Name: Visualizzazione della degenerazione sinaptica nella Drosophila adulta in associazione con la neurodegenerazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Scopri la tecnica di dissezione del muscolo dorsale longitudinale in Drosophila melanogaster per valutare l'integrità delle giunzioni neuromuscolari. Questo metodo consente di studiare le malattie neurodegenerative come SLA, Parkinson e Alzheimer.

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Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health (R01 NS110727) a D.T.B.

1. Generazione di mosche transgeniche
<ol><li>Per generare mosche transgeniche per questo esperimento, raccogliere OK371-Gal425 mosche femminili vergini e maschi di UAS-TDP-43M337V 26 (Figura 1A) anesthetizing mosche con CO2 su un pad per ordinare.</li>
	<li>Ordinare le mosche anetizzate nelle fiale con i media drosophila standard per la croce. Posizionare fiale etichettate a 25 gradi centigradi per far emergere la prossima generazione. NOTA: Cancellare gli adulti dalle fiale prima che la progenie emerga per garantire il genotipo adeguato.</li>
	<li>Una volta che la progenie emerge, raccogliere le mosche transgeniche in fiale e ordinare per sesso per iniziare l'invecchiamento per le condizioni sperimentali.</li>
	<li>Una volta raccolte le mosche, trasferire le mosche al cibo fresco ogni 2 giorni fino a quando le mosche non hanno 21 giorni.</li>
</ol>2. Preparazione della dissezione
<ol><li>Per preparare le dissezioni, ottenere la salina tamponata di fosfato a temperatura ambiente (1x PBS), un piatto di dissezione di 10 cm rivestito con un elastomero di silicone, forbici per la sesticazione del bordo dritto, una serie di forcelle di dissezione smussate, una piptta P200 e punte di pipetta, tubi microcentrifuge da 2,0 mL, forbici da ufficio standard, 70% etanolo, un piatto Petri da 6 cm e 32% di formaldeide diluito al 4% con 1x PBS.</li>
	<li>Etichettare i tubi per ogni genotipo o condizione e aggiungere 900 L di 1x PBS (temperatura della stanza) e 150 L di formaldeide del 32% per ogni tubo. Indossare guanti e occhiali di sicurezza durante la preparazione del fissativo di formaldeide 4%.</li>
	<li>Anestesizzare 6-u201210 mosche per gruppo direttamente dalla fiala con CO2 e immergere le mosche in un piatto Petri di 6 cm con 70% di etanolo. Premere le mosche verso il basso nell'etanolo utilizzando un pennello per garantire che i campioni siano completamente sommersi. Questo rimuoverà lo strato di olio sulla cuticola esterna.</li>
</ol>3. Isolamento e fissazione del torace
<ol><li>Prima di sezionare ogni esemplare, aggiungere circa 7 u201210 mL di 1x PBS al piatto di dissezione rivestito con elastomero di silicone. Questo volume dovrebbe garantire che i campioni di tessuto siano completamente sommersi.</li>
	<li>Trasferire una mosca al piatto di dissezione dal 70% di etanolo usando le fortip delle contunde e afferrando le ali o le gambe.</li>
	<li>Mettere a fuoco il campione nel piatto di dissezione sotto un microscopio sezionante. Successivamente immergere il campione in 1x PBS, e rimuovere con attenzione le ali utilizzando dumont smussato #5 di ali sottili.</li>
	<li>Utilizzando le forbici di dissezione a molla del bordo dritto Vannas, rimuovere le gambe creando una piccola incisione nel lato ventrale della cuticola. Nel punto 3.8, questa incisione permetterà alla formaldeide di penetrare il tessuto.</li>
	<li>Prendere le forbici in una mano e tenere le forcelle nell'altra per posizionare il lato ventrale della mosca verso l'alto. Tenendo il campione in posizione con le force e le forbici contundenti, rimuovere la testa e l'addome con le forbici di dissezione.</li>
	<li>Trasferire il torace isolato utilizzando la punta della pipetta modificata nel tubo etichettato, al punto 3.2. NOTA: Impostare la pipetta su 40 L per evitare di aggiungere 1x PBS al fissativo.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 3.2-u20123.6 sopra per ogni provino.</li>
