Name: Ridurre al minimo lipossia nelle fette di ippocampale da topi adulti e anziani (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Scopri come ridurre l'ipossia nelle fette di ippocampo da topi adulti e anziani mediante perfusione transcardiaca con NMDG-aCSF ghiacciato. Questo metodo preserva la vitalità cellulare fino a 10 ore per registrazioni elettrofisiologiche di lunga durata.

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Ringrazio la dottoressa Carla J. Shatz per i consigli e il supporto, e la dottoressa Barbara K. Brott e Michelle K. Drews per aver letto criticamente il manoscritto. Il lavoro è sostenuto da NIH EY02858 e dalla Mathers Charitable Foundation concede a CJS.

Il protocollo viene eseguito in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dei National Institutes of Health e approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Stanford University. I metodi sono anche in conformità con le politiche della Società per le neuroscienze sull'uso degli animali e degli esseri umani nella ricerca sulle neuroscienze.
NOTA: tutti i topi sono stati mantenuti in un ambiente privo di agenti patogeni. Qui sono stati utilizzati topi di tipo selvatico su sfondo genetico misto C57Bl/ 6 x SV/ 129J, se non diversamente indicato.
1. Configurazione
<ol><li>Preparare 1 L di 1x aCSF (in mM): 125 NaCl, 26 NaHCO3, 2.3 KCl, 1.26 KH2PO4, 1.3 Mg2SO4, 7H2O, 2.5 CaCl2, 25 glucosio (Tabella 1). Utilizzare questa soluzione per la camera di recupero e le registrazioni successive. NOTA: memorizzare aCSF come soluzione stock 10x che contiene NaCl, NaHCO3, KCl e KH2PO4. Memorizzare Mg2SO47H2O e CaCl2 come 1 M soluzioni stock. Preparare la soluzione di lavoro il giorno dell'esperimento dalle soluzioni di stock di cui sopra e aggiungere il glucosio prima di regolare il volume finale con 18 MΩ acqua. NOTA: A seconda della regione del cervello o del ceppo del topo, l'aCSF refrigerato può essere utilizzato anche per la perfusione trascardicacon successo 11,15,26.</li>
	<li>Preparare 300 mL di NMDG-aCSF (in mM): 135 NMDG, 1 KCl, 1.2 KH2PO4, 1.5 MgCl2, 0.5 CaCl2, 20 bicarbonato di colina, 10 glucosio(Tabella 1). Questo volume di NMDG-aCSF è sufficiente sia per la perfusione transcardiale che per le fasi di taglio. NOTA: Conservare NMDG-aCSF come soluzione di stock 3x a 4 gradi centigradi. Preparare la soluzione di lavoro il giorno dell'esperimento; aggiungere bicarbonato di colina e glucosio prima di regolare il volume finale con 18 MΩ acqua. Far bollire la soluzione con 95%O2/5%CO2 per tamponarla e saturarla di ossigeno. NOTA: lo stock NMDG inizia come altamente alcalino e richiede l'acido cloridrico concentrato (HCl) per regolare il pH a 7,4 USD. L'aggiunta di acido cloridrico deve essere lenta una volta al di sotto del pH 8, in quanto è facile acidificare la soluzione a pH 3 con HCl in eccesso. Questa regolazione deve essere effettuata prima di aggiungere cations divalenti. Questa ricetta NMDG-aCSF è senza sodio. Ricette NMDG pubblicate in precedenza utilizzano 30 mM NaHCO3 per il buffering, che si traduce in 30 mM di sodio presente in NMDG-aCSF13,20.</li>
	<li>Impostare il vassoio di taglio microtome vibrante e il disco di montaggio a -20 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare la camera di recupero.<ol>
<li>Riempire la camera di recupero appena sopra la maglia a fette, tenerla sul banco a temperatura ambiente e bolla. NOTA: La camera di recupero fetta utilizzata qui è molto simile alle camere classiche descritte in precedenza da Edwards e Konnerth3. aCSF è tenuto in un bicchiere di vetro (400 mL) che contiene un telaio acrilico rotondo con maglia di nylon nero incollata sul fondo. Il telaio acrilico è sospeso al centro del becher tramite un gancio acrilico che poggia sul bordo del becher. Il bubbler di vetro viene inserito fino in fondo. Il design permette l'ossigenazione di entrambi i lati delle fette. Il bubbling fornisce anche una miscelazione costante di aCSF nella camera di recupero. La maglia nera fornisce un contrasto elevato rispetto alle fette bianche, che sono quindi più facili da vedere.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare la soluzione di perfusione e taglio trascardica.<ol>
<li>Raffreddare l'intero 300 mL di NMDG-aCSF in un congelatore, fino a quando i cristalli di ghiaccio iniziano a formarsi sulla superficie e sulle pareti della bottiglia. NON congelare troppo!</li>
