Investigare la motilità guidata dalla Flagella in Escherichia coli applicando tre tecniche consolidate in una serie
10 maggio 2020
Molti batteri usano la motilità guidata dalla flagella per navigare nel loro ambiente e colonizzare un ambiente favorevole sia individualmente che collettivamente. Qui è dimostrato l'uso di tre metodi consolidati che sfruttano la motilità come strumento di selezione per identificare componenti / percorsi che contribuiscono al nuoto e alla motilità brulicante.
I protocolli dimostrati in questo video possono essere riprodotti in qualsiasi laboratorio del mondo. In combinazione, rappresentano un approccio sistematico e potente alla caratterizzazione della motilità del flagello batterico. La motilità è un aspetto cruciale della disseminazione e della sopravvivenza batterica e questi tre metodi sono strumenti utili e potenti per l'analisi della motilità sia individuale che collettiva.
Le tecniche qui descritte possono essere facilmente applicate per studiare una serie di batteri, compresi quelli classificati come patogeni in natura. Quando si tenta questa procedura per la prima volta, tenere presente che se le piastre dello sciame vengono preparate in modo errato, è possibile osservare comportamenti incoerenti o schemi che imitano ma non riflettono veramente il movimento collettivo. Coltiva colture notturne del ceppo carente di motilità desiderato in cinque millilitri di brodo Lennox a 30 gradi Celsius con agitazione orizzontale, quindi sottocoltura in LB fresco nelle stesse condizioni alla fase esponenziale.
Inoculare sei microlitri di coltura al centro di una piastra di agar morbida, spingendo la punta della pipetta caricata nell'agar per espellere delicatamente il contenuto. Incubare la piastra a 30 gradi Celsius fino a quando non sono evidenti riacutizzazioni della motilità, provenienti dal punto di inoculazione o dalla periferia degli anelli di motilità. Utilizzare un anello di filo sterile per sollevare le cellule dalla regione di svasatura e striarle su una piastra di agar dura LB per purificare le singole colonie.
Per confermare che i mutanti soppressori isolati hanno ripristinato la motilità, coltivarli su piastre di agar morbide per i ceppi di interesse. Includi il ceppo wild-type e il ceppo iniziale carente di motilità per il confronto. Dopo aver incubato le piastre di coltura a 30 gradi Celsius per 8-10 ore, registrare il diametro dell'anello più esterno per stabilire quali degli isolati hanno sostanzialmente ripristinato la motilità.
Preparare una coltura di fase esponenziale del ceppo di interesse. Quindi pellettare 10 millilitri di cellule mediante centrifugazione a 2000 volte G per tre minuti, e risospenderle in 10 millilitri di tampone di motilità sterilizzato con filtro, o MB. Lavare le cellule altre due volte in MB e risospenderle in un millilitro di MB dopo la centrifugazione finale. Trasferire la sospensione cellulare in una siringa da un millilitro e collegare un ago calibro 23 all'estremità.
Assemblare una siringa e un apparecchio per aghi identici e collegare i due insieme tramite sei pollici di tubo in polietilene, strettamente inguainato su ciascuna punta dell'ago. Tagliare i flagelli passando delicatamente la sospensione cellulare avanti e indietro da una siringa all'altra 50 volte con pause di un minuto tra un passaggio e l'altro. Quindi centrifugare le cellule tranciate a 2000 volte G per tre minuti e risospenderle in 500 microlitri di MB.To preparare una camera di fissazione cellulare, impilare un vetrino coprioggetto di 18 x 18 millimetri su un vetrino da microscopio separato da nastro biadesivo.
Aggiungere una soluzione di polilisina allo 0,01% sulla parte superiore della camera per lavarla. Inclinare il bordo inferiore su una salvietta per aspirare la soluzione attraverso la camera, quindi lasciarla a temperatura ambiente per 10 minuti. Lavare la camera tre volte con 40 microlitri di MB e aggiungere 40 microlitri di sospensione cellulare tranciata sulla parte superiore della camera.
Lasciare che le cellule si attacchino al vetrino coprioggetti per 10 minuti, quindi sciacquare delicatamente la camera con 40 microlitri di MB per rimuovere le cellule non attaccate. Trasferire il vetrino sul tavolino del microscopio e utilizzare la microscopia a contrasto di fase e un obiettivo 100X per scansionare la popolazione alla ricerca di cellule fissate in posizione e rotanti su un singolo asse. Apri il software del microscopio, assicurati che le cellule siano a fuoco e inizia l'acquisizione video per registrare la rotazione delle cellule per un minuto.
