Approccio genetico in avanti a cellule vive per identificare e isolare i mutanti dello sviluppo nella chlamydia trachomatis

Questo protocollo fornisce uno strumento unico per la generazione e l'isolamento della Clamidia con profili di sviluppo alterati, consentendo in ultima analisi l'identificazione dei geni che regolano il ciclo di sviluppo. I principali vantaggi di questo metodo sono la capacità di tracciare lo sviluppo del tipo di cella clamidia in tempo reale e la capacità di isolare la clamidia, con programmi di sviluppo alter. Per mutagenizzare un reporter chlamydia trachomatis, vide uno stock di clamidia contenente circa tre volte il 10° al settimo corpo elementare.

Trasformato con il plasma reporter di interesse e pellet, il pensiero è rifornito dalla centrifugazione. utilizzare la sonicazione al 10% di potenza per 10 secondi, per rimorsipare i corpi elementari in 100 microlitri di tampone del metabolismo accidentale e dividere equamente la sospensione elementare del corpo risultante, tra due tubi di micro centrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 50 microlitri di soluzione metabolica EMS appena preparata nelle aliquote della clamidia per la mutagenesi e 50 microlitri del tampone del metabolismo vaccinico all'aliquota clamidiale solo per la mutagenesi dello stock e incubare entrambi i campioni per 20 minuti, a temperatura ambiente.

EMS è un noto guanti da usura cancerogena durante la manipolazione e immergere tutte le attrezzature e il mezzo contaminati da EMS, in un idrossido di sodio molare per 24 ore prima dello smaltimento. Allestire una cultura all'ingrosso, per l'imaging e l'isolamento dei tracomimetri mutigenizzati chlamydia. Seme sei piastre inferiori in vetro, con sei per 10 al quinto costano sette celle, in due millilitri di mezzo completo per pozzo e seminano una piastra di polistirolo 24 pozzetto con 10 alla quinta causano sette cellule in un millilitro di mezzo completo per pozzo.

Infettare la coltura cellulare ospite con mutagenizzato nega l'infezione da clamidia trachomatis, cinque pozzi di una piastra con fondo di vetro con circa sei per 10 al quinto, di corpi elementari mutagenizzati. In 1,5 millilitri di HBSS ghiacciato per pozzo. e infettare il pozzo rimanente, con circa due volte 10 al quinto corpo elementare mutagenizzato finto in 1,5 millilitri di HBSS ghiacciato per pozzo, dopo un'incubazione di 15 minuti a 37 gradi Celsius, con dondolo, lavare le cellule infette con 37 gradi Celsius HBSS integrati con un milligrammo per millilitro di eparina, seguito immediatamente da un risciacquo HBSS.

lavare nuovamente le cellule con eparina, seguita immediatamente da due risciacqui con HBSS da solo per assicurarsi che tutta l'eparina venga rimossa. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere quattro millilitri di 37 gradi Celsius mezzo di imaging, ad ogni pozzo. E riempire gli spazi inter-pozzi con acqua deionizzata a 37 gradi Celsius, quindi posizionare le piastre nell'incubatore di coltura cellulare per 10 ore.

Alla fine dell'incubazione impostare l'incubatore di stadio del microscopio al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius. E posizionare la piastra inferiore in vetro dei sei pozzi, nell'incubatrice del palco. Nel software di imaging, utilizzare il plug-in di screening ad alto contenuto per selezionare il modello a sei piastre di pozzo e generare un elenco di posizione di imaging composto da 12 campi di visualizzazione per pozzo utilizzare l'opzione di messa a fuoco automatica per impostare lo stato attivo per l'imaging automatico e impostare l'esposizione a 250 millisecondi con un'intensità del 4% nel canale GFB e una densità del 18% nel canale RFP.

Quindi, al ciclo di imaging per 24 ore, con intervalli di 30 minuti, per catturare la cinetica del ciclo di sviluppo e impostare l'acquisizione dell'immagine in modo da includere più Z-stack con un intervallo di messa a fuoco che termina su entrambi i lati della sezione InFocus, quindi selezionare la Z relativa per l'imaging, più sezioni nella finestra di acquisizione e utilizzare l'opzione del file dello stack di immagini. per impostare le immagini da salvare come file dello stack TIFF. Per identificare le tracce di inclusione, con profili di sviluppo alter, utilizzare la cella di importazione nella schermata EMS, contrassegnare il notebook Python, per importare i dati della traccia di inclusione dai punti nelle statistiche di traccia, i file CSV nel frame di dati del Panda.