		<li>Mettere la bottiglia con NMDG-aCSF refrigerato sul ghiaccio e bolla. La soluzione deve essere compresa tra 0 e 20122 . NOTA: Slushy NMDG- aCSF implica avere la maggior parte della soluzione come liquido, mentre una piccola frazione di ghiaccio fangoso presente manterrà la soluzione vicino a 0 gradi centigradi durante la perfusione e il taglio. Si dovrebbe fare attenzione a tenere lontani i cristalli di ghiaccio dal cervello durante il taglio.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare il disco di montaggio dei tessuti.<ol>
<li>Togliere il disco dal freezer, asciugarlo se necessario.</li>
		<li>Tagliare un blocco di 5% agar dalla piastra di agar precedentemente preparata, e incollarlo al centro del disco utilizzando un sottile strato di colla cianoacrilato. Il pezzo di agar dovrebbe essere circa le dimensioni di un cervello di topo. Mettere il disco con l'agar incollato sul ghiaccio e coprire con carta assorbente fino a quando non è pronto per l'uso.<ol>
<li>Per 5% agar piatto, sciogliere 5 g di agar in 100 mL di 18 MΩ acqua da microwaving, e versare in un piatto di Petri pulito. Tenere a 4 gradi centigradi.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Togliere il vassoio di taglio dal congelatore, posizionarlo nel microtome, circondarlo di ghiaccio e caricare la lama.</li>
</ol>2. Perfusione trascardica ed estrazione cerebrale
<ol><li>Overdose di topi tramite un'iniezione intraperitoneale di cocktail anestetico. Controllare la profondità dell'anestesia controllando il riflesso del dolore (pizzicamento delle dita dei piedi); un topo non deve mostrare il riflesso una volta che raggiunge l'anestesia profonda. NOTA: Ricetta di cocktail per l'anestesia dei roditori: Ketamina HCl (66 mg/mL), HCl xylazine (6,6 mg/mL), maschio di acepromazina (0,1 mg/mL), 18 MΩ acqua al volume finale. Dose: 0,4 mg/g di peso corporeo, 0,04 mg/g di peso corporeo, 6 x 10-4 mg/g di peso corporeo rispettivamente per ketamina, xylazina e acepromazina.</li>
	<li>Impostare la pompa peristaltica per la perfusione trascardica. Inserire un lato della pompa tubing nella bottiglia con NMDG-aCSF ghiacciato. Montare l'altro lato del tubo con l'ago da 27 G che verrà inserito nel ventricolo sinistro.</li>
	<li>Impostare la velocità della pompa a circa 3,5 mL/min. A questa velocità, il deflusso di NMDG-aCSF è una flebo veloce, non un flusso continuo. NOTA: La perfusione per gravità è un buon sostituto della perfusione della pompa peristaltica, purché sia possibile raggiungere la stessa velocità di flusso approssimativa. Una perfusione ad alta velocità di flusso si tradurrà in scoppio vasi sanguigni nel cervello. Un segno rivelatore di una perfusione eccessivamente veloce e di una maggiore pressione nei vasi sanguigni è la soluzione che esce dal naso dell'animale.</li>
	<li>Aspersione<ol>
<li>Posizionare il mouse correttamente anethetizzato sulla schiena su un pannolino. Utilizzando nastro adesivo, nastro adesivo lungo le zampe anteriori e posteriori in modo che il torace e l'addome sono esposti.</li>
		<li>Ritagliare una grande macchia della pelle in cima al petto, passando da sotto lo sterno alla gola; questo dovrebbe fornire un'ampia area di lavoro. Afferrare lo sterno con le forcelle, sollevare delicatamente e iniziare a tagliare attraverso la gabbia toracica su entrambi i lati fino a quando la cavità toracica è esposta.</li>
		<li>Tagliare il diaframma per esporre la cavità toracica. Il lembo della gabbia toracica deve essere lasciato attaccato tramite un sottile pezzo di muscolo. Dovrebbe essere possibile impostarlo su un lato senza farlo ricad vedere la cavità toracica esposta. Controlla che il cuore batte ancora. Assicurarsi che la maggior parte del fegato sia visibile.</li>
		<li>Inserire l'ago da 27 G nel ventricolo sinistro; il ventricolo sinistro del mouse sembra più chiaro di destra. Individuare l'atrio destro di colore rosso scuro. Tagliare l'atrio destro con piccole forbici; il sangue dovrebbe iniziare a scorrere.</li>
		<li>Avviare la pompa che è stata preimpostata alla velocità di flusso corretta. Se tutto è stato fatto correttamente, il fegato dovrebbe iniziare a cambiare colore da rosso a marrone subito dopo l'inizio della perfusione. Monitorare il colore del fegato per determinare la lunghezza della perfusione; il fegato dovrebbe diventare marrone pallido.</li>