	<li>Fissare i campioni per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la correzione utilizzando una pipetta Pasteur e scartarla nel contenitore di rifiuti appropriato sotto il cofano di fumi. Risciacquare i campioni tre volte con 1,5 mL di 1x PBS ciascuno utilizzando una pipetta Pasteur. Completate un quarto risciacquo utilizzando solo 750 L e lasciate i tessuti in 1x PBS. NOTA: A questo punto, i campioni di tessuto possono rimanere a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 giorni prima di procedere ai passaggi successivi.</li>
</ol>4. Congelamento flash e bisezione torace
<ol><li>Prima di iniziare le bisezioni, riempire una fiaschetta Dewar con azoto liquido indossando guanti crio-protettivi adeguati e occhiali di sicurezza. Ottieni un interruttore a lama, lame di piume, un paio di pinze fini, ghiaccio, 1x PBS ghiacciato e pinzette criogeniche.</li>
	<li>Preparare un secchio di ghiaccio per mantenere 1x PBS ghiacciato.</li>
	<li>Utilizzare l'interruttore a lama per afferrare la lama di piuma ad angolo e piegare la lama per rompere un piccolo pezzo. L'interruttore della lama può quindi bloccare la lama in posizione per l'uso come un piccolo bisturi. NOTA: una lama deve durare per tutti i gruppi. Interruttore se la lama si rompe o diventa opaca.</li>
	<li>Aggiungere una punta di pipetta pulita al P200 e rimuovere 1/5th della punta per il trasporto dei campioni.</li>
	<li>Preparare un nuovo tubo di microcentrifuge per ogni gruppo e aggiungere 200 L di 1x PBS per ogni tubo. Questo secondo tubo verrà utilizzato per raccogliere i prep DLM finali.</li>
	<li>Rimuovere tutti i 1x PBS dai tubi utilizzando una pipetta Pasteur.</li>
	<li>Indossando un equipaggiamento protettivo adeguato, immergere il tubo nel pallone di azoto liquido per 10 s con le pinzette criogeniche. NOTA: I tubi devono essere chiusi strettamente per evitare che il tubo esplodi.</li>
	<li>Togliere il tubo dall'azoto liquido e aggiungere circa 300 L di 1x PBS ghiacciato ai campioni con una pipetta Pasteur. Tenere i campioni sul ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere 1x PBS ghiacciato alla teglia da 10 cm rivestita con elastomero di silicone e erogare il primo torace con la pipetta modificata da 200 L.</li>
	<li>Posizionare il lato ventrale del torace verso l'alto. In una mano utilizzare una coppia noiosa di forceps per posizionare il torace e nell'altra utilizzare una bella coppia di forcemme per rimuovere alcuni del ganglio toracico per esporre la linea mediana del torace.</li>
	<li>Utilizzare la linea mediana del torace come guida per fare un taglio superficiale attraverso 1/3rd del torace con la lama.</li>
	<li>Rimuovere la lama dal torace e posizionare il torace ad un angolo di 45 gradi con le forceppo smussate. Reinserire la lama e tagliare verso il basso la linea mediana del torace. Questo si tradurrà in due emithoraces.</li>
	<li>Prendere un emithorax alla volta e rimuovere il tessuto in eccesso sotto la fibra muscolare DLM F (Figura 1B), la fibra più ventrale. Utilizzare la lama per fare con attenzione uno o due tagli per rimuovere il tessuto in eccesso senza danneggiare i DLM.</li>
	<li>Una volta isolato, trasferire l'emitorace al tubo corretto con 1x PBS.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 4.6-u20124.14 fino a quando non vengono effettuati 10 emithoraces sezionati per gruppo.</li>
</ol>5. Colorazione strutturale
<ol><li>Dopo aver bisetico i campioni di torace, posizionare il tessuto nel buffer di blocco (1x PBS con 0,1% di siero di capra normale e 0,2% Triton X-100 a pH 7.4) per permeare il tessuto e prevenire la colorazione non specifica. Utilizzare una pipetta Pasteur per rimuovere l'eccesso di 1x PBS e aggiungere 1,5 mL di buffer di blocco a ciascun tubo. Bloccare i tessuti per almeno 1 h a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare i campioni per la colorazione strutturale utilizzando un anticorpo coniugato fluorescente, perossidasi di rafano 488 (anti-HRP-488) con una diluizione di 1:200 e Phalloidin-647 ad una diluizione di 1:1000 nel buffer di blocco per macchiare i neuroni motori e il tessuto muscolare, rispettivamente. Fare abbastanza macchia per avere 150 L per tubo. Conservare la macchia a 4 gradi centigradi ricoperta di stagnola o in una scatola scura fino a quando non è pronta per la colorazione.</li>
