Biofunzionalizzazione di nanomateriali magnetici
16 luglio 2020
In questo lavoro, forniamo un protocollo per biofunzionalizzare nanomateriali magnetici con anticorpi per il targeting cellulare specifico. Ad esempio, utilizziamo nanofili di ferro per colpire le cellule tumorali.
La caratteristica chiave di questo protocollo, può essere applicato su un'ampia gamma di nanomateriali di ossido di ferro-ferro. Inoltre, può essere applicato su nanomateriali multisegmentati, come i nanofili ferro-oro. Questo protocollo può essere eseguito in sicurezza in qualsiasi laboratorio biologico standard.
I principali vantaggi di questa tecnica di biofunzionalizzazione sono la capacità di produrre un nanomateriale specificamente mirato basato su un forte legame covalente tra il nanofilo e gli anticorpi. Iniziate tagliando i dischi di alluminio in piccoli pezzi con una lama a un taglio e un piccolo martello. Metti i pezzi tagliati in un tubo da due millilitri e riempilo con un millilitro di idrossido di sodio monomolare, assicurandoti che tutti i pezzi di alluminio siano coperti.
Lasciare il tubo a temperatura ambiente in una cappa chimica per 30 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere i pezzi di alluminio con una pinzetta e mantenere i nanofili rilasciati in idrossido di sodio per altri 30 minuti. Posizionare la provetta in una griglia magnetica a secco, attendere due minuti e sostituire la soluzione con idrossido di sodio fresco.
Sonicare il tubo da due millilitri con i nanofili per 30 secondi e lasciarlo per un'ora all'interno di una cappa chimica. Ripeti questo passaggio almeno quattro volte. Al termine, posizionare la provetta da due millilitri nella rastrelliera magnetica, scartare l'idrossido di sodio e sostituirlo con un millilitro di etanolo assoluto.
Sonicare i nanofili per 30 secondi, posizionare il tubo nella rastrelliera magnetica e sostituire l'etanolo. Ripetere il lavaggio con etanolo almeno quattro volte. Dopo aver lavato i nanofili, trasferirli in una provetta di vetro da cinque millilitri con una pipetta da un millilitro.
Aggiungere 100 microlitri di APTES alla soluzione di nanofili e far vorticare il tubo di vetro per 20 secondi. Immergere il tubo in un bagno ad ultrasuoni e farlo sonicare per un'ora. Quindi estrarre il tubo dalla vasca e aggiungere 400 microlitri di acqua deionizzata e 20 microlitri di idrossido di sodio monomolare.
Ripetere la sonicazione di un'ora. Dopo aver tolto il tubo di vetro dal bagno a ultrasuoni, posizionarlo accanto a un magnete per raccogliere i nanofili. Sostituire il surnatante con un millilitro di etanolo assoluto fresco e sonicare il tubo per 10 secondi.
Ripetere il lavaggio con etanolo e la sonicazione due volte. Sciogliere 0,4 milligrammi di EDC e 1,1 milligrammi di Sulfo-NHS e un millilitro di MES in una provetta da due millilitri. In un altro tubo da due millilitri, aggiungi 960 microlitri di PBS 0,1 molare e aggiungi 30 microlitri di anticorpo anti-CD44.
Quindi, aggiungere 10 microlitri della miscela EDC/Sulfo-NHS precedentemente preparata a questo tubo. Mettere il tubo di anticorpi in uno shaker e agitarlo a 10 volte G per 15 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, posiziona un magnete accanto al tubo con i nanofili rivestiti di APTES per due minuti, scarta l'etanolo e sostituiscilo con PBS.
Sonicare i nanofili per 10 secondi. Dopo l'ultimo lavaggio con PBS, raccogliere i nanofili e trasferire la soluzione di anticorpi attivati nel tubo dei nanofili. Quindi sonicalo per 10 secondi.
