Una pipeline che utilizza l'elettroporazione bilaterale in utero per interrogare le influenze genetiche sul comportamento dei roditori

L'utilizzo di questo metodo può consentire di scoprire come alcuni cambiamenti dell'espressione genica possano essere attribuiti a patologie associate a malattie neurologiche. Il vantaggio di questa tecnica è che bypassa la necessità di creare o acquistare linee genetiche di animali che possono richiedere anni per essere create e convalidate. Questa tecnica consente lo studio di geni implicati nei disturbi neurologici.

Determinare in che modo geni specifici contribuiscono alla patologia è un passo importante nello sviluppo di nuove terapie. Il vantaggio di questo protocollo è imparare a manipolare gli embrioni in modo che lo sperimentatore realizzi la fase di trasferimento genico senza diminuire i tassi di sopravvivenza. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante perché gli embrioni sono molto fragili, quindi è utile osservare come uno sperimentatore esperto li manipola durante la procedura.

Portare le madri gravide nell'area dell'intervento chirurgico almeno 30 minuti prima dell'intervento. Sterilizzare l'intero sito chirurgico utilizzando salviette germicide sterilizzate e poi etanolo al 70%. Quindi sterilizzare gli strumenti dell'autoclave in uno sterilizzatore a microsfere di vetro.

Trasferire il PBS sterile in provette coniche da 50 millilitri e immergerle in un bagno d'acqua riscaldato a 38-40 gradi Celsius. Controllare la temperatura della soluzione salina sterile con un termometro. Accendere la pompa di circolazione del riscaldamento dell'acqua in modo che si riscaldi a 37 gradi Celsius.

Quindi accendere l'iniettore di pressione e l'elettroporatore e assicurarsi che funzionino correttamente. Far girare brevemente la soluzione di DNA al plasma su una centrifuga da tavolo e metterla sul ghiaccio. Tirare le pipette di vetro su un estrattore di pipette in modo che la punta della pipetta di vetro estratta abbia un diametro di circa 50 micrometri.

Quindi riempire la pipetta con 20-40 microlitri di soluzione di DNA. Prepara tutti gli elementi necessari per l'intervento chirurgico, tra cui lozione depilatoria, iodio, etanolo al 70%, tamponi di cotone, colliri, suture e garze. Prepara un foglio chirurgico e compila le informazioni necessarie.

Pesare il mouse prima dell'intervento chirurgico e registrare il peso. Dopo aver anestetizzato il topo, somministrare analgesici preoperatori e rimuovere il pelo dall'addome utilizzando una crema depilatoria o un rasoio. Sterilizzare l'addome tamponandolo con iodio povidone ed etanolo al 70% tre volte.

Crea un campo sterile intorno all'addome con garze e drappeggi sterili. Praticare un'incisione sulla linea mediana nella pelle addominale mentre si solleva la pelle con una pinza per evitare di tagliare il muscolo. Quindi solleva il muscolo e taglialo facendo attenzione a non tagliare gli organi vitali.

Estrarre con cautela le corna uterine dalla diga usando una pinza ad anelli e posizionarle delicatamente sul campo sterile, assicurandosi che siano supportate da un'imbottitura e non stiano tirando troppo lontano dalla diga. Mantieni il corno uterino inumidito per tutto il resto dell'intervento chirurgico con il PBS sterile preriscaldato. Posizionare un embrione con una pinza o con le dita, quindi inserire con cautela la pipetta di vetro estratta nella verticale laterale e iniettare due o tre microlitri in ciascun ventricolo inserendo la pipetta in uno e poi nell'altro ventricolo.

Il ventricolo è stato bersagliato con successo se dopo l'iniezione è presente una forma a mezzaluna. Per trasfettare bilateralmente le cellule nella corteccia frontale, posizionare i due elettrodi negativi ai lati della testa dell'embrione appena lateralmente e leggermente caudale ai ventricoli laterali e posizionare l'elettrodo positivo tra gli occhi proprio davanti al muso in via di sviluppo. Assicurati che l'embrione sia generosamente inumidito e applica quattro impulsi quadrati.

Iniettare ed elettroporare tutti gli embrioni, andando uno per uno in modo che ogni embrione venga elettroporato immediatamente dopo l'iniezione della soluzione di DNA. Una volta che tutti gli embrioni sono stati elettroporizzati, reinserire con cura le corna uterine nella cavità addominale. Rivestire la cavità addominale con PBS sterile per facilitare il posizionamento del corno uterino.

Riempire la cavità addominale con PBS sterile in modo che non rimangano sacche d'aria dopo il completamento della sutura. Sutura il muscolo con suture riassorbibili e la pelle con suture di seta non assorbibili. Lasciare che la diga si riprenda completamente in una camera riscaldata per almeno un'ora.

Controlla regolarmente le dighe nelle prossime 48 ore. Man mano che la diga si riprende dall'anestesia e riprende conoscenza, inizierà a muoversi e a sbattere. Questo metodo è stato utilizzato per trasfettare circa 5.000 neuroni piramidali di strato 2/3 con il plasmide pCAG-GFP.

La maggior parte di queste cellule erano localizzate nelle regioni corticali frontali. Un esempio rappresentativo mostra la distribuzione caudale rostrale dei neuroni trasfettati in un topo di controllo adulto, confermando la capacità delle IUE bilaterali di colpire e marcare geneticamente grandi popolazioni di neuroni piramidali nella corteccia frontale. La prima parte del compito di interazione materna verifica la capacità dei topi di controllo trasfettati con P18 di trovare lettiera nel nido.

I topi di controllo hanno trascorso più tempo a esplorare la lettiera del nido che a esplorare la lettiera fresca, suggerendo che hanno capacità motorie sensoriali intatte e un comportamento esplorativo. La seconda parte del compito sfrutta la tendenza dei topi ad essere motivati ad interagire con la madre. In questo compito, i cuccioli trascorrevano la maggior parte del loro tempo vicino alla madre, trascorrendo molto meno tempo a esplorare la tazza vuota o la lettiera del nido.

I topi di controllo adulti hanno trascorso circa il 35% del tempo esplorando un nuovo oggetto. Quando gli è stato presentato un romanzo e un oggetto familiare, i topi adulti hanno trascorso più tempo a esplorare il nuovo oggetto. Nel compito di socialità, i topi adulti di controllo hanno trascorso una quantità simile di tempo esplorando un nuovo topo e una tazza vuota.

Questo comportamento è stato monitorato automaticamente con il software DeepLabCut etichettando vari punti su un mouse, inclusi gli arti, il baricentro, la testa e le orecchie. Il software è stato utilizzato anche per determinare quando i topi si stavano impennando esaminando la lunghezza del corpo del topo, poiché questa distanza si accorcia quando il topo si impenna. Seguendo questa procedura, è possibile rispondere a molte domande molecolari cellulari esaminando il tessuto e analizzando diverse misure, come la densità della colonna vertebrale o i livelli di espressione di varie proteine.