	<li>Dopo il blocco, rimuovere il buffer di blocco in eccesso con una pipetta Pasteur in vetro.</li>
	<li>Prima di erogare la macchia strutturale, vortice la macchia. Aggiungere 150 L della macchia ad ogni tubo. Posizionare i campioni in una scatola scura sul rotatore a temperatura ambiente per 2 h.</li>
	<li>Rimuovere la macchia e lavare i tessuti quattro volte in 1,5 mL di spazio temp 1x PBS con 0,3% Triton X-100 per 5 min sul rotatore in una scatola scura. I campioni sono ora pronti per il montaggio su una diapositiva.</li>
</ol>6. Tessuto di montaggio
<ol><li>Dopo aver lavato i campioni in PBST, preparare un vetrerio al microscopio per montare il tessuto per la colorazione. Preparare forniture aggiuntive, tra cui slip di copertura in vetro, una pipetta P200, punte di pipetta da 200 L, forbici, rinforzi chiari, forcelle di bordo dritto, supporti di montaggio fluorescenti anti-dissolvenza, smalto per unghie e una scatola scura per coprire i vetrini.</li>
	<li>Etichettare il slide per identificare i campioni e pulire il scivolo con kimwipes per assicurarsi che non ci siano macchie.</li>
	<li>Per garantire che i campioni di emitorace non siano danneggiati dallo slittamento del coperchio, costruire un "ponte" utilizzando etichette di rinforzo. Prendere un'etichetta di rinforzo, tagliarla a metà e posizionare ogni metà a circa 15 mm di distanza. Questa distanza deve essere inferiore alla larghezza del coperchio. Ripetere questo passaggio quattro volte per completare un "ponte" alto 5 etichette.</li>
	<li>Prendere la pipetta P200 e modificare una punta tagliando 1/5th della punta per trasferire i campioni al scivolo. I campioni devono essere trasferiti sul scivolo al centro del ponte.</li>
	<li>Prendere il bordo di una salvietta di laboratorio e rimuovere eventuali PBST in eccesso. Utilizzando le forcepi, disporre i DLM in modo che tutti i campioni sono rivolti lato muscolare verso l'alto e cuticle lato verso il basso.</li>
	<li>Utilizzando una punta di pipetta P200 standard, applicare 70 L di supporto di montaggio sul faro, evitando le bolle d'aria. Erogare il supporto in un modello circolare all'interno dei rinforzi a partire dall'esterno verso il centro.</li>
	<li>Posizionare una copertura sopra i rinforzi.</li>
	<li>Utilizzare smalto per rivestire i bordi esterni intorno al perimetro del coverslip. Applicare generosamente per formare un sigillo completo del tessuto.</li>
	<li>Posizionare il scivolo su una superficie piana al buio, consentendo almeno 10 min di asciugare e prevenire il foto-sbiancamento o la perdita di fluorescenza. Le diapositive possono ora essere utilizzate per l'imaging immediatamente o in altro modo memorizzate in una cartella di diapositive a -20 gradi centigradi per una visualizzazione successiva.</li>
</ol>7. Alternativa: Colorazione con anticorpi primari
NOTA: questa sezione è facoltativa e deve essere utilizzata direttamente tra le sezioni 4 e 5, se lo si desidera.
<ol><li>Per macchiare il tessuto con anticorpi primari, immergere il tessuto nel buffer di blocco per almeno 1 h.</li>
	<li>Preparare l'anticorpo primario con una corretta diluizione nel buffer di blocco. Come minimo, preparare una miscela di anticorpi sufficiente per avere 150 L per gruppo. Si noti che i campioni vengono mantenuti fermi. Conservare a 4 gradi centigradi fino a quando non è pronto per l'uso.</li>
	<li>Rimuovere il buffer di blocco in eccesso con una pipette Pasteur. Vortice brevemente l'anticorpo primario e aggiungere 150 L di miscela di anticorpi a ciascun gruppo e posizionare i campioni a 4 gradi centigradi durante la notte.</li>
	<li>Il giorno successivo, rimuovere l'anticorpo primario e lavare il tessuto 4 volte con PBST per 5 min ciascuno su un rotatore.</li>
	<li>Preparare la macchia secondaria nel buffer di blocco. Aggiungere la macchia secondaria al campione e quindi mantenerla a temperatura ambiente per 2 h in una scatola scura sul rotatore. NOTA: La colorazione secondaria può includere anche HRP e phalloidin.</li>
	<li>Dopo l'incubazione di 2 h, rimuovere il tessuto secondario di lavaggio delle macchie 4 volte per 5 minuti con PBST e procedere al montaggio.</li>
</ol>