		<li>Eseguire la pompa per qualche minuto in più. Se si utilizza il termometro rettale, la temperatura corporea dovrebbe scendere a 28-u201229 gradi centigradi, e il naso dell'animale dovrebbe essere freddo al tatto.</li>
	</ol></li>
	<li>Estrazione cerebrale. NOTA: Per questo passo, avere pronti i seguenti strumenti di dissezione: forbici di decapitazione, piccole forbici con lama dritta o angolata, bisturi e lama #10, lama a bordo singolo, #3 force, spatola con un lato piegato a 90 gradi, una spatola, uno strumento "60"(Figura 1A,B) e un piccolo pennello morbido.<ol>
<li>Decapitare il topo con grandi forbici di decapitazione. Utilizzando un bisturi #10 lama, tagliare la pelle sulla parte superiore del cranio. Con piccole forbici angolate, tagliare il cranio sulla linea mediana. Successivamente, usando le #3, leva via le metà destra e sinistra del cranio, facendo attenzione a portare via la dura. Il cervello dovrebbe essere esposto ora. NOTA: Se la dura si stacca dal cranio, rimarrà sopra il cervello e deve essere rimossa separatamente. I bordi della dura rimanente possono stringere e tagliare in profondità attraverso il cervello, potenzialmente danneggiando la regione del cervello di interesse.</li>
		<li>Rimuovere il cervello scavando fuori con una piccola spatola. Far cadere il cervello nella soluzione NMDG-aCSF posta in un piccolo becher separato sul ghiaccio. Lascialo lì per un minuto. NOTA: Oltre all'ipotermia, l'esposizione alla salina ghiacciata insaesta il cervello, che è necessario anche per il taglio. L'intera procedura dalla decapitazione all'estrazione cerebrale dovrebbe essere inferiore a 30 s.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Affettare
<ol><li>Togliere il cervello dal NMDG-aCSF e posizionarlo su un pezzo di carta da filtro.</li>
	<li>Tagliare e rimuovere un cuneo di 60 gradi dall'estremità rostrale del freno a reggino utilizzando un utensile "60" centrato sulla linea mediana. Le superfici tagliate verranno utilizzate per il montaggio per ottenere l'angolo corretto per le sezioni dell'ippocampo trasversale, come descritto di seguito (Figura 1A,B). NOTA: Due lame a taglio singolo tenute insieme tramite un supporto fatto in casa rendono uno strumento facile da usare per realizzare il taglio a 60 gradi(Figura 1A).</li>
	<li>Separare gli emisferi lungo la linea mediana con il bisturi.</li>
	<li>Incollare gli emisferi sul disco di montaggio come segue. Prendi il disco di montaggio che è stato sul ghiaccio fino ad ora. Se necessario, asciugarlo di nuovo. Incollare ogni emisfero di fronte al blocco agar, tagliare lato verso il basso.</li>
	<li>Assicurarsi che il lato ventrale di ogni emisfero tocchi il blocco agar. Il blocco agar fornisce ulteriore supporto durante il taglio ed è essenziale per le fette pari. I lati dorsali di ogni emisfero devono essere rivolti verso la lama. Quando incollato sul lato taglio, ogni emisfero è orientato rispetto alla lama in un modo che si traduce in fette trasversali di ippocampo dorsale in situ (Figura 1B).</li>
	<li>Immergere il disco con gli emisferi in una camera di taglio contenente NMDG-aCSF carbogenato a ghiaccio freddo.</li>
	<li>Tagliare le sezioni di 400 m. Il taglio deve essere fatto in meno di 10 min. Microtomi diversi richiederanno impostazioni diverse per raggiungere questo tempo. Si ottiene un totale di 8 fette di 8-u201210 dalla regione dell'ippocampo dorsale.</li>
</ol>4. Recupero
<ol><li>Trasferire le fette in una camera di recupero contenente aCSF carbogenato a temperatura ambiente utilizzando pipette di trasferimento usa e getta con punte di taglio (Figura 1C). NOTA: Si consiglia vivamente di fortificare il recupero camera-aSCF con 5 mM Na-ascorbate e 3 mM Na-pyruvate. Pyruvate è un substrato energetico mostrato per aumentare la produzione di ATP infette 28, mentre Na-ascorbate è un spezzone libero-radicale29.</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente (22 u201224) per circa 2 h prima della registrazione (fino a 4 h). NOTA: Un'incubazione più lunga a temperatura ambiente si traduce in fette più sane per periodi di tempo più lunghi, rispetto all'incubazione standard a 37 gradi centigradi per 30 min seguita dall'incubazione della temperatura ambiente. Il riscaldamento a 37 gradi centigradi può introdurre l'edema citotossico13.</li>
</ol>