Utilizzare la cella di calcolo per calcolare il tempo necessario per avere la massima espressione sia per i cronisti precomi che per i cronisti in ritardo per ogni traccia e utilizzare il pacchetto di plottaggio bokeh, nella cella di plottaggio half max, per visualizzare il tempo di due mezze espressioni massime a metà espressione massima rispetto a quella di hctB prom. Usa il tracciato interattivo bokeh ID Explorer, per identificare le inclusioni dalla popolazione mutante, che non rientrano nella nuvola di dispersione trattata in modo fittizio. Per visualizzare dinamicamente i cambiamenti nella cinetica dell'espressione promoter nel grafico animato delle cellule del sangue, le intensità di espressione del ballo EOU contro hctB prom.

Quindi visualizzare un'istantanea dal grafico animato, nella cella del localizzatore di inclusione. Per isolare i Newton dello sviluppo, dalle inclusioni di interesse, posizionare il campo visivo su un pozzo con un'inclusione identificata, e passare l'ago sopra l'interferenza differenziale di fase contrasto sorgente di luce bianca canale, per visualizzare l'ago, utilizzare il 595 nanometro, canale di eccitazione, per visualizzare i corpi elementari per l'estrazione. E utilizzare la regolazione fine e il micro manipolatore, per manovrare l'ago capillare fino all'inclusione, rompere l'inclusione con l'ago e utilizzare il micro iniettore per disegnare i corpi elementari nella punta dell'ago capillare.

Espellere i corpi elementari estratti, dall'ago capillare in un unico pozzo, della piastra di polistirolo preparata a 24 polietilene e utilizzare un nuovo ago capillare per la successiva estrazione. Dopo una sufficiente espansione di ogni isolato, interrompere il monostrato infetto con una punta di micropipetto millilitro e trasferire i detriti cellulari medi e rilasciate clamidia in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Pellet la clamidia raccolta per centrifugazione, e rimospendare il pellet in 75 microlitri di ghiaccio freddo, tampone di glutammato fosfato di saccarosio, quindi dividere equamente la sospensione di inclusione, tra tre nuovi tubi micro centrifuga a vite da 1,5 millilitri, e conservare i tubi a meno 80 per leggere Celsius.

L'installazione di una coltura cellulare ospite per l'imaging di MUTAGEN ISED isola il seme di una piastra inferiore in vetro 96 con 1,6 per 10 al quarto costo di sette celle, in 100 microlitri di mezzo completo per pozzo. Dopo che il monostrato della cellula ospite raggiunge il disgelo di confluenza dei cloni mutanti raccolti e delle scorte di clamidia di tipo selvatico sul ghiaccio e usa una colonna per isolato per eseguire, una diluizione seriale duplice di ogni isolato mutante. Infettare, la colonna rimanente con clamidia di tipo selvatico, a una molteplicità di infezione di circa 0,5, e posizionare una piastra nell'incubatore di coltura cellulare per 10 ore alla fine dell'incubazione, selezionare tre pozzi per isolato mutante che corrispondono a una molteplicità di infezione inferiore a uno e generare un elenco di posizione di imaging.

composto da due campi visivo per pozzo. In questo scatterplot, l'espressione da tempo a metà massima dei promotori EOU e hctB da singoli isolati clamidiali può essere osservata cloni A3667 e B3858 è stato eletto per l'isolamento in quanto hanno prodotto tempi più brevi per avere espressione massima, dal promotore EOU e più lunghi per quattro hctB. Inclusioni con cinetica alterata possono essere identificate in base alla visualizzazione, all'espressione genica dinamica dei due promotori e può essere utilizzata un'istantanea del grafico animato, per identificare la posizione delle inclusioni di interesse.

In queste visualizzazioni rappresentative, sono state identificate un totale di 24 inclusioni per l'isolamento, 10 delle quali hanno mostrato cinetica differenziale, dopo aver ritestato in tre diverse categorie fenotipiche, otto isolati hanno mostrato una diminuzione dell'espressione del promotore EOU a circa 24 ore dopo l'infezione. Come dimostrato dal clone A3667, l'isolato B3858, ha anche mostrato una diminuzione dell'espressione del promotore EOU, a circa 24 ore dopo l'infezione. Ma un aumento complessivo dell'espressione del promotore hctB, mentre l'isolato B3662, ha espresso un aumento dei livelli di florescence da parte del promotore EOU seguito da un'improvvisa perdita di espressione in entrambi i promotori.

L'analisi delle micrografie a cellule vive per mutante B3662, rivela che si è verificata la lisi cellulare ospite, in cellule infettate da questo mutante, molto prima che in cellule infette di tipo selvatico. Lo sviluppo di tipo cellulare carente di recupero della clamidia potrebbe non essere possibile, in quanto queste cellule non possono reinfettere l'ospite. Gli studi di associazione a livello genomico possono essere utilizzati dopo l'isolamento, per identificare i geni dello sviluppo, attraverso la correlazione statistica, con l'incorporazione di reporter promotori alternativi.

Questo metodo può essere esteso, al sondaggio di numerose vie genetiche, nella dissezione dei meccanismi del circuito genetico e di altri agenti patogeni intracellulari.