Digestione di interi occhi di topo per l'analisi citometrica a flusso multi-parametro dei fagociti mononucleari
17 giugno 2020
Questo protocollo fornisce un metodo per digerire interi occhi in una singola sospensione cellulare ai fini dell'analisi citometrica del flusso multi-parametro al fine di identificare specifiche popolazioni fagocitiche mononucleari oculari, inclusi monociti, microglia, macrofagi e cellule dendritiche.
Questo protocollo è progettato per digerire gli occhi interi di topo in una singola sospensione cellulare per la citometria a flusso multiparametrica di fagociti mononucleati che includono macrofagi, monociti, microglia e cellule dendritiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di utilizzare l'analisi quantitativa con intensità fluoroforica per differenziare tipi di cellule strettamente correlati utilizzando l'espressione di marcatori di superficie cellulare. Il nostro protocollo è ottimizzato per l'analisi dell'eterogeneità dei macrofagi, includendo sia le popolazioni residenti che quelle infiltranti nel modello di neovascolarizzazione coroideale indotta da laser.
Tuttavia, questi concetti e tecniche possono essere ugualmente applicati ad altri modelli come la retinopatia diabetica, l'uveite autoimmune sperimentale e le manifestazioni del lupus. Quando si tenta questo protocollo, comprendere la configurazione del citometro è un punto di partenza fondamentale poiché non tutti i citometri sono configurati esattamente allo stesso modo. Pertanto, potrebbe essere necessario titolare i volumi di anticorpi coniugati fluorescenti e/o i fluorofori potrebbero dover essere regolati per ottimizzare il protocollo in base alla configurazione del citometro.
Inizia preparando il tampone per la digestione secondo le indicazioni del manoscritto. Utilizzando un microscopio da dissezione e un ingrandimento totale 10X, rimuovere la congiuntiva rimanente e il nervo ottico dagli occhi. Spostare gli occhi puliti su una piastra di dissezione asciutta o su una piccola pesa, quindi praticare due ferite perforanti con un angolo di 90 gradi tra loro attraverso l'asse visivo.
Utilizzare una siringa con un ago calibro 30 per iniettare da 0,15 a 0,2 millilitri di tampone digestivo nella cavità vitreale di ciascun occhio. Tritare gli occhi con forbici a molla e pinze sottili, quindi dissociare il tessuto del cristallino con un'interruzione meccanica smussata per evitare l'intasamento dei puntali delle pipette nei passaggi successivi. Sciacquare la pinza e le forbici con 0,75 millilitri di tampone digestivo e sostituire il piatto per ogni campione.
Utilizzare una pipetta P1000 per trasferire il contenuto della piastra in una provetta di dissociazione su ghiaccio, facendo attenzione a non perdere materiale. Sciacquare la capsula con altri 1,5 millilitri di tampone per la digestione e aggiungerlo al tubo di dissociazione, portando il volume totale tra 3,25 e 3,5 millilitri. Dissociare il tessuto su un dissociatore elettronico come descritto nel manoscritto del testo, assicurandosi che tutto il tessuto si trovi sul fondo del tubo di dissociazione rovesciato e a contatto con il tampone di digestione.
Quindi incubare la provetta di dissociazione a 37 gradi Celsius e 200 giri/min per 30 minuti. Ripetere la dissociazione tissutale altre due volte, incubando il campione a 37 gradi Celsius e 200 giri/min per 30 minuti tra le dissociazioni. Per fermare la reazione, aggiungere 10 millilitri di tampone di flusso freddo e posizionare le provette del campione sul ghiaccio.
Per creare una sospensione a singola cellula, filtrare la reazione di digestione dell'occhio arrestato attraverso un filtro da 40 micrometri posto sulla parte superiore di una provetta da centrifuga conica da 50 millilitri. Utilizzare lo stantuffo di una siringa da 2,5 millilitri per spingere eventuali pezzi rimanenti di tessuto oculare non digerito attraverso il filtro. Lavare il tubo di dissociazione con 10 millilitri di tampone di flusso e sciacquare il filtro.
Quindi utilizzare lo stesso stantuffo per far passare nuovamente i pezzi di tessuto oculare non digeriti attraverso il filtro. Ripetere questo processo con cinque millilitri di tampone di flusso. Quindi lavare il tubo di dissociazione e il filtro con gli ultimi 10 millilitri di tampone di flusso.