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<li>Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+the+giant+fiber+pathway+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of D. melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. , e2412(2011).</li>
<li>Maccioni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+phytotherapic+extracts+rescue+anomalous+locomotion+and+electrophysiological+responses+of+TDP-43+Drosophila+melanogaster+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Standardized phytotherapic extracts rescue anomalous locomotion and electrophysiological responses of TDP-43 Drosophila melanogaster model of ALS.</a> Scientific Reports. 8, 16002(2018).</li>
<li>Siddiqi, O., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurophysiological+defects+in+temperature-sensitive+paralytic+mutants+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurophysiological defects in temperature-sensitive paralytic mutants of Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73, 3253-3257 (1976).</li>
<li>Wang, Z. H., Clark, C., Geisbrecht, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+clueless+is+involved+in+Parkin-dependent+mitophagy+by+promoting+VCP-mediated+Marf+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila clueless is involved in Parkin-dependent mitophagy by promoting VCP-mediated Marf degradation.</a> Human Molecular Genetics. 25, 1946-1964 (2016).</li>
<li>O'Sullivan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+Wing+Motor+Control+of+Song+and+Flight%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Multifunctional Wing Motor Control of Song and Flight.</a> Current Biology. 28, 2705-2717 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Utilizzando i metodi descritti in questo protocollo, forniamo un approccio semplice per la dissezione del tessuto DLM e dimostriamo come questo può essere applicato per valutare l'integrità sinaptica attraverso colorazione strutturale e marcatori sinaptici nella Drosophila adulta. Un passo critico nel protocollo che rende il tessuto DLM più facile da sezionare è il congelamento flash con azoto liquido. Senza questo passaggio, il tessuto è meno solido e più difficile da tagliare con precisione come osservato nella Figura 3. Questo protocollo si basa su precedenti metodi di dissezione per consentire la conservazione sia dei motoneuroni che del tessutomuscolare 18,19,20,21,22,23. Una limitazione di questo protocollo è che quando si effettua il taglio verso il basso la linea mediana per la bisezione, può essere difficile ottenere due preparati puliti per torace. Un modo per garantire almeno un emitorace per mosca, è intenzionalmente possibile tagliare su un lato del torace per ottenere una preparazione pulita. Con questa modifica, potrebbe anche essere necessario rimuovere ulteriore tessuto in eccesso dal taglio per pulire il campione con l'interruttore della lama. Per coloro che sono nuovi a questa tecnica, con la pratica continua, la precisione della bisezione aumenterà.
Il metodo qui descritto consente ai ricercatori di valutare facilmente l'integrità strutturale dei DLM NMJ adulti in qualsiasi momento durante la loro vita. Uno dei principali vantaggi di questo protocollo è la capacità di accedere all'integrità sinaptica nei modelli di malattia neurodegenerativa utilizzando marcatori sinaptici. Dimostriamo che questa applicazione può aiutare a visualizzare i cambiamenti nella morfologia lorda con colorazione strutturale (Figura 1C-u2012H). Inoltre, l'integrità sinaptica può essere valutata con la colorazione dei marcatori presinaptici, inclusi ma non limitati a Synapsin28 (Figura 2A ,u2012F), Syntaxin29 (Figura 2G ,u2012L) e BRP30 (Figura 2M -u2012R). Il tessuto muscolare post-sinaptico può anche essere valutato utilizzando l'anticorpo della sottounità Glutamate Receptor III31 (Figura 2S -u2012X), dimostrando l'utilità di questo protocollo.
I ricercatori possono anche utilizzare questo metodo di dissezione per integrare i dati funzionali per esaminare in modo completo l'integrità strutturale delle sinapsi associate a un'ampia varietà di malattie. Queste sinapsi consentono anche l'analisi funzionale attraverso registrazioni elettrofisiologiche32,33,34 e il test di volo10. Questo protocollo può anche fornire facilità di accesso al tessuto per molte applicazioni e saggi. Studi futuri, ad esempio, potrebbero utilizzare questo protocollo per quantificare le modifiche sinaptiche attraverso la quantificazione della densità e del numero di sinapsi15,16. Mentre il protocollo qui descritto esamina specificamente l'integrità sinaptica dei motoneuroni, i protocolli complementari per valutare la perdita delle cellule muscolari possono essere eseguiti anche con questa dissezione utilizzando la colorazione TUNEL35. Per esaminare la perdita neuronale, la dissezione del gangliotoracico 36 potrebbe essere utilizzata anche con la colorazione TUNEL. Ci aspettiamo che la dissezione qui descritta avrà più applicazioni per studi futuri che valutano le patologie legate all'età e le malattie neurodegenerative.

