Caratterizzazione di cellule immunitarie e mediatori proinfiammatori in ambiente polmonare

Questo protocollo può essere utilizzato per studiare le alterazioni dell'ambiente polmonare a seguito di ictus ischemico. Questo metodo consente l'identificazione di 13 tipi di cellule immunitarie polmonari e 13 diverse citochine e chemochine nello stesso topo tramite analisi citofluorimetrica. Questo metodo è stato utilizzato per valutare le alterazioni dell'ambiente polmonare a seguito di ictus ischemico.

Tuttavia, può anche servire a studiare i cambiamenti durante la risposta allergica o l'infezione. Per eseguire la perfusione transcardica di tutto il corpo, confermare la mancanza di risposta alla riflessione del pedale in un topo anestetizzato e fissare il topo a una piattaforma chirurgica. Bagnare la pelliccia con etanolo al 70% per ridurre la distribuzione della pelliccia nella cavità corporea e praticare un'incisione cutanea verticale sulla linea mediana per esporre il peritoneo intatto, interrompendo l'incisione non appena la cavità toracica è stata raggiunta.

Usa le forbici da dissezione fine per praticare un'incisione sulla linea mediana del peritoneo fermandoti prima della cavità toracica e usa una pinza per afferrare l'estremità distale dello sterno. Usa le forbici per tagliare il diaframma senza danneggiare il cuore, i polmoni o il sistema vascolare. Quando i tessuti sottostanti sono visibili, praticare un'incisione attraverso la gabbia toracica e fissare i lati delle costole in modo che il cuore e i polmoni siano completamente esposti.

Praticare con cautela una piccola incisione nell'atrio destro vicino all'arco aortico per fungere da deflusso per la perfusione e inserire rapidamente ma delicatamente un ago calibro 25 nella superficie superiore distale del ventricolo sinistro. Una volta posizionato l'ago, sciacquare delicatamente 10 millilitri di PBS freddo nel cuore. Il tessuto dovrebbe iniziare a liberarsi dal sangue.

Quando l'intero volume è stato erogato, perfondere una seconda aliquota di 10 millilitri di PBS freddo fino a quando il fegato mostra un aspetto marrone chiaro e i polmoni sono passati da un rosa rossastro a un colore prevalentemente bianco. Usando una pinza e forbici da dissezione fine, rimuovere con cura tutti i tessuti circostanti prima di separare i lobi polmonari e metterli in una capsula di Petri contenente uno o due millilitri di cellule polmonari fredde, medie su ghiaccio. Per preparare il tessuto polmonare per gli array di microsfere multiplex, aggiungere 200 microlitri di tampone di omogeneizzazione a freddo a una provetta da due millilitri contenente tre perle sterili da 2,3 millilitri di zirconia/silice e pesare il lobo polmonare di interesse.

Trasferire da 50 a 100 milligrammi di tessuto polmonare nella provetta pre-raffreddata di perle e tampone di omogeneizzazione e omogeneizzare il lobo utilizzando un omogeneizzatore a base di microsfere a 4.000 rotazioni al minuto per almeno due minuti. Quando il tessuto è stato completamente omogeneizzato, centrifugare la provetta per sedimentare il tessuto e trasferire il super natante in una microprovetta pre-raffreddata da 1,5 millilitri su ghiaccio. Per la dissociazione del tessuto polmonare, travasare accuratamente il mezzo cellulare polmonare dal lobo polmonare rimanente e inserire un ago calibro 25 nel tessuto.

Iniettare da 200 a 250 microlitri di tampone di dissociazione in ciascun lobo polmonare per gonfiare i polmoni fino a quando ciascuno dei lobi è stato iniettato due o tre volte. Dopo un'incubazione di due minuti a temperatura ambiente, utilizzare le forbici da dissezione fine per tritare i polmoni in piccoli pezzi e trasferire la soluzione tissutale in una provetta da 15 millilitri. Aggiungere sei millilitri di tampone di dissociazione aggiuntivo al campione e agitare energicamente per un minuto.

Quindi, incubare i pezzi di tessuto per 45 minuti a 37 gradi Celsius vorticando ogni sette-otto minuti. Al termine dell'incubazione, agitare energicamente il campione per un minuto e farlo passare attraverso un colino cellulare da 100 micron per rimuovere eventuali residui di tessuto connettivo e interstiziale indesiderato. Raccogliere il tessuto mediante centrifugazione e risospendere nel pellet con cinque millilitri di terreno polmonare freddo.

Centrifugare nuovamente il campione e risospendere il pellet in un millilitro di terreno polmonare freddo con un leggero vortice. Quindi, filtrare le cellule attraverso un colino da 100 micron prima di contare. Per valutare le popolazioni di cellule immunitarie all'interno del tessuto polmonare isolato, seminare da una a due volte 10 alla sesta cellula di potenza l'anticorpo inserito nel numero appropriato di pozzetti con una piastra inferiore rotonda da 96 pozzetti e smaltire le cellule sul fondo della piastra mediante centrifugazione.

Aggiungere 25 microlitri del cocktail di anticorpi appropriato in tampone FACS freddo a ciascun pozzetto e mescolare con una delicata carezza per tubi. Dopo 20 minuti, risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone FACS freddo per pozzetto e trasferire i campioni in singole provette a fondo tondo in polistirene da cinque millilitri contenenti 150 microlitri di tampone FACS aggiuntivo per provetta. Quindi, analizzare immediatamente i campioni su un citometro a flusso secondo i protocolli standard di analisi citofluorimetrica.

In questa analisi rappresentativa, sono state identificate 13 diverse popolazioni di cellule immunitarie nei polmoni utilizzando tre serie di combinazioni di anticorpi da cinque a sette. Le cellule morte sono state escluse utilizzando una colorazione morta viva e i diversi tipi di cellule immunitarie sono stati distinti utilizzando gli anticorpi e i marcatori elencati nella tabella. I macrofagi alveolari e interstiziali, le cellule dendritiche CD103 positive e CD11B positive e gli eosinofili sono stati identificati nel primo set.

I monociti e i neutrofili pro-infiammatori sono stati identificati nel secondo set e le cellule T CD4 positive e CD8 positive, le cellule B, le cellule dendritiche plasmacitoidi, le cellule NK e le cellule NKT sono state identificate nel set tre. Il numero totale di cellule vitali, la percentuale di cellule CD45 positive e il numero totale di cellule CD45 positive ottenute erano simili tra le popolazioni cellulari che sono state isolate, come dimostrato, e le popolazioni cellulari che sono state isolate utilizzando un dissociatore tissutale disponibile in commercio. Inoltre, la percentuale di morte cellulare tra le cellule CD45 positive era inferiore al 10% per entrambi i protocolli, suggerendo che il protocollo dimostrato facilita un recupero ad alta resa e alta qualità cellulare senza l'aiuto di un dissociatore tissutale automatizzato.

Inoltre, l'utilizzo di un test multiplex disponibile in commercio abbinato all'analisi citofluorimetrica consente di determinare la concentrazione di chemochine in ciascun campione per milligrammo di tessuto. La concentrazione di collagenasi D, il tempo di incubazione e la temperatura utilizzati durante l'isolamento di una singola cellula hanno un impatto critico sul recupero delle cellule immunitarie.