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<li>Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Mechanisms+of+Frequency+Selectivity+in+the+Proximal+Dendrites+of+CA1+Pyramidal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).</li>
<li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li>
</ol>

L'autore non ha nulla da rivelare.

Il protocollo qui descritto dimostra che le fette di ippocampo ottenute da topi adulti e anziani possono rimanere sane e vitali per molte ore dopo il taglio. Le sezioni preparate utilizzando questo protocollo sono appropriate per le registrazioni di patch-clamp, così come le registrazioni sul campo di lunga durata nelle regioni CA1.
Esistono due passaggi critici in questo protocollo. Il primo passo è il passo di perfusione trascardica con una soluzione ghiacciata. La rapida liquidazione del sa...

L'avvento dei preparati a fette cerebrali acute dei mammiferi ha facilitato esperimenti a livello cellulare e sinaptico che in precedenza erano possibili solo in preparazioni invertebrate come Aplysia1. Lo sviluppo di fette acute di ippocampo era di particolare importanza, in quanto è una struttura responsabile della memoria di lavoro e della formazione del contesto, e ha un circuito tri-sinaptico specializzato che è su misura per una facile manipolazione fisiologica. Tuttavia, la stragrande maggioranza delle fette cerebrali acute sono ancora preparate da topi e ratti relativamente giovani, in quanto è più facile preservare neuroni e circuiti sani e le fette rimangono vitali per lunghi periodidi tempo 2,3,4. Qui, introduciamo modifiche ai protocolli di sezionamento standard che si traducono in una maggiore vitalità delle fette acute di ippocampo da topi adulti e invecchiati.
Il principale ostacolo alla vitalità ex vivo a lungo termine del parenchyma cerebrale dei mammiferi è il danno ipossico iniziale che si verifica rapidamente una volta che il flusso sanguigno al cervello smette di essere decapitato. La perdita di ossigeno si traduce in un rapido consumo metabolico di grandi risorse energetiche nel cervello con la perdita di fosfo-creatina (P-creatine) essendo il più rapido, seguito da glucosio, adenosina triphosphate (ATP), e glicogeno4. La conservazione dell'ATP è di particolare importanza per la salute a lungo termine delle fette cerebrali, in quanto l'ATP è necessario per mantenere il potenziale della membrana tramite l'ATPase Na-K, e di conseguenza l'attività neurale5,6. Il livello ATP nel cervello dei roditori adulti è di 2,5 mM, e scende precipitosamente entro 20 s di decapitazione per raggiungere uno stato stabile basale (0,5 mM) a circa 1 min dopo ladecapitazione 4,7,8. Negli animali giovani, ci vuole più tempo per osservare lo stesso calo dell'ATP (2 min); con anestesia fenobarbitale è ulteriormente rallentato a 4 min4. Queste considerazioni dimostrano che prevenire la perdita di ATP e altre risorse energetiche è una strategia necessaria per prevenire danni ipossici al cervello e a sua volta per mantenere la salute delle fette cerebrali per lunghi periodi di tempo, soprattutto negli animali adulti.