Dalla riproduzione video, quantifica il numero di rotazioni complete al minuto e il numero di volte in cui la cella cambia direzione. Inoculare sei microlitri di una coltura a medio esponenziale posizionandola sopra l'agar. Lasciare il coperchio aperto per cinque-10 minuti e riposizionarlo quando l'inoculo si è asciugato sulla superficie dell'agar.
Quindi incubare la piastra a 30 gradi Celsius per otto ore. Versare circa 30 millilitri di agar a sciame nella camera destra di una capsula di Petri a doppio scompartimento, assicurandosi che sia a livello del divisorio di plastica tra le camere, ma non trabocchi nella sinistra. Dopo che l'agar si è indurito, riempire la camera sinistra con circa 30 millilitri di agar da nuoto o sciame.
Prima che si solidifichi, utilizzare una punta di pipetta sterile per guidare delicatamente l'agar oltre il bordo e collegare i due lati con un ponte di agar alto un millimetro che si estende per l'intera lunghezza dello spartiacque. Lasciare asciugare il piatto a temperatura ambiente. Mentre versate l'agar, fate attenzione alla sua profondità.
Se è troppo alto, traboccherà. Se è troppo basso, non sarai in grado di collegare le due camere. Questo protocollo è stato utilizzato per isolare le riacutizzazioni pseudo revertanti in un ceppo di E.coli doppio mutante con motilità compromessa.
Uno di questi revertanti mostrava una motilità vicina a quella del wild-type. Il doppio genitore mutante e il ceppo isogenico wild-type sono stati utilizzati come controlli. Le acquisizioni video sono state analizzate per calcolare le rotazioni al minuto e la frazione di tempo in cui i motori ruotano in senso orario, o distorsione di rotazione.
Il mutante yhjH ha mostrato alcune rotazioni al minuto e una minore propensione al tumble rispetto all'E.coli wild-type, come previsto. Sia il doppio mutante che il suo soppressore hanno mostrato un comportamento motorio simile al wild-type. Il test di attraversamento del confine è stato utilizzato per confrontare le capacità del wild-type e dell'isolato soppressore di sciamare e quindi di spostarsi attraverso il confine e sciamare su agar integrato con kanamicina.
Entrambi i ceppi hanno mostrato tassi simili di sciame da un punto di inoculazione identico, ma il crossover dello sciame verso la camera antibiotica era costantemente maggiore per il wild-type rispetto al soppressore. La differenza tra i due ceppi era più pronunciata a concentrazioni più elevate di kanamicina. I saggi a sciame possono essere difficili da configurare.
Potrebbe essere necessario dedicare un po' di tempo all'ottimizzazione delle condizioni di disegno per adattarle ai batteri di interesse, nonché alle condizioni di laboratorio durante la preparazione dei terreni. Le tecniche di questo protocollo sono state applicate a una serie di batteri flagellati e possono probabilmente essere applicate a una pletora di specie non testate.
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Panoramica
Questo studio analizza la motilità batterica, concentrandosi sul movimento mediato da flagelli come mezzo per la navigazione nell'ambiente e la colonizzazione. Utilizzando metodologie consolidate, la ricerca identifica i componenti chiave e i percorsi coinvolti nei comportamenti di motilità sia individuale che collettiva.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Motilità batterica
- Meccanica dei flagelli
- Comportamento collettivo nei batteri
Sfondo
- La motilità è fondamentale per la sopravvivenza e la disseminazione batterica.
- Lo studio comprende l'analisi della motilità sia individuale che collettiva.
- I protocolli possono essere applicati a diversi batteri, inclusi i patogeni.
Metodi Utilizzati
- Sfruttare la motilità come strumento di selezione
- Utilizzo di piastre con agar morbido e saggi di migrazione collettiva
- Microscopia a contrasto di fase per l'osservazione cellulare
Risultati principali
- I mutanti soppressori isolati hanno mostrato un ripristino della motilità.
- Il confronto delle capacità di swarming tra ceppo selvatico e mutanti ha indicato differenze significative nella risposta agli antibiotici.
- La quantificazione delle rotazioni del motore ha fornito informazioni sui modelli di motilità.
Conclusioni
- Lo studio dimostra l'efficacia dei protocolli multistep per la caratterizzazione della motilità batterica.
- I risultati contribuiscono alla comprensione del comportamento patogeno e della meccanica della motilità.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La comprensione dei meccanismi di motilità batterica fornisce informazioni fondamentali sulla virulenza dei patogeni e sulle strategie di colonizzazione dell'ospite, contribuendo alla validazione degli obiettivi per lo sviluppo di agenti anti-infettivi. L'applicazione combinata di saggi di motilità consente una riduzione sistematica dei rischi associati alle ipotesi terapeutiche, collegando alterazioni genetiche a fenotipi funzionali sia nel movimento individuale che collettivo. Questo approccio supporta i flussi di lavoro della fase iniziale della scoperta generando dati quantitativi e riproducibili che aumentano l'affidabilità predittiva nella priorizzazione degli obiettivi e nei successivi studi meccanicistici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche collegando il ripristino della motilità a mutazioni soppressore, chiarificando la funzione genica nell'assemblaggio e nel segnale del flagello.
