come illustrato nella figura 2, il floccule bianco è stato ottenuto quando la soluzione JBNT è stata miscelata con la soluzione FN e pipettata più volte. Il processo di formazione della MN è completamente biomimetico. Non sono necessari stimoli esterni. Il processo di fabbricazione è molto più facile di quello di alcuni biomateriali emergenti, che si basa sulla luce ultraviolett...

L'obiettivo di questo protocollo è mostrare l'assemblaggio di una nanomatrice biomimetica (NM) con nanotubi di base Janus (JBNT) e fibronectina (FN). Quando sono co-coltivate con cellule staminali mesenchimali umane (hSPC), le TM mostrano un'eccellente bioattività nell'incoraggiare l'adesione degli HMSC.

Fabbricazione di una nanoma matrice biomimetica con nanotubi di base Janus e fibronectina per l'adesione delle cellule staminali

A biomimetic NM was developed to serve as a tissue-engineering biological scaffold, which can enhance stem cell anchorage. The biomimetic NM is formed ...

Abbiamo sviluppato una nano-matrice biomimetica che promette di fungere da impalcatura per l'ingegneria tissutale. Questo protocollo dimostra come assemblare la nano-matrice da nanotubi di base di Giano sintetizzati nel mio laboratorio, così come la proteina fibronectina. Questa nano-matrice può autoassemblarsi in pochi secondi senza l'utilizzo di alcuna assistenza aggiuntiva.Quando è stata co-coltivata con cellule staminali mesenchimali umane, la nano-matrice ha mostrato un'eccellente bioattività nell'incoraggiare l'adesione cellulare. La nano-matrice imita morfologicamente la matrice extracellulare. Pertanto, ha il potenziale per fungere da impalcatura iniettabile per riparare le fratture ossee promuovendo l'adesione e la funzione cellulare nella posizione target.Inizia fabbricando la nano-matrice. Aggiungere 80 microlitri di nanotubi di base Janus da un milligrammo per millilitro a 40 microlitri di fibronectina da un milligrammo per millilitro e pipettare la miscela delicatamente e lentamente più volte. Dopo 10 secondi, ispezionare visivamente il tubo per verificare la presenza di una sospensione solida bianca.Successivamente, preparare soluzioni di fibronectina, JBNT e fibronectina/JBNT nano-matrice per l'osservazione di materiali liofilizzati secondo le indicazioni del manoscritto. Rivestire tre pozzetti di una micropiastra a fondo tondo trasparente a 96 pozzetti con soluzioni, aggiungendo 50 microlitri a ciascun pozzetto. Congelare la piastra a meno 80 gradi Celsius durante la notte.Il giorno successivo, accendere lo strumento liofilizzato e la pompa del vuoto e premere il pulsante di raffreddamento per ridurre la temperatura del sistema a meno 50 gradi Celsius. Inserire la piastra congelata nello strumento e chiudere tutte le aperture. Fare clic sul pulsante di avvio per ridurre la pressione del sistema a 0,9 millibar.Dopo quattro ore, premere il pulsante di aerazione e aprire la valvola per aumentare la pressione del sistema alla pressione atmosferica. Quindi, estrarre la piastra dallo strumento liofilizzato. Preparare la soluzione di nano-matrice JBNT/fibronectina come descritto nel manoscritto del testo e diluire le soluzioni JBNT e fibronectina con acqua distillata per ottenere soluzioni di controllo.Misurare gli spettri di assorbimento delle soluzioni con lo spettrofotometro per caratterizzare l'assemblaggio di nano-matrici. Fare clic sul pulsante UV-vis. Quindi, pulire la superficie di prova dello spettrofotometro e far cadere due microlitri di acqua distillata su di essa.Misurare l'acqua in bianco da 190 a 850 nanometri. Per ogni campione, pulire la superficie del test e far cadere due microlitri della soluzione su di essa. Quindi, misurare gli spettri di assorbimento UV-vis da 190 a 850 nanometri.Aggiungere 200 microlitri di controlli negativi, JBNT, fibronectina e le soluzioni a nano-matrice nei pozzetti di un vetrino a otto pozzetti. Liofilizzare il vetro coprioggetto a otto pozzetti con lo strumento liofilizzato per rivestire i materiali sul fondo dei pozzetti. Quindi, aggiungere 10.000 cellule staminali mesenchimali umane a ciascun pozzetto del vetro di copertura e incubarlo per 24 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno di coltura cellulare dai pozzetti e sciacquarli con PBS. Aggiungere 100 microlitri di soluzione fissativa in ogni pozzetto e lasciarlo per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, sciacquare delicatamente le cellule con PBS due volte e aggiungere 100 microlitri di Triton X-100 allo 0,1% in ciascun pozzetto.Dopo 10 minuti, ripetere i risciacqui con PBS. Aggiungere 100 microlitri di falloidina di rodamina in ogni pozzetto e incubare il coverglass a camera per 30 minuti, proteggendolo dalla luce. Sciacquare le cellule due volte con PBS e visualizzarle con un microscopio a fluorescenza.La formazione della nano-matrice è rapida e completamente biomimetica. Il flocculo bianco era visibile 10 secondi dopo che la soluzione di JBNT era stata miscelata con la soluzione di fibronectina. Sono state catturate e analizzate le immagini della fibronectina, dei JBNT e della nano-matrice.Non sono state osservate fibre lunghe nel gruppo della fibronectina, indicando che la struttura dell'impalcatura non può formarsi senza JBNT. I JBNT appaiono come fibre lunghe e sottili. Quando reticolata con la fibronectina, la fibra della nano-matrice può crescere fino a diversi centimetri di lunghezza.L'assemblaggio della nano-matrice è stato confermato anche ottenendo spettri UV-vis. I due picchi di assorbimento dei JBNT da soli diminuiscono dopo la formazione della nano-matrice. La microscopia elettronica a trasmissione è stata utilizzata per caratterizzare la morfologia dei JBNT e delle nano-matrici.I JBNT sono tubi sottili con diametri uniformi. Quando mescolati con la fibronectina, formano una lunga nano-matrice di fibromi attraverso interazioni di carica. Quando il pH è inferiore al punto isoelettrico della fibronectina, la nano-matrice si autorilascia a causa della fibronectina caricata positivamente.È stato anche esplorato l'effetto della nano-matrice JBNT/fibronectina sull'adesione cellulare. Poiché le nano-matrici sono progettate per imitare morfologicamente la matrice extracellulare, forniscono un'impalcatura e aumentano l'adesione cellulare. La microscopia a fluorescenza ha confermato che l'incubazione con le nano-matrici ha aumentato l'adesione cellulare.Nella seguente procedura, la migrazione cellulare, la differenziazione e la funzione a lungo termine possono essere dimostrate per esplorare ulteriormente l'effetto della nano-matrice sulla crescita e sulle funzioni delle cellule staminali mesenchimali umane.

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Fabbricazione di una nanoma matrice biomimetica con nanotubi di base Janus e fibronectina per l'adesione delle cellule staminali

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