Un metodo di rilevamento quantitativo per i microRNA nel rene di un modello murino di danno renale ischemico

L'alterata espressione di microRNA nell'AKI può essere utile per i biomarcatori e la terapia. Questo protocollo è semplice e raggiunge risultati costanti tra i laboratori. L'IRI del rene rappresenta uno dei principali fattori di rischio per l'AKI. La quantificazione dei microRNA che vengono alterati dall'IRI porta a una diagnosi. I microRNA purificati da un campione di rene vengono applicati ad altri sistemi. Monitorare attentamente l'ipotermia, l'idratazione intestinale e la profondità dell'anestesia durante la procedura. Questo perché ci sono molte tecniche manuali a cui abituarsi.

[Narratore] Dopo aver confermato la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi, posizionare il mouse anestetizzato su un cuscinetto chirurgico riscaldato in posizione supina. Dopo aver praticato un'incisione addominale sulla linea mediana, utilizzare un batuffolo di cotone inumidito con PBS per spingere delicatamente l'intestino sul lato sinistro