- Valore operativo: Fornisce un sistema di selezione efficace per isolare mutanti con acquisizione di funzione, semplificando l'identificazione di percorsi compensatori in ceppi con motilità compromessa.
- Valore predittivo: Supporta lo screening fenotipico quantificando il recupero della motilità, facilitando la valutazione di modificatori genetici e delle interazioni tra percorsi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: La tecnica di ancoraggio cellulare consente la misurazione precisa della velocità del motore e dell'inversione di direzione, permettendo l'eliminazione dei rischi meccanicistici associati a bersagli coinvolti nel flusso ionico o nella modulazione del segnale.
- Valore operativo: La preparazione standardizzata di cellule tagliate e camere di fissazione garantisce un'adesione e una visualizzazione riproducibili mediante microscopia a contrasto di fase.
- Prontezza del saggio: Genera output quantificabili come rotazioni al minuto e polarizzazione dei movimenti erratici, facilitando il confronto tra ceppi e condizioni per applicazioni di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Il saggio di attraversamento del bordo collega la motilità individuale al comportamento collettivo di swarming, modellando come i patogeni passino dalla disseminazione alla colonizzazione superficiale in condizioni di stress.
- Valore operativo: Permette la valutazione dell'adattamento ambientale, come l'impatto della resistenza agli antibiotici sulla migrazione dello swarming, fornendo indicazioni sulla rilevanza traslazionale di biomarcatori.
- Affidabilità predittiva: Illustra come le mutazioni soppressore alterino l'interazione tra swarming e antibiotici, offrendo un modello per lo studio dei meccanismi di resistenza adattativa in contesti preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nelle fasi iniziali della scoperta collegando lo screening genetico ai fenotipi funzionali di motilità, favorendo il passaggio dalla validazione dell'identificazione del target alla riduzione del rischio meccanicistico prima dell'individuazione del capostipite.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi quantificando come le alterazioni genetiche influenzino la funzione del motore flagellare e la capacità di movimento collettivo, riducendo l'ambiguità nella validazione degli obiettivi.
- Screening: Fornisce letture quantitative standardizzate (velocità di rotazione, polarità direzionale, diametro del movimento collettivo) che consentono confronti affidabili tra librerie di mutanti o perturbazioni chimiche.
- Analisi: Genera output misurabili come la tendenza a rotazione casuale e le velocità di espansione del movimento collettivo, che aiutano i gruppi di lavoro a correlare genotipo e rischio fenotipico in modelli patogeni.
- Ricerca traslazionale: Collega il comportamento individuale del motore al movimento collettivo sotto pressione selettiva, modellando l'adattamento fenotipico rilevante per la dinamica delle infezioni.
- Riutilizzo aziendale: Le tre tecniche costituiscono una piattaforma modulare e adattabile applicabile a diversi patogeni dotati di flagelli, promuovendo la standardizzazione tra progetti e la condivisione di reagenti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica suddividendo la motilità in componenti quali funzione motoria, inversione della direzionalità e comportamento collettivo.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso protocolli standardizzati per l'inoculazione in agar morbido, la rottura cellulare e la preparazione delle camere, riducendo la variabilità tra laboratori.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione progettuale collegando la modulazione del bersaglio a modifiche misurabili nei tratti di motilità associati alla virulenza.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli in base al rischio, in funzione del loro ruolo nella disseminazione mediata dalla motilità e nel persistere nell'ospite.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di coltura batterica, microscopia e manipolazione asettica per garantire saggi di motilità riproducibili.
- Presuppone l'accesso a microscopia a contrasto di fase, strumenti per micromanipolazione e ambienti di incubazione controllati per i saggi di swarming e su agar morbido.
- Necessita della standardizzazione della concentrazione di agar, dei tempi di essiccazione delle piastre e dei volumi di inoculo per evitare artefatti nei saggi di attraversamento del bordo dello swarming.
- Richiede l'adattamento della composizione del buffer e dei parametri di taglio quando si applica il metodo di fissazione cellulare a diverse specie batteriche o ceppi mutanti.
- I limiti pratici includono la sensibilità alla profondità dell'agar per lo swarming e alla tecnica di ponteggiamento, che devono essere ottimizzati per evitare risultati negativi falsi o letture fuorvianti del movimento collettivo.