La disfunzione sinaptica è tra i primi segni distintivi noti della maggior parte delle principali malattie neurodegenerative1,2,3,4,5,6. Tuttavia, si sa molto poco su come queste menomazioni strutturali e funzionali si riferiscono alle fasi successive della progressione della malattia. Drosophila ha dimostrato di essere un utile sistema di modello per comprendere la crescita e lo sviluppo delle sinapsi utilizzando LArval NMJs7,8,9. Tuttavia, il terzo stadio larvale instar dura solo pochi giorni, limitando la loro utilità nello studio della neurodegenerazione progressiva e dipendente dall'età. Un'alternativa alla valutazione dei NMJ larval consiste nell'esaminare le strutture sinaptiche nella Drosophila adulta,come le sinapsi formate sui dorsali longitudinali (DLM) necessarie peril volo 10,11,12,13,14,15,16. Queste sinapsi tripartite sono strutturalmente organizzate in modo simile alle sinapsi dei mammiferi17, fornendo un vantaggio unico per la valutazione di modelli di malattie neurodegenerative.
Qui descriviamo un metodo semplice per analizzare l'integrità strutturale degli NMJ adulti in un modello di neurodegenerazione della Drosophila. Precedenti metodi di dissezione DLM e studi hanno sottolineato l'importanza di preservare il tessuto muscolare per una varietà diapplicazioni 18,19,20,21,22,23. Il nostro protocollo fornisce un metodo completo per preservare sia il tessuto neuronale che quello muscolare per studiare le malattie neurodegenerative. Un altro componente importante dello studio di queste malattie è la capacità di comprendere la perdita neuronale in modo dipendente dall'età. Il lavoro precedente fornisce una comprensione critica e approfondita di come i DLM NMJ si formano durante la metamorfosi nella prima etàadulta 11,12,14,15,16,24. Il nostro protocollo stabilisce un metodo per costruire su questo lavoro per indagare DLM NMJs in modo dipendente dall'età in invecchiamento e malattie neurodegenerative.