Le basse temperature rallentano il metabolismo. Di conseguenza, è stato dimostrato che una modesta ipotermia protegge le riserve di energia cerebrale: negli animali giovani, abbassando la temperatura corporea di sei gradi, da 37 gradi centigradi a 31 gradi centigradi, mantiene i livelli di ATP a circa l'80% dei livelli normali oltre i 4 h di ipossiacontrollata 9. I livelli di P-creatina sono conservati allo stesso modo, così come il potenziale di fosforilazione complessiva9. Ciò suggerisce che abbassare la temperatura corporea prima della decapitazione potrebbe essere neuroprotettivo, come quasi normale livelli di ATP potrebbero essere mantenuti attraverso il taglio fetta e slice periodi di recupero.
Nella misura in cui un calo ATP non può essere completamente impedito al momento della decapitazione, si prevede una funzione parzialmente compromessa del Na-K ATPase, seguita dalla depolarizzazione tramite afflusso passivo di sodio. Poiché l'afflusso passivo di sodio è seguito dall'ingresso di acqua nelle cellule, provoca edema citotossico e infine pyknosis. Nei ratti adulti, la sostituzione degli ioni di Naè con il saccarosio nelle soluzioni di taglio delle fette è stata una strategia di successo per alleviare il peso dell'edema citotossico10,11. Più di recente, le cations organiche metilate che riducono la permeabilità del canale di sodio12 hanno dimostrato di offrire una protezione più efficace rispetto al saccarosio, soprattutto nelle fette di topi adulti, con N-methyl-D-glucamina (NMDG) più ampiamente applicabile tra diverse età e regioni del cervello13,14,15,16.
Numerosi protocolli di taglio del cervello prevedono l'utilizzo di temperature fredde solo durante la fase di taglio delle fette, a volte in combinazionecon la strategia di sostituzione degli ioniNa 16,17. Nei giovani animali, questi protocolli sembrano offrire sufficiente neuroprotezione poiché il cervello può essere estratto rapidamente dopo la decapitazione perché il cranio è ancora sottile e facile da rimuovere3. Tuttavia, questa strategia non produce fette sane da animali adulti. Nel corso del tempo, un certo numero di laboratori che studiano roditori adulti hanno introdotto la perfusione transcardiale con una soluzione ghiacciata per diminuire la temperatura corporea dell'animale, e quindi danni ipossici al cervello, prima della decapitazione. Questa procedura è stata applicata con successo per produrre fette cerebellari18, fette midbrain19, fette neocorticali11,20, corteccia perirhinale21, ippocampo di ratto10,22,23, bulbo olfattivo24, ventrala stritatum25, corteccia visiva26.
Nonostante i vantaggi offerti dalla perfusione transcarriale e dalla sostituzione degli ioni na- nella preparazione di fette di ratto e in alcune regioni cerebrali nei topi, l'ippocampo dei topi rimane una delle aree più impegnative da proteggere dall'ipossia13,20. Ad oggi, uno degli approcci più comuni per affettare l'ippocampo da topi e modelli murini di invecchiamento della neurodegenerazione comporta il classico affettatura veloce dell'ippocampoisolato 27. Nel protocollo qui descritto, riduciamo al minimo la perdita di ATP nel cervello adulto introducendo l'ipotermia prima della decapitazione mediante la decifrazione dell'animale conna- liquido cerebrospinale artificiale a base di NMDG (NMDG-aCSF) gratuito. Le fette vengono poi tagliate+in NMDG-aCSF senza ghiaccio. Con questo protocollo avanzato otteniamo fette acute di ippocampo da topi adulti e di invecchiamento che sono sani fino a 10 h dopo il sezionamento e sono appropriati per le registrazioni sul campo a lungo termine e gli studi di patch-clamp.

