Elettroencefalogramma video continuo durante l'ipossia-ischemia nei topi neonatali
11 giugno 2020
Questo manoscritto descrive un metodo per registrazioni EEG video continue utilizzando elettrodi di profondità multipli in topi neonatali sottoposti a ipossia-ischemia.
L'encefalopatia ipossico-ischemica è la causa più comune di convulsioni neonatali. Questo modello murino di crisi ischemiche ipossiche e di videoencefalografia continua o EEG può aiutare ulteriormente la nostra comprensione e caratterizzazione delle crisi neonatali. Questa tecnica facilita l'acquisizione di registrazioni di videoencefalografia di alta qualità in un modello di lesione neonatale e può aiutare in studi futuri sui meccanismi delle convulsioni neonatali, sugli esiti e sui test terapeutici.
A dimostrare la procedura sarà Pravin Wagley. Uno specialista di laboratorio del mio laboratorio. Per la chirurgia dell'impianto di elettrodi.
Dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del dolore in un topo anestetizzato dopo il parto del nono giorno, posizionare il topo in uno stadio stereotassico con un cono nasale e utilizzare il lato opposto della barra auricolare per tenere ferma la testa. Sterilizzare l'area dell'incisione sul cranio con tre scrub alternati di betaina ed etanolo al 70% e utilizzare un telo fenestrato per coprire il topo mantenendo visibile la regione dell'incisione. Aprire il cuoio capelluto anteriormente posteriore da leggermente sopra gli occhi e ritrarre circa mezzo centimetro di pelle.
Riposizionare la testa sul tavolino stereotassico in modo che la pelle tiri verso l'esterno per esporre il cranio e utilizzare un batuffolo di cotone per applicare il perossido di idrogeno. Usa la lama di un bisturi per raschiare accuratamente il cranio. E applicare una goccia di circa 50 microlitri di adesivo sull'osso.
Usa l'applicatore per stendere l'adesivo sul cranio e posiziona l'adesivo sotto la luce ultravioletta per 40 secondi. Quando l'adesivo si è solidificato, misurare le coordinate utilizzando come riferimento il bregma esposto. E usa un ago calibro 32 per creare fori per gli elettrodi bilateralmente nella regione CA1 dell'ippocampo, bilateralmente nella corteccia parietale e nel cervelletto.
Pulisci il sangue dalla superficie del cranio e usa il braccio stereotassico per abbassare gli elettrodi attaccati al connettore della presa femmina nel cervello. Impiantare ogni elettrodo nel cervello e fissare gli elettrodi in posizione con l'acrilico dentale. Incolla l'auricolare al cranio con altro acrilico dentale.
Iniettare per via sottocutanea cinque milligrammi per chilogrammo di ketoprofene in ogni cucciolo. Quando tutti gli elettrodi sono stati fissati in almeno metà della cucciolata, restituisci i cuccioli alla madre. 24 ore dopo l'impianto dell'elettrodo, posizionare ogni animale in una camera di plexiglas personalizzata a 37 gradi Celsius per la registrazione EEG e utilizzare un cavo flessibile di amplificazione operazionale su misura per collegare i cuccioli a un sistema di monitoraggio EEG video.
Utilizzare un amplificatore differenziale multicanale per digitalizzare i dati EEG a 1000 Hertz con un guadagno di un chilo e rivedere il segnale EEG in un software di analisi appropriato. Quindi registrare un EEG basale pre-infortunio per 30 minuti, prima di scollegare gli animali per la procedura di contenzioso dell'arteria carotide. Dopo aver registrato i dati EEG di base, sterilizzare la pelle tra la mandibola e la clavicola sul lato sinistro del collo con betaina ed etanolo come dimostrato.
E fai un'incisione di circa un centimetro sul lato sinistro del collo. Metti il cucciolo sotto un microscopio da dissezione e ritrai con cura il tessuto sottocutaneo e la pelle per esporre l'arteria carotide. Posizionare un pezzo di cinque centimetri di sutura di seta sterile sotto l'arteria.
Identificare il nervo vago e separare e ritrarre delicatamente il nervo dall'arteria. Manovrare la sutura in modo che sia solo sotto l'arteria. Dopo aver identificato il nervo vago, separare e ritrarre delicatamente il nervo dall'arteria e utilizzare una micro pinza per infilare un pezzo di cinque centimetri di sutura di seta sterile sotto l'arteria.
Legare una sutura a doppio nodo attorno all'arteria per occludere il flusso e tagliare la sutura in eccesso. Sostituire il tessuto sottocutaneo e la pelle sopra l'arteria esposta e utilizzare Vetbond per sigillare l'incisione. Quindi riposizionare l'animale in una camera a temperatura ambiente posta su un materasso riscaldante ed eseguire controlli della temperatura a infrarossi della temperatura interna del cucciolo per evitare di aprire la camera.