Centrifugare la provetta conica a 400 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e decantare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Rompere il pellet facendo scorrere il tubo contro un altro tubo. Quindi aggiungere un millilitro di soluzione lisanti e agitare la provetta a temperatura ambiente per 30 secondi per lisare i globuli rossi.
Arrestare la reazione con 20 millilitri di tampone di flusso e centrifugare la provetta conica a 400 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Decantare il surnatante senza disturbare il pellet della cella. Sbattere il tubo contro un altro tubo.
Quindi aggiungere cinque millilitri di HBSS freddo. Ripetere la centrifugazione e rimuovere il surnatante. Aggiungere 0,5 millilitri di colorante vivo morto a ciascun campione utilizzando una pipetta P1000, assicurandosi di dissociare completamente il pellet.
Trasferire i campioni in provette per microtitolazione da 1,2 millilitri e incubarli per 15 minuti al buio. Nel frattempo, contare un'aliquota di 10 microlitri del campione con blu di tripano e un emocitometro. Dopo l'incubazione, lavare ogni campione aggiungendo 400 microlitri di tampone a flusso freddo.
Centrifugare le provette in un rack per provette per microtitolazione a 400 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e aspirare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Risospendere completamente le cellule in 500 microlitri di tampone a flusso freddo. Quindi ripetere la centrifugazione e rimuovere il surnatante.
Blocca fino a cinque milioni di cellule viventi in 50 microlitri di blocco FC. Dissociare completamente il pellet cellulare e incubarlo a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Quindi aggiungere 50 microlitri di soluzione colorante per anticorpi a ciascun campione.
Mescolate completamente e incubate per altri 30 minuti a quattro gradi Celsius. Di seguito sono mostrate le proprietà dell'area di dispersione diretta rispetto all'area di dispersione laterale per tutti gli eventi analizzati da due occhi di un singolo topo. I conteggi dei microelementi sono stati puliti e confermati tracciando il PE su APC-Cy7, creando un gruppo ristretto di eventi PE positivi e APC-Cy7 negativi.
Successivamente, sono stati identificati singoletti in cellule vive da tutti gli eventi. I singoletti erano correlati positivamente nell'altezza di diffusione diretta rispetto all'area di diffusione in avanti, mentre le celle doppiette e triplette avevano un'area di diffusione in avanti maggiore rispetto all'altezza di diffusione in avanti. Le cellule vive sono positive per l'area di dispersione diretta e negative per la colorazione morta viva.
La strategia iniziale di gating per la delineazione di fagociti mononucleati da cellule singolette vive è mostrata qui. I singoletti vivi sono stati visualizzati utilizzando un grafico CD45 rispetto a CD11b. L'assenza di cellule CD45 positive nell'FMO CD45 ha confermato la selezione del gate.
Successivamente, i neutrofili, gli eosinofili, le cellule B, le cellule K e le cellule T sono stati esclusi tracciando singoletti vivi CD45 positivi con gate di lineage rispetto a CD11b. Le cellule CD45-dim sono state differenziate dalle cellule CD45-high. Sono stati identificati anche sottogruppi di macrofagi.
Le microglia sono state delineate nelle cellule CD45-dim con bassa colorazione MHC2 CD64 positiva. I macrofagi MHC2 negativi sono stati identificati come CD64 positivi MHC2 negativi. I macrofagi CD11c negativi e CD11c positivi sono stati dimostrati come CD64 positivi CD11c negativi.
e CD64 positivo, CD11c positivo nelle cellule MHC2 positive. È stato riscontrato che il trattamento laser ha aumentato la quantità di macrofagi MHC2 negativi, CD11c negativi e CD11c positivi. Anche la conta delle cellule dendritiche è stata sovraregolata dal trattamento laser, mentre la conta delle microglia e dei monociti non è stata influenzata.
La perfusione sistemica non ha avuto alcun effetto sul numero di macrofagi. Seguendo questa procedura, la selezione cellulare attivata dalla florescenza, piuttosto che la sola analisi, consente di caratterizzare l'eterogeneità dei macrofagi e il suo impatto sulla funzione tramite studi trascrittomici o proteomici.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per digerire occhi interi di topo in una sospensione di singole cellule da analizzare mediante citometria a flusso multiparametrica. L'attenzione è rivolta all'identificazione di specifiche popolazioni oculari di fagociti mononucleari, inclusi macrofagi, monociti, microglia e cellule dendritiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Immunologia
Sfondo
- La tecnica consente un'analisi quantitativa mediante l'intensità del fluorocromo.
- Permette di differenziare tipi cellulari strettamente correlati in base all'espressione dei marcatori della superficie cellulare.