<table><tbody><tr><td>" 60 gradi" strumento</td><td>fatto in-house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#10 lama per bisturi</td><td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>1M CaCl2</td><td>Fluka Analytical</td><td>21114</td><td></td></tr><tr><td>95%O2/5%CO2</td><td>Praxiar o un altro fornitore</td><td></td><td></td>locale</tr><tr><td>Acepromazina maleato (AceproJect)</td><td>Henry Schein</td><td>5700850</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Becher, cilindri dosatori, flaconi</td><td></td><td></td><td></td>di reagenti</tr><tr><td>Pennelli misura 00-2</td><td>I negozi Ted Pella</td><td></td><td>Crafts sono un'altra fonte di pennelli morbidi, con una selezione più ampia e una qualità migliore rispetto a Ted Pella.</td></tr><tr><td>Telecamera CCD</td><td>Olympus</td><td>XM10</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di colina</td><td>Pfalz & Bauer</td><td>C21240</td><td></td></tr><tr><td>Colla cianoacrilata</td><td>Colla</td><td></td> Krazy <td>Singles</td></tr><tr><td>Forbici per decapitazione</td><td>FST</td><td>14130-17</td><td></td></tr><tr><td>Lame di piume</td><td>Feather</td><td>FA-10</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro #2</td><td>Whatman</td><td></td><td>Sia i tondi che i pezzi tagliati da un foglio più grande funzionano bene.</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>A. Dumont & Fils</td><td>Inox 3c</td><td></td></tr><tr><td>Bubbler in vetro (candele con microfiltro in vetro borosillicato) - porosità 3</td><td>Robuglas.com</td><td>18103 o 18113</td> I <td>gorgogliatori in vetro sono più costosi delle pietre gorgoglianti utilizzate negli acquari. Tuttavia, sono facili da pulire e sterilizzare e possono durare a lungo.</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>A144SI-212</td><td></td></tr><tr><td>Secchielli per</td><td></td><td></td><td></td>il ghiaccio</tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina HCl (KetaVed)</td><td>VEDCO</td><td>NDC 50989-996-06</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Affettatrice Leica VT1000S</td><td></td><td></td><td>Le impostazioni di taglio sono 1 mm di ampiezza orizzontale della lama, manopola della frequenza a 9 e impostazione della velocità a 2</td></tr><tr><td>Agitatori magnetici e barre</td><td></td><td></td><td></td>di agitazione</tr><tr><td>Mg2SO4 x 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Macchina per l'acqua MilliQ</td><td>Fonte</td><td></td><td>per acqua da 18 Mohm</td></tr><tr><td>Na-ascorbato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4035</td><td></td></tr><tr><td>Na-piruvato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8574</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>EMD</td><td>SX0320-1</td><td></td></tr><tr><td>Ago 27G1/2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMDG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td></td></tr><tr><td>Nastro</td><td></td><td></td><td></td>di carta</tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Cole-Parmer</td><td>#7553-70</td><td></td></tr><tr><td>Testa della pompa peristaltica</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex #7518-00</td><td></td></tr><tr><td>Lame</td><td></td><td>Personna Personna</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> misuratore di pH Amazon a doppio bordo<tr><td>Camera di recupero</td><td>realizzata</td><td></td><td></td>internamente</tr><tr><td>Manico della lama del bisturi misura 3</td><td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td><td>371030</td><td></td></tr><tr><td>Forbici lama angolata</td><td>FST</td><td>14081-09</td><td></td></tr><tr><td>Lama di rasoio industriale a filo singolo #9</td><td>VWR</td><td>55411</td><td></td></tr><tr><td>Spatole</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento</td><td>Samco Scientific</td><td>225</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio dritto</td><td>Olympus BX51WI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine HCl (XylaMed)</td><td>VetOne</td><td>510650</td><td></td></tr></tbody></table>