Dopo aver lasciato che i cuccioli si riprendessero per un'ora con il monitoraggio continuo della frazione di ossigeno inspirato, lavare la camera con 60 litri al minuto di azoto al 100% e 0,415 litri al minuto di ossigeno al 100%. Una volta che la saturazione di ossigeno nella camera raggiunge il 12%, diminuire il flusso di azoto a 10 litri al minuto mantenendo inalterato il flusso di ossigeno. Effettuando piccole regolazioni se necessario, mantenere la frazione di ossigeno inspirato all'8% per 45 minuti.
Dopo 45 minuti di esposizione all'ipossia, riportare la frazione di ossigeno inspirato al 21% e lasciare che i cuccioli si riprendano nella camera con monitoraggio EEG per due ore. Al termine del periodo di registrazione, scollegare i topi dal sistema EEG e restituire i cuccioli alla madre. Le registrazioni video EEG consentono di correlare i risultati elettrografici al comportamento in video.
La maggior parte degli eventi osservati in questo modello coinvolge comportamenti focali unilaterali o misti. Durante il periodo ipossico, un sottogruppo di topi mostra tipicamente un'attività convulsiva non compulsiva, durante la quale i cuccioli sono immobili con un'attività convulsiva sostenuta all'EEG. In questa analisi, l'attività basale era simile al background precedentemente descritto nei cuccioli di topo P 10.
Dopo il contenzioso e prima dell'inizio dell'ipossia, un sottogruppo di topi ha mostrato convulsioni convulsive. Dopo l'induzione dell'ipossia, l'ampiezza di fondo sull'EEG è stata ridotta. E sono state mostrate esplosioni intermittenti di scariche di onde di picco, seguite da soppressione.
I topi hanno mostrato convulsioni elettrografiche che emergono da uno sfondo soppresso come scariche ritmiche di onde spike che sono progredite fino a diventare più complesse e frequenti con le onde polis-spike. Durante l'ipossia, l'analisi dello spettrogramma di potenza è nota per le asimmetrie tra l'emisfero ischemico e quello controlaterale. L'emisfero ischemico mostra un pattern di soppressione dello scoppio e l'emisfero controlaterale mostra un fondo soppresso.
Durante la riossigenazione e il recupero, un sottogruppo di topi continua ad avere convulsioni per il resto del periodo di registrazione. Il fondo EEG è soppresso rispetto al basale dopo l'ipossia, con un recupero graduale osservato durante il periodo di registrazione post-ipossia. Quando si lavora con i cuccioli neonati, la precisione è fondamentale.
Inoltre, è necessario prestare particolare attenzione a riposizionare i cuccioli con la madre in gruppi dopo le procedure chirurgiche. L'elettroencefalografia video può essere utilizzata nei cuccioli neonatali in combinazione con istopatologia, imaging e comportamento per esaminare l'impatto delle convulsioni neonatali sulla chirurgia delle lesioni e sugli esiti comportamentali.
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Panoramica
Questo manoscritto descrive un metodo per registrazioni continue di elettroencefalogramma (EEG) mediante video con l'uso di multipli elettrodi profondi in topi neonati sottoposti a ipossia-ischemia. Questa tecnica facilita la comprensione delle crisi neonatali consentendo la correlazione tra i reperti elettrografici e gli eventi comportamentali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia neonatale
- Elettrofisiologia
Sfondo
- L'encefalopatia ipossico-ischemica è una delle principali cause di convulsioni neonatali.
- Comprendere i meccanismi alla base delle convulsioni neonatali è fondamentale per lo sviluppo di terapie.
- Un modello murino può fornire informazioni sulle caratteristiche delle convulsioni.
Scopo dello studio
- Sviluppare una tecnica di EEG video per osservare le crisi nei topi neonati.
- Caratterizzare le manifestazioni elettrografiche e comportamentali durante l'ipossia-ischemia.
- Migliorare futuri studi che indagano i meccanismi delle crisi neonatali.
Metodi Utilizzati
- Registrazioni continue di EEG video in un modello di lesione nei topi neonati.
- I topi neonati sono sottoposti a ipossia-ischemia cerebrale dopo l'implantazione degli elettrodi.
- I valori basali vengono registrati prima di indurre l'ipossia, seguiti dal monitoraggio della ripresa.
- Le procedure prevedono l'implantazione chirurgica degli elettrodi e un monitoraggio meticoloso.
Risultati principali
- I registri EEG hanno rivelato significativi cambiamenti elettrografici durante l'ipossia.
- Le crisi neonatali si sono caratterizzate per comportamenti focali unilaterali e pattern EEG distinti.
- Gli emisferi ischemici hanno mostrato pattern di tipo burst suppression rispetto agli emisferi contralaterali.
Conclusioni
- Questo studio dimostra un metodo prezioso per osservare le crisi neonatali in un contesto controllato.