Sostituire il tubo nel rotatore durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, raccogli i nanofili con il magnete e scarta il surnatante. Aggiungere un millilitro di BSA al 2% e incubare la provetta per un'ora a quattro gradi Celsius per bloccare la reazione.
La spettroscopia di perdita di energia elettronica o le mappe EELS possono essere utilizzate per visualizzare gli atomi di silicio sulla superficie del nanofilo e confermare la presenza del rivestimento APTES. Sui nanofili non rivestiti, gli atomi di ferro appaiono blu scuro e gli atomi misti di ferro e ossigeno sono blu chiaro. La corrispondente mappatura EELS di nanofili non rivestiti mostra una maggiore intensità di ferro rispetto all'ossigeno al centro rispetto alla superficie, indicando una struttura di ossido ferro-ferro.
La mappatura ha dimostrato che lo strato di ossido di ferro è costituito da più ossido di ferro (II, III) che di ossido di ferro (III). L'antigenicità degli anticorpi attaccati è stata confermata utilizzando i saggi di immunoprecipitazione e western blot. Il test BCA è stato utilizzato per quantificare il numero di anticorpi sui nanofili.
La misurazione del potenziale zeta è stata utilizzata per chiarire la funzionalizzazione della superficie. Il gruppo amminico terminale su APTES ha ridotto la carica negativa rispetto ai nanofili non rivestiti. La funzionalizzazione degli anticorpi ha ulteriormente ridotto la carica.
Il targeting cellulare specifico dei nanofili funzionalizzati con anticorpi è stato confermato utilizzando la microscopia confocale. Le figure A e B rappresentano le immagini al microscopio in campo chiaro rispettivamente del campione C e D. Il colore rosso corrisponde alla rappresentazione della membrana cellulare, il blu rappresenta il nucleo e i cluster verdi rappresentano la presenza di nanofili CD44 attaccati e mirati.
Inoltre, il test di vitalità cellulare è stato utilizzato per verificare che i nanofili non rivestiti, rivestiti di APTES e rivestiti di anticorpi fossero biocompatibili. Nel rivestimento di processo APTES, è molto importante aggiungere l'acqua deionizzata prima della soluzione di idrossido di sodio per migliorare il legame tra la molecola APTES e i nanofili. Inoltre, durante il processo di biofunzionalizzazione, è necessario lavare il nanofilo con tampone PBS un paio di volte per migliorare il legame covalente tra l'anticorpo e i nanofili.
Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per la bionanofunzionalizzazione di nanomateriali magnetici con anticorpi al fine di ottenere un indirizzamento cellulare specifico, in particolare utilizzando nanofili di ferro per colpire cellule tumorali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Nanotecnologia
- Biomateriali
- Biologia cellulare
Sfondo
- I nanomateriali magnetici hanno potenziali applicazioni nel rilascio mirato di farmaci.
- La bionanofunzionalizzazione aumenta la specificità dei nanomateriali verso particolari tipi cellulari.
- Le nanofili di ferro possono essere modificate per migliorarne le capacità di targeting.
- Comprendere l'interazione tra nanomateriali e sistemi biologici è fondamentale per le loro applicazioni.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo affidabile per la bionanofunzionalizzazione di nanofili di ferro.
- Dimostrare l'efficacia dei nanofili funzionalizzati con anticorpi nel bersagliare le cellule tumorali.
- Valutare la biocompatibilità dei nanofili modificati.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di nanofili di ferro mediante processi chimici.
- Rivestimento dei nanofili con APTES per facilitare l'attacco degli anticorpi.
- Utilizzo di EDC/Sulfo-NHS per attivare gli anticorpi.
- Caratterizzazione dei nanofili mediante spettroscopia di perdita di energia degli elettroni e misure di potenziale zeta.
Risultati principali
- Il protocollo ha prodotto con successo nanofili di ferro funzionalizzati con anticorpi.
- La microscopia confocale ha confermato il targeting specifico delle cellule tumorali da parte dei nanofili modificati.