<table><tbody><tr><td>Scienze della microscopia elettronica</td> al <td>32% di formaldeide</td><td>15714</td><td>Conservazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 capra anti topo</td><td>Fisher</td><td>Scientific A11031</td><td>Etichetta gli anticorpi primari. Utilizzato a concentrazione 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 capra anti coniglio</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11036</td><td>Etichetta gli anticorpi primari. Utilizzato a concentrazione 1:200.</td></tr><tr><td>anticorpi anti-Bruchpilot (BRP)</td><td>Studi sullo sviluppo Banca dell'ibridoma</td><td>NC82</td><td>Colora le zone attive nei neuroni presinaptici. Utilizzato a concentrazione 1:25.</td></tr><tr><td>anticorpo anti-GluRIII</td><td>Regalo di Aaron DiAntonio</td><td>N/A</td><td>Etichetta le subunità del recettore del glutammato. Utilizzato a concentrazione 1:1000.</td></tr><tr><td>anticorpi anti-sinapsina</td><td>Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi</td><td>3C11</td><td>Etichetta la proteina sinaptica sinapsina. Utilizzato a concentrazione 1:50.</td></tr><tr><td>anticorpi anti-sintassina</td><td>Studi sullo sviluppo La banca degli ibridomi</td><td>8C3</td><td>etichetta la proteina sinaptica sintaxina. Utilizzato a concentrazione 1:10.</td></tr><tr><td>BenchRocker</td><td>Genesee Scientific</td><td>31-302</td><td>Rotante dei campioni durante la colorazione</td></tr><tr><td>Blade Breaker</td><td>Fine Science Tools</td><td>10053-09</td><td>Utilizzato per tenere</td></tr><tr><td>i vetrini coprilama</td> in piuma <td>Fisher Scientific</td><td>12548A</td><td>Per il montaggio di</td></tr><tr><td>guanti criogenici</td> per tessuti <td>VWR</td><td>97008-198</td><td>proteggere le mani dalle</td></tr><tr><td>pinzette criogeniche</td> ad azoto liquido <td>VWR</td><td>82027-432</td><td>Tenere una provetta da 2,0 mL in pallone di dewar con azoto</td>liquido-1900</tr><tr><td>mL</td><td>Thomas Scientific</td><td>5028M54</td><td>Tenere l'azoto liquido</td></tr><tr><td>Lame di piuma</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>72002-01</td><td>Lame per bisturi</td></tr><tr><td>Forecps fini x 2</td><td>Strumenti per le scienze 11252-20</td><td></td><td>Un paio fine per la pulizia della linea mediana del torace. L'altro paio può essere smussato usando una pietra per affilare.</td></tr><tr><td>Anti HRP coniugato con FITC</td><td>Jackson Laboratories</td><td>123-545-021</td><td>Colora i motoneuroni. Utilizzato in 1:100 scatola di congelamento</td></tr><tr><td>di concentrazione (nero)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14100F</td><td>Protegge i campioni dalla luce</td></tr><tr><td>pipette pasteur in vetro</td><td>VWR</td><td>14637-010</td><td>Utilizzato per trasferire campioni</td></tr><tr><td>vetrini Fisher</td><td>Scientific</td><td>12550143</td><td>Per il montaggio</td></tr> di <tr><td>terreni di montaggio in tessuto (vectashield) anti-sbiadimento</td><td>VWR</td><td>101098-042</td><td>I supporti di montaggio conservano smalto per unghie di segnalazione fluorescente</td></tr><tr><td></td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td>Sigilla i vetrini del microscopio</td></tr><tr><td>siero di capra normale</td><td>Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td>Impedisce il legame non specifico degli anticorpi</td></tr><tr><td>pennello</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-204</td><td>Mosche di trasferimento</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-010-023</td><td>Soluzione salina per dissezione e colorazione</td></tr><tr><td>falloidina 647</td><td>Abcam</td><td>AB176759</td><td>colora la F-actina nel tessuto muscolare. Utilizzato a concentrazione 1:1000</td></tr><tr><td>capsula di Petri in plastica (100 mm)</td><td>VWR</td><td>25373-100</td> Etichette di rinforzo <td>per piastre di dissezione</td></tr><tr><td></td><td>W.B. Mason</td><td>AVE05722</td><td>Fornisce supporto per vetrino coprioggetto sopra il</td></tr><tr><td>blocco di affilatura</td> dei tessuti montato <td>Grainger</td><td>1RDF5</td><td>Mantiene affilate le pinze fini e opacizza anche la</td></tr><tr><td>cartella di vetrini</td> a coppia separata <td>VWR</td><td>10126-326</td><td>Campione </td></tr><tr><td>Forbici da ufficio standard</td> di stoccaggio <td>W.B. Mason</td><td>ACM40618</td><td>Etichette di rinforzo da taglio</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>24236-10</td><td>Rivestimento per piatto di dissezione</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>22140</td><td>Aiuta a permeabilizzare i tessuti</td></tr><tr><td>Vannas Disssection Sissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>1500-00</td><td>Utilizzato per la rimozione delle zampe di mosca e l'incisione sul torace</td></tr></tbody></table>

