Quantificazione dell'assunzione di macronutrienti in uno schermo neuronale termogenetico usando larve di Drosophila

Il nostro protocollo consente l'identificazione delle popolazioni neuronali larvali codificando le scelte nutrizionali relative al controllo dei livelli di assunzione di due importanti macronutrienti, proteine e carboidrati. La semplicità e la produttività relativamente elevata del nostro metodo consentono la quantificazione dell'assunzione di cibo per diversi genotipi esposti a diverse condizioni nutrizionali. Per attraversare geneticamente le linee parentali, allestisci gabbie di raccolta di embrioni da 60 millimetri con piastre dietetiche per l'allevamento L3 integrate con un po' di pasta di lievito attivo.

Trasferisci le femmine vergini adulte di TripA1 e i maschi di Janelia GAL4 di età compresa tra cinque e otto giorni nelle gabbie di raccolta degli embrioni e lascia che l'accoppiamento avvenga per 24-48 ore a 25 gradi Celsius con il 60% di umidità e un ciclo di buio chiaro di 12, 12. Dopo il periodo di accoppiamento, trasferire le mosche adulte accoppiate su piastre dietetiche fresche per l'allevamento L3 e lasciare che la deposizione delle uova avvenga per tre o quattro ore a 25 gradi Celsius. Assicurati che tutte le piastre siano etichettate con il genotipo e la data di deposizione dell'uovo.

Al termine del periodo di deposizione delle uova, rimuovere le piastre dalle gabbie e stimare il numero di uova per piastra contando il numero di embrioni in un quarto della piastra. Mantenere la densità larvale a un massimo di 200 embrioni per piastra e coprire le piastre con coperchi di plastica. Incubare le piastre di allevamento L3 a 18 gradi Celsius, 60% di umidità e un ciclo di buio di 12, 12 luci per nove giorni.

Dopo l'incubazione, raccogliere tre gruppi di 10 L3 da ciascuno dei genotipi da testare, nonché un gruppo di 10 L3 per il controllo degli alimenti a colorante zero. Usa il numero cinque o una pinza leggera come una piuma per eseguire la raccolta delle larve il più delicatamente possibile. Trasferire le larve raccolte in barchette di plastica contenenti un millilitro d'acqua.

Installa un'incubatrice a 30 gradi Celsius e mantieni alti i livelli di umidità aggiungendo un vassoio pieno d'acqua per evitare la disidratazione larvale durante il test. Equilibrare la temperatura delle piastre di analisi riscaldandole a 30 gradi Celsius prima di iniziare. Assicurati che tutti i piatti siano etichettati con il genotipo e il rapporto proteine/carboidrati della dieta.

Shock termico delle larve sperimentali per due minuti trasferendo direttamente le barchette di plastica contenenti gli animali in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Impostare il numero richiesto di timer per un'ora, quindi scaricare accuratamente l'acqua dalle barche di plastica e trasferire i gruppi L3 dalle barche al centro delle piastre degli asset. Copri i piatti e avvia il timer.

Lasciare che le larve si nutrano per un'ora a 30 gradi Celsius al buio. Interrompere il test di alimentazione trasferendo le piastre in un bagno di ghiaccio. Preparare due microprovette da millilitri per ogni gruppo L3 testato contenenti perle di vetro sufficienti da 0,5 millimetri per riempire la parte inferiore della microprovetta e 300 microlitri di metanolo ghiacciato.

Utilizzare un dispositivo di raffreddamento da banco per mantenere fredde le microprovette. Recuperare con cura i gruppi L3 dalle piastre di dosaggio di alimentazione e trasferirli sui coperchi delle piastre con un po' d'acqua. Sciacquare le larve per rimuovere i residui di cibo dai loro corpi, facendo attenzione a evitare lesioni.

Trasferire le larve nelle microprovette preparate e lisarle con un lisante tissutale per estrarre il colorante alimentare dalle viscere. Trasferire gli estratti per pulire le microprovette da 1,5 millilitri capovolgendo direttamente le microprovette da due millilitri sulle nuove provette. Fallo delicatamente in modo che la maggior parte delle perle di vetro rimanga sul fondo del tubo da due millilitri.

Eliminare i detriti cellulari centrifugando gli estratti alla massima velocità e quattro gradi Celsius per 10 minuti, quindi trasferire i surnatanti in provette pulite da 1,5 millilitri. Per eseguire la quantificazione calorimetrica del consumo di cibo, preparare soluzioni standard di colorante blu diluendolo in serie uno a due in metanolo. Trasferire 100 microlitri dei campioni sperimentali, degli standard e del bianco nei pozzetti di una micropiastra da 96 pozzetti e misurare l'assorbanza a 600 nanometri.

Questo protocollo è stato utilizzato per quantificare le quantità relative di macronutrienti consumati per gli animali sotto attivazione termogenetica di specifiche popolazioni neuronali nel sistema nervoso larvale. L'attivazione di popolazioni distinte di neuroni ha influenzato significativamente il bilanciamento dei macronutrienti nelle larve di terzo stadio. Il modello di alimentazione osservato per la linea di controllo, qui indicato in colore grigio, mostra una diminuzione attesa dell'assunzione di cibo nelle diete con un rapporto proteine/carboidrati più elevato, dimostrando l'efficacia del metodo.

Le cinque classi fenotipiche che sono state stabilite per gli animali da esperimento erano mangiare molto e compensare la diluizione delle proteine mangiando troppo, mangiare molto, ma non compensare, mangiare poco, ma compensare, mangiare poco e non compensare, e mangiare in modo aberrante. Per ciascuna di queste classi fenotipiche e genotipi, sono mostrati i modelli di GFP nel sistema nervoso centrale delle larve di terzo stadio. Quando si tenta questo protocollo, è importante generare larve di terzo stadio sincronizzate con lo sviluppo precoce al fine di ridurre al minimo la variazione associata al comportamento animale.

Seguendo questo protocollo, l'etichettatura radio degli alimenti consentirebbe la conferma e l'ulteriore dissezione dei risultati riscontrati con questo metodo.