- Gli saggi di biocompatibilità hanno indicato che i nanofili erano sicuri per applicazioni cellulari.
- La funzionalizzazione della superficie è stata convalidata mediante diverse tecniche di caratterizzazione.
Conclusioni
- Questa tecnica di bionanofunzionalizzazione consente il rilascio mirato di agenti terapeutici.
- Il protocollo può essere adattato per diversi tipi di nanomateriali.
- Applicazioni future potrebbero includere terapie oncologiche mirate mediante l'utilizzo di questi nanofili.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente la produzione di nanomateriali magnetici specificamente mirati mediante l'ancoraggio covalente di anticorpi, supportando lo sviluppo di terapie e diagnostica di precisione. Migliorando la specificità del bersaglio e permettendo un controllo magnetico a distanza, il metodo contribuisce alla riduzione dei rischi meccanicistici nei programmi oncologici in fase iniziale. L'approccio aumenta l'affidabilità predittiva degli interventi basati su nanomateriali, validando sia l'efficienza del targeting che la biocompatibilità.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante il targeting di specifici marcatori della superficie cellulare, come la sovraespressione di CD44 nelle cellule tumorali.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico confermando l'antigenicità degli anticorpi legati tramite immunoprecipitazione e western blot.
- Valore predittivo: Facilita la selezione del portafoglio dimostrando un targeting specifico e la biocompatibilità in modelli cellulari pertinenti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce sistemi biologici validati pronti per flussi di lavoro successivi, con funzionalizzazione della superficie confermata da misure di EELS e potenziale zeta.
- Valore operativo: Permette la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso legami covalenti controllati e passaggi di bloccaggio utilizzando BSA.
- Valore di scalabilità: Supporta il riutilizzo della piattaforma su nanomateriali a base di ferro-ossido di ferro e su nanomateriali segmentati multipli, inclusi nanofili di ferro-oro.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Dimostra la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica tramite il tracciamento mediante microscopia confocale e saggi di vitalità cellulare.
- Avanzamento basato sul rischio: Guida le decisioni di proseguimento o interruzione del progetto verificando la biocompatibilità dei nanomateriali non rivestiti, rivestiti con APTES e rivestiti con anticorpi.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Riduce l'ambiguità nei meccanismi di targeting collegando l'attacco dell'anticorpo al legame specifico con le cellule osservato nelle immagini.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto promettente, consentendo una valutazione affidabile dei composti mediante nanomateriali quantificabili e sensibili al campo magnetico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante il rilascio specifico su cellule tumorali positive per CD44.
- Screening: Garantisce prontezza per saggi e risultati quantitativi attraverso variazioni del potenziale zeta e modifiche superficiali confermate da EELS.
- Analisi: Fornisce letture misurabili come la quantità di anticorpi mediante saggio BCA e l'assorbimento cellulare mediante microscopia confocale.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica grazie alla dimostrata biocompatibilità e al targeting specifico in modelli cellulari.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per generare nanomateriali mirati in diversi progetti e formati di nanomateriali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nelle interazioni tra nanomateriali e cellule.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della bionanofunzionalizzazione in diversi contesti di laboratorio.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nello sviluppo di nanoterapie.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per rischio basate su profili di targeting e sicurezza validati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di nanomateriali, nella coniugazione di anticorpi e nelle tecniche di caratterizzazione superficiale.
- Presuppone l'accesso a bagni ad ultrasuoni, supporti magnetici e strumentazione per analisi EELS, potenziale zeta e western blot.
- Necessita di una standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per quanto riguarda i protocolli di lavaggio, bloccaggio e incubazione, al fine di garantire la coerenza tra i lotti.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si applica il metodo a forme, composizioni o chimiche superficiali diverse dei nanomateriali.
- Comprende limitazioni pratiche, come la necessità di un'accurata sequenza dei reagenti (ad esempio, acqua deionizzata prima dell'idrossido di sodio) per migliorare il legame dell'APTES.