ridurre al minimo l'ipossia nelle fette di ippocampale da topi adulti e anziani

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Le fette acute dell'ippocampo hanno permesso a generazioni di neuroscienziati di esplorare le proprietà sinaptiche, neuronali e dei circuiti in dettaglio e con alta fedeltà. L'esplorazione dei meccanismi LTP e LTD, il calcolo dendritico singolo neurone e i cambiamenti dipendenti dall'esperienza nei circuiti, non sarebbero stati possibili senza questa preparazione classica. Tuttavia, con poche eccezioni, la maggior parte della ricerca di base utilizzando fette acute di ippocampo è stata eseguita utilizzando fette di roditori di età relativamente giovani, P20-P40, anche se i meccanismi di eccitabilità sinaptica e intrinseca hanno una lunga coda di sviluppo che raggiunge oltre P60. Il fascino principale dell'utilizzo di giovani fette di ippocampo è la conservazione della salute neuronale aiutata da una maggiore tolleranza ai danni ipossici. Tuttavia, c'è bisogno di comprendere la funzione neuronale in fasi più mature di sviluppo, ulteriormente accentuate dallo sviluppo di vari modelli animali di malattie neurodegenerative che richiedono una preparazione cerebrale di invecchiamento. Qui descriviamo una modifica a una preparazione acuta a fette di ippocampo che fornisce in modo affidabile fette sane da ippocampo di topo adulto e invecchiamento. I passaggi critici del protocollo sono la perfusione trascardica e il taglio con NMDG-aSCF senza sodio ghiacciato. Insieme, questi passaggi attenuano il calo indotto dall'ipossia nell'ATP al momento della decapitazione, così come l'edema citotossico causato da flussi di sodio passivo. Dimostriamo come tagliare fette trasversali di ippocampo più corteccia utilizzando un microtome vibrante. Le fette acute di ippocampo ottenute in questo modo sono affidabili per molte ore di registrazione e sono appropriate sia per le registrazioni sul campo che per le registrazioni mirate di morsetto patch, incluso il targeting dei neuroni etichettati fluorescentemente.

Abbiamo applicato il protocollo di cui sopra per generare fette di ippocampo da CamKIIa-Cre; Topi WT su sfondo genetico misto C57Bl/ 6 x SV/ 129J, a P &gt; 120. Un gran numero di cellule piramidali nel campo CA1 (Figura 2A) e subiculum (Figura 2B) appaiono in basso contrasto quando osservati sotto la microscopia a contrasto differenziale a infrarossi (IR-DIC), un segno distintivo delle cellule sane in una preparazione di sezione. Con questa preparazione, un alto...

Questo è un protocollo per la preparazione a slice acuta da ippocampo di topi adulti e invecchiamento che sfrutta la perfusione transcardiale e il taglio delle fette con NMDG-aCSF ghiacciato per ridurre i danni ipossici al tessuto. Le fette risultanti rimangono sane per molte ore e sono adatte per le registrazioni di patch e field a lungo termine.

Ridurre al minimo l'ipossia nelle fette di ippocampale da topi adulti e anziani

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Il protocollo qui presentato riduce l'eccessivo danno ipossia durante la preparazione di fette ippocampali di topo adulte e invecchianti, rimuovendo così un grosso ostacolo per lo studio della funzione dei circuiti neurali maturi e invecchiati. L'introduzione dell'ipotermia nelle soluzioni senza sodio si traduce in fette ippocampali che sono sane fino a 10 ore dopo il taglio e appropriate sia per le registrazioni sul campo a lungo termine che per gli studi di patch-clamp. Questo metodo di preparazione delle fette ippocampali potrebbe essere particolarmente rilevante per i modelli animali nelle malattie neurodegenerative che per definizione richiedono una preparazione cerebrale invecchiata.Il passaggio più critico di questo protocollo è l'introduzione dell'ipotermia tramite profusione trascardica con una soluzione ghiacciata. Con una certa pratica, i ricercatori saranno in grado di eseguire in modo affidabile questo passaggio. Inizia preparando un litro di soluzione aCSF per la camera di recupero e le registrazioni successive.Quindi preparare 300 millilitri di NMDG-aCSF per la profusione trascardica e le fasi di taglio. Posizionare il vassoio di taglio del microtomo vibrante e il di

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Questo articolo descrive le procedure per la preparazione di fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche associate con l'invecchiamento cerebrale e le malattie neurodegenerative legate all'età, come la malattia di Alzheimer.