visualizzazione della degenerazione sinaptica nella drosophila adulta in associazione con la neurodegenerazione

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

La Drosophila funge da modello utile per valutare la struttura sinaptica e la funzione associata alle malattie neurodegenerative. Mentre molto lavoro si è concentrato sulle giunzioni neuromuscolari (NMJ) nelle larve di Drosophila, la valutazione dell'integrità sinaptica nella Drosophila adulta ha ricevuto molta meno attenzione. Qui forniamo un metodo semplice per la dissezione dei muscoli longitudinali dorsali (DLM), che sono necessari per la capacità di volo. Oltre al volo come lettura comportamentale, questa dissezione consente che le sinapsi DLM e il tessuto muscolare siano suscettibili all'analisi strutturale utilizzando anticorpi etichettati fluorescentemente per marcatori sinaptici o proteine di interesse. Questo protocollo consente la valutazione dell'integrità strutturale delle sinapsi nella Drosophila adulta durante l'invecchiamento per modellare la natura progressiva e dipendente dall'età della maggior parte delle malattie neurodegenerative.

La generazione di mosche transgeniche che esprimono la proteina di associazione al Tar umana di 43 kDa mutante (TDP-43M337V) è rappresentata dallo schematico (Figura 1A). Questo dimostra l'applicazione del sistema binario Gal4/UAS in Drosophila27. L'illustrazione raffigura un emitorace con sei fibre muscolari, A-u2012F che va dalla fibra A più dorsale alla più ventrale F (Figura 1B)11,12. Per valutare l'integrità sinaptica, gli NMJ sono stati macchiati con HRP e Phalloidin (Figura 1C-u2012E). I motoneuroni nei mutanti TDP-43M337V (Figura 1F) hanno poca o nessuna colorazione HRP entro il giorno 21, mentre WT (Oregon-R) rimane intatto (Figura 1C). Non esistono differenze visibili nella colorazione muscolare (Figura 1D,G). I cambiamenti nella morfologia lorda osservati nei mutanti TDP-43M337V dimostrano come l'integrità sinaptica possa essere implicata in un modello di malattia neurodegenerativa della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) utilizzando il modello DLM adulto. Oltre alla colorazione strutturale, colorare i DLM NMJ può anche fornire una valutazione dell'integrità sinaptica con marcatori presinaptici (Figura 2A -u2012R) e post sinaptico (Figura 2S -u2012X). Insieme, questi risultati illustrano come questo protocollo di dissezione potrebbe essere applicato allo studio del tessuto DLM nelle malattie neurodegenerative.
Un aspetto chiave di questa dissezione è l'applicazione di azoto liquido per lampeggiare congelare il tessuto per rendere la bisezione più facile. L'utilità dell'azoto liquido è dimostrata nei moscerini WT con azoto liquido in cui il tessuto muscolare non ha danni o fibre rubate (Figura 3A-u2012C). Senza azoto liquido, il tessuto può essere più difficile da sezionare. Ad esempio, seguendo questo protocollo e saltando la fase di congelamento flash di azoto liquido, il tessuto può essere più suscettibile ai danni causati dagli strumenti di dissezione, come i neuroni danneggiati (Figura 3D) o le fibre muscolari danneggiate (Figura 3E). L'applicazione dell'azoto liquido aiuta a prevenire i danni ai tessuti che potrebbero verificarsi quando si lavora con il tessuto DLM indipendentemente dal genotipo del campione (Figura 3C e 3F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61363/61363fig1.jpg"> Figura 1: denervazione progressiva delle sinapsi DLM in un modello di Drosophila della SLA. (A) La generazione di mosche transgeniche alS che esprimono una forma mutante umana di proteina Tar-Binding di 43 kDa (TDP-43) sono mostrate nello schema. (B) L'illustrazione raffigura la forma e l'orientamento di un emitorace in una Drosophila adulta. Utilizzando il protocollo, possiamo osservare la progressiva perdita di integrità sinaptica delle sinapsi DLM NMJ attraverso la colorazione strutturale dei motoneuroni con HRP (verde) e tessuto muscolare con Phalloidin (magenta). Il nostro modello raffigura la perdita di integrità sinaptica in un modello adulto di SLA attraverso la generazione di mosche adulte che esprimono un mutante da TDP-43M337V umano nei motoneuroni (Figura 1F-u2012H) rispetto a WT (Figura 1C -u2012E) mosche in fibra muscolare C. Le frecce evidenziano esempi di una sinapsi WT (Figura 1C) e un esempio di perdita di integrità sinaptica. Barra della scala di 20 m con ingrandimento 63x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61363/61363fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61363/61363fig2.jpg"> Figura 2: Valutazione dell'integrità sinaptica utilizzando marcatori presinaptici presso NMJ adulti. L'integrità sinaptica può anche essere valutata utilizzando marcatori presinaptici e post-sinaptici nelle mosche WT che hanno 14 giorni nella fibra muscolare C. I marcatori presinaptici Synapsin (B), Syntaxin (H) e Bruchpilot (BRP) (N) sono co-macchiati con HRP (A, G, M). La colorazione raffigura la localizzazione di questi marcatori ai terminali presinaptici (C, I, O). Con un ingrandimento più elevato, le immagini illustrano la localizzazione di Synapsin (E), Syntaxin (K) e BRP (Q) con HRP (D, Je P) in modo più dettagliato (Figura F, Le R). Mostriamo anche un marcatore post-aaaaptico Glutamate Receptor III (GluRIII) (T) co-macchiato con HRP (S). La co-colorazione dimostra l'utilità di questi marcatori (U). A ingrandimento più elevato le immagini rappresentative esemplificano la localizzazione (X) di GluRIII (W) e HRP (V) rispettivamente al tessuto muscolare post-sinaptico e ai terminali presinaptici. La barra della scala per i pannelli A, U2012C, G-I, M'u2012O, S'u2012U rappresentano 20 m con ingrandimento 63x. La barra della scala per i pannelli D-u2012F, 2J-2L, 2P-2R e 2V-2X rappresentano 10 m con ingrandimento 63x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61363/61363fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61363/61363fig3.jpg"> Figura 3: Utilità dell'azoto liquido per le dissezioni DLM. Per dimostrare l'utilità dell'azoto liquido per le dissezioni DLM, mostriamo un confronto tra le mosche del giorno 21 WT con e senza azoto liquido dalla fibra muscolare C. Con l'azoto liquido, Phalloidin (B) rimane intatto e non compromette la colorazione HRP (A, C). Senza azoto liquido, il tessuto muscolare diventa stringato e difficile da bisecarsi (E) e la colorazione HRP (D, F) viene compromessa a causa di un errore tecnico. Le frecce bianche mostrano un'area senza danni muscolari con azoto liquido (B) e tessuto muscolare danneggiato (E). Barra della scala: 20 m con ingrandimento 63x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61363/61363fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