- I risultati permettono una comprensione più approfondita dei meccanismi neurosviluppali alla base delle crisi.
- L'approccio ha un potenziale per migliorare le strategie terapeutiche nelle encefalopatie neonatali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il monitoraggio continuo dell'EEG mediante video nei topi neonati fornisce una piattaforma traslazionale per ridurre i rischi associati a ipotesi terapeutiche legate alle crisi epilettiche nello sviluppo preclinico. Permettendo un'analisi sincronizzata dei dati elettroencefalografici e del comportamento durante l'ipossia-ischemia, questo metodo supporta la validazione meccanicistica di composti anticonvulsivanti e di biomarcatori. Questo approccio aumenta la capacità predittiva nella fase iniziale della scoperta, modellando la semiologia delle crisi epilettiche neonatali umane e l'evoluzione dell'EEG in un sistema rilevante per la patologia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di bersagli terapeutici attraverso la correlazione tra biomarcatori EEG e comportamenti convulsivi in un modello di lesione ipossico-ischemica.
- Valore operativo: Facilita la valutazione dell'interazione con il bersaglio mediante letture elettrografiche in tempo reale durante l'esposizione al composto.
- Valore predittivo: Supporta lo screening fenotipico rilevando crisi elettrografiche e soppressione dell'attività di base come letture funzionali della disfunzione dei circuiti neurali.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera output quantitativi di EEG, inclusi spettrogrammi di potenza, frequenza dei discharge a punta-onda e asimmetria interemisferica, per la standardizzazione del saggio.
- Valore operativo: Consente il monitoraggio riproducibile dell'EEG dal basale alla condizione patologica attraverso diverse nidiate, supportando lo screening longitudinale di composti.
- Prontezza del saggio: Fornisce un sistema validato di EEG in topi neonati per il rilevamento ad alta fedeltà delle crisi convulsive e l'analisi delle tendenze di base.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Modella l'evoluzione delle crisi neonatali umane, inclusi comportamenti focali e schemi di soppressione-ripristino dell'EEG, per l'allineamento traslazionale dei biomarcatori.
- Valore operativo: Favorisce la continuità preclinica acquisendo in un unico flusso di lavoro il basale pre-danno, la dinamica della fase lesiva e il recupero post-ipossia.
- Contenimento del rischio: Permette di ridurre il rischio di insorgenza di crisi attraverso una fenotipizzazione oggettiva dell'EEG prima di test terapeutici avanzati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta stabilendo modelli di crisi validati tramite EEG prima delle fasi di screening dei composti e di ottimizzazione dei composti promettenti.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su bersagli neurali mediante la correlazione tra EEG e comportamento durante una sfida ipossico-ischemica.
- Screening: Fornisce metriche quantitative dell'EEG risolte nel tempo (ad esempio, soppressione a raffiche, scariche spike-wave) per il confronto degli effetti dei composti.
- Analisi: Permette l'analisi spettrale e il monitoraggio delle tendenze dello sfondo dell'EEG come lettura farmacodinamica della modulazione del bersaglio.
- Ricerca traslazionale: Si allinea ai biomarcatori clinici neonatali dell'EEG (ad esempio, soppressione a raffiche, asimmetria interemisferica) per garantire validità interspecie.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di monitoraggio dell'EEG riutilizzabile in modelli di crisi epilettiche, neurodegenerazione e disturbi neuroevolutivi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica collegando i fenotipi elettrografici alla semiologia comportamentale delle crisi epilettiche.
- Valore operativo: Standardizza l'acquisizione e l'analisi dell'EEG tra diversi studi, migliorando la riproducibilità tra laboratori.
- Valore strategico: Guida le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo quantificando il carico convulsivante e gli analoghi della depressione corticale progressiva nei modelli preclinici.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione ponderata sul rischio di terapie per il sistema nervoso centrale basandosi su un profilo oggettivo della suscettibilità alle crisi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in chirurgia su roditori neonati, impianto stereotassico di elettrodi e acquisizione di segnali EEG.
- Dipende da un controllo stabile della temperatura, della concentrazione di ossigeno e da camere di registrazione senza fili per un monitoraggio prolungato.
- Necessita di protocolli standardizzati di montaggio EEG, filtraggio e analisi spettrale per garantire la comparabilità tra studi.
- È limitato a una finestra di monitoraggio continuo di 4 ore a causa dei vincoli legati alla separazione dalla madre nei roditori neonati.
- Richiede la validazione istologica della posizione degli elettrodi per assicurare l’esattezza del targeting ippocampale, corticale e cerebellare.
Domande frequenti sul settore biotecnologico farmaceutico
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:48
Electrode Implantation Surgery
3:08
Baseline Electroencephalogram (EEG) Setup and Recording
3:59
Left Carotid Artery Ligation
5:37
EEG and Hypoxia
6:47
Results: Representative Continuous EEG Analysis During Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice
8:50
Conclusion