- Ottimizzata per l'analisi dell'eterogeneità dei macrofagi.
- Applicabile a diversi modelli, come la retinopatia diabetica e l'uveite autoimmune.
Scopo dello studio
- Analizzare le popolazioni di fagociti mononucleati nei tessuti oculari.
- Migliorare la comprensione del ruolo dei macrofagi nelle malattie oculari.
- Fornire un metodo affidabile per l'analisi mediante citometria a flusso.
Metodi Utilizzati
- Digestione di occhi interi di topo in una sospensione di singole cellule.
- Citometria a flusso multiparametrica per l'analisi cellulare.
- Utilizzo di anticorpi coniugati con fluorocromi per la rilevazione di marcatori di superficie cellulare.
- Ottimizzazione basata sulla configurazione del citometro.
Risultati principali
- Identificazione riuscita di popolazioni distinte di fagociti monocitari oculari.
- Differenziazione quantitativa dei sottotipi di macrofagi.
- Informazioni sulla eterogeneità dei macrofagi nei modelli oculari.
- Protocollo adattabile a diverse condizioni sperimentali.
Conclusioni
- Il protocollo è efficace per l'analisi delle cellule immunitarie oculari.
- Fornisce un quadro per lo studio della dinamica dei macrofagi nelle malattie oculari.
- Comprendere la configurazione del citometro è fondamentale per un'implementazione corretta.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La citometria a flusso quantitativa multi-parametrica di occhi interi di topo consente una definizione precisa dei sottoinsiemi di fagociti mononucleari, supportando la riduzione del rischio meccanicistica nei modelli di malattie oculari. Questo approccio aumenta la sicurezza predittiva nella validazione degli obiettivi e nel profilo delle cellule immunitarie, influenzando direttamente le fasi iniziali della scoperta e i percorsi della ricerca traslazionale. L'adattabilità del metodo a diversi modelli di malattia rafforza il processo decisionale strategico nella ricerca e sviluppo di biotecnologie focalizzate sull'immunologia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette un'analisi rigorosa dell'eterogeneità delle cellule immunitarie innate nei tessuti oculari.
- Supporta la validazione funzionale delle target distinguendo le popolazioni di macrofagi residenti da quelle infiltranti.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistica attraverso l'analisi quantitativa dei marcatori.
- Migliora la sicurezza predittiva delle strategie terapeutiche immunomodulanti.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sospensioni singole di cellule validate per saggi di citometria a flusso ad alto contenuto.
- Standardizza le strategie di gating mediante controlli con fluorescenza meno uno e controlli monocromatici.
- Fornisce output quantitativi e riproducibili per l'identificazione di sottopopolazioni di cellule immunitarie.
- Consente un sorting cellulare affidabile a valle per flussi di lavoro trascrittomica o proteomica.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea il profilo immunitario a modelli oculari rilevanti per la malattia, come la neovascolarizzazione coroideale e la retinopatia diabetica.
- Permette una continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, consentendo il fate mapping e il tracciamento dei sottoinsiemi cellulari.
- Fornisce dati quantitativi per guidare decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio nei programmi di immunologia oculare.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e la ricerca preclinica, consentendo un'analisi immunitaria robusta, dalla verifica delle ipotesi all'identificazione del composto promettente.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la risoluzione dell'eterogeneità dei fagociti monocitari.
- Screening: Fornisce sospensioni singolari pronte per il saggio, riproducibili, con marcatura standardizzata e letture quantitative dei marcatori.
- Analisi: Offre misurazioni multiparametriche per l'analisi comparativa delle popolazioni di cellule immunitarie in diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Permette l'allineamento del profilo delle cellule immunitarie con modelli di malattia per la scoperta e la validazione di biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile per l'analisi delle cellule immunitarie in diversi modelli di malattie oculari e sistemiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi cellulari immunitari.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione dei campioni e le strategie di gating per un profilo immunitario riproducibile e scalabile.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti e migliora l'efficienza del capitale fornendo dati quantitativi robusti.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati terapeutici immunomodulanti in base al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in citometria a flusso e nella selezione dei marcatori cellulari immunitari.
- Necessita di accesso a citometri a flusso multicanale e a software analitici.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le strategie di gating e di controllo.
- Adattabile a diversi modelli di malattie oculari e sistemiche mediante ottimizzazione del protocollo.
- Limitato dalla perdita dell'architettura tissutale, che potrebbe richiedere approcci complementari di imaging.