L'obiettivo di questa procedura è quello di sezionare il tessuto del muscolo longitudinale dorsale (DLM) per valutare l'integrità strutturale delle giunzioni neuromuscolari DLM (NMJ) nei modelli di malattia neurodegenerativa utilizzando Drosophila melanogaster.

Visualizzazione della degenerazione sinaptica nella Drosophila adulta in associazione con la neurodegenerazione

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

Un protocollo fornisce un modello semplice per valutare l'integrità sinaptica in modo dipendente dall'età. Quindi possiamo studiare le malattie neurodegenerative nei tessuti che sono suscettibili sia all'analisi strutturale che a quella funzionale. Questa tecnica facilita la conservazione del tessuto neuronale e muscolare dalle giunzioni neuromuscolari muscolari longitudinali dorsali.Per indagare in modo completo la funzione sinaptica nel tempo e i tessuti difficili da lavorare. Questo metodo può essere applicato allo studio di malattie neurodegenerative tra cui SS, Parkinson, Huntington e morbo di Alzheimer. Prima di iniziare la dissezione tagliare circa 10 millimetri dalla punta di una pipetta da 200 microlitri.Dopo aver somministrato l'anestesia, gioca da sei a 10 mosche in una piastra di Petri di sei centimetri contenente il 70% di etanolo e usa un pennello per sorseggiare delicatamente unire ogni mosca. Dopo uno o due minuti, utilizzare le forcep per trasferire una mosca per le gambe o le ali su una piastra di dissezione rivestita in elastomero in silicone contenente da sette a 10 millilitri di PBS al microscopio sezionato. Con la mosca sommersa nel PBS, usa le forcette contundenti Dumont numero cinque per rimuovere con cura le ali e utilizzare span una forbice di dissezione a molla a bordo dritto per fare una piccola incisione nel lato ventrale della cuticola per rimuovere le gambe.Tenendo le forbici di dissezione in una mano e le forcette smussate nell'altra, posizionare il lato ventrale della mosca verso l'alto e tenere il campione in posizione con le forcep, rimuovere la testa e l'addome con le forbici. Utilizzare una pipetta da 200 microlitri impostata su 40 microlitri e la punta della pipetta modificata per raccogliere i toraci e posizionare i campioni di tessuto isolati in un tubo opportunamente etichettato contenente 900 microlitri di PBS e 150 microlitri di formaldeide al 32%. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, utilizzare una pipetta Pasteur per rimuovere il fissatore e risciacquare i strati tre volte con 1,5 millilitri di PBS per lavaggio.Prima di iniziare le bisezioni Don guanti protettivi criogenici e occhiali di sicurezza e riempire un pallone turistico con azoto liquido. Usa un demolitore di lame per afferrare una lama di piume con un angolo e piegare la lama per rompere un piccolo pezzo. Utilizzare l'interruttore a lama per bloccare la lama in posizione e utilizzare una pipetta Pasteur in vetro per rimuovere tutto il PBS dai tubi campione.Utilizzare pinzette criogeniche per immergere i tubi nel pallone di azoto liquido. Dopo 10 secondi, utilizzare una pipetta Pasteur per aggiungere circa 300 microlitri di PBS ghiacciato a ciascun tubo sul ghiaccio e posizionare un povero lato ventrale dell'ascia su in una piastra di dissezione rivestita di elastomero siliconico di 10 centimetri contenente PBS ghiacciato. Usa una coppia opaca di forcep per posizionare il torace e trovare un paio di forcep, per rimuovere alcuni dei gangli toracici per esporre la linea mediana del torace.Usando la linea mediana del torace come guida, usa il gioco per fare un taglio superficiale attraverso un terzo del torace e usa le forcep smussate per posizionare il torace con un angolo di 45 gradi. Utilizzare la lama per tagliare direttamente lungo la linea mediana del torace per ottenere due emithoraces e per effettuare con attenzione uno o due tagli per rimuovere il tessuto in eccesso senza danneggiare i muscoli longitudinali dorsali. Quindi posizionare i campioni di tessuto muscolare in un tubo di PBS opportunamente etichettato.Quando tutti i campioni di torace sono stati bieticati permeabilizzano i tessuti nel tampone di blocco per almeno un'ora a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, il vortice ha preparato al momento la soluzione di macchia strutturale e aggiungere 150 microlitri della macchia a ciascun campione per un'incubazione di due ore su un rotatore a temperatura ambiente al buio. Dopo la colorazione lavare i campioni in PBST e posizionare cinque etichette di rinforzo impilate e tagliate a mezzo millimetro di distanza su uno scivolo al microscopio di vetro.Utilizzare una punta di micro pipetta modificata per trasferire i Thorace su ogni diapositiva e utilizzare una salvietta da laboratorio per rimuovere eventuali PBST in eccesso. Utilizzare le forcep per disporre i campioni in modo che i Thoraces siano rivolti verso l'alto. Quando i campioni sono correttamente orientati, utilizzare una punta di pipetta da 200 microlitri per applicare 70 microlitri di supporto di montaggio su ogni diapositiva e coprire ogni diapositiva con uno slittamento di copertura.Quindi utilizzare lo smalto per unghie per rivestire generosamente i bordi esterni del coperchio scivola per ottenere una tenuta completa intorno a ciascun tessuto. Per valutare l'integrità sinaptica. Le giunzioni neuromuscolari possono essere macchiate con perossidasi di rafano e neuroni motori Floe tin in proteina legante il catrame di 43 mutani di Kilodalton hanno colorazione perossidasi da poco o nessun rafano entro il giorno 21, mentre la proteina di tipo selvatico rimane intatta.Non si osservano differenze visibili nella colorazione muscolare. Oltre alla colorazione strutturale del muscolo longitudinale dorsale, l'etichettatura della giunzione neuromuscolare muscolare longitudinale può anche fornire una valutazione dell'integrità sinaptica con marcatori pre sinaptici e post sinaptici. Si noti che il congelamento flash dell'azoto liquido facilita una bisezione di successo in quanto il tessuto congelato non flash è più suscettibile ai danni durante la dissezione.Seguendo questa procedura i campioni di conservazione possono essere analizzati con microscopia confocale per misurare uno specifico aspetti della struttura sinaptica.

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Visualizzare Drosophila gamba del neurone di motore assoni attraverso la cuticola adulto

Qui, forniamo protocolli per eseguire tre semplici saggi di degenerazione degli assoni indotta da lesioni (morte assonale) in Drosophila melanogaster per valutare la conservazione morfologica e funzionale degli assoni recisi e delle loro sinapsi.

Valutazione morfologica e funzionale degli assoni e delle loro sinapsi durante la morte di Axon in Drosophila melanogaster

Scopri la tecnica di dissezione del muscolo dorsale longitudinale in Drosophila melanogaster per valutare l'integrità delle giunzioni neuromuscolari. Questo metodo consente di studiare le malattie neurodegenerative come SLA, Parkinson e Alzheimer.

Visualizzazione della degenerazione sinaptica nella Drosophila adulta in associazione con la neurodegenerazione

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