Preparazione di acuta fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche durante l&#39;invecchiamento e Amiloide Patologia

Questo articolo presenta una metodologia completa per preparare e...

Miglioramento della preparazione e la conservazione di fette mouse ippocampo per una registrazione molto stabile e riproducibile di potenziamento a lungo termine

Questo articolo video descrive procedure sperimentali per studiare la plasticità a lungo termine e i suoi processi associativi come il tagging sinaptico, la cattura e il cross-tagging nei neuroni piramidali CA1 utilizzando fette acute di ippocampo da roditori.

Indagine di Synaptic Tagging / Cattura e Cross-cattura utilizzando acuta fettine di ippocampo da Roditore

Questo protocollo viene illustrata l'implementazione di un ottimizzato N-metilico-D-glucamine (NMDG) protezione recupero metodo di preparazione di fetta di cervello. Una formulazione di singolo supporto viene utilizzata per ottenere in modo affidabile fette di cervello sano da animali di tutte le età e per diverse applicazioni sperimentali.

Preparazione di fettine di cervello acuto utilizzando un' ottimizzata N-metilico-D-metodo di ripristino protettivo glucamine

Colture organotipiche fettine di ippocampo (OHSC) rappresentano un modello in vitro che simula molto bene la situazione in vivo . Qui descriviamo un basato su vibratome migliorato affettare protocollo per ottenere fette di alta qualità per uso nel valutare il potenziale di neuroprotective del romanzo sostanze o il comportamento biologico delle cellule del tumore.

Colture Hippocampal Fetta organotipiche come modello di studio Neuroprotection e l'invasività delle cellule del tumore

Un protocollo per accuratamente identificare e analizzare le sinapsi nelle fette hippocampal mediante immunofluorescenza è descritto in questo articolo.

Valutazione di densità di sinapsi nelle fette Hippocampal del cervello del roditore

Questo protocollo descrive la preparazione di fette orizzontali di corteccia ippocampale-entorinale (HEC) da topi che mostrano un'attività spontanea di increspatura ad onda acuta. Le fette vengono incubate in una camera di tenuta dell'interfaccia semplificata e le registrazioni vengono eseguite in condizioni sommerse con liquido cerebrospinale artificiale a flusso rapido per promuovere l'ossigenazione dei tessuti e l'emergere spontaneo di attività a livello di rete.

Affezione cerebrale acuta del topo per indagare sull'attività spontanea della rete ippocampale

Questo articolo ha lo scopo di descrivere un protocollo sistematico per ottenere fette orizzontali del cervello ippocampale nei topi. L'obiettivo di questa metodologia è preservare l'integrità delle vie della fibra ippocampale, come il percorso perforante e il tratto di fibra muschiata per valutare i processi neurologici correlati al giro dentato.

Fette ippocampali orizzontali del cervello del topo

Presentiamo un protocollo per preparare fette acute dall'ippocampo dorsale-intermedio dei topi. Confrontiamo questa preparazione trasversale con l'affezione coronale in termini di qualità delle registrazioni e conservazione delle caratteristiche morfologiche dei neuroni registrati.

Preparazione di fette acute dall'ippocampo dorsale per la registrazione a cellule intere e la ricostruzione neuronale nel giro dentato di topi adulti

Il tasso di consumo di ossigeno (OCR) è un proxy comune per la funzione mitocondriale e può essere utilizzato per studiare diversi modelli di malattia. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo utilizzando un analizzatore Seahorse XF per misurare direttamente l'OCR in fette striatal acute di topi adulti che è più fisiologicamente rilevante rispetto ad altri metodi.

Misurazione del tasso di consumo di ossigeno nelle fette striatali acute di topi adulti

Scopri come ridurre l'ipossia nelle fette di ippocampo da topi adulti e anziani mediante perfusione transcardiaca con NMDG-aCSF ghiacciato. Questo metodo preserva la vitalità cellulare fino a 10 ore per registrazioni elettrofisiologiche di lunga durata.

Ridurre al minimo l'ipossia nelle fette di ippocampale da topi adulti e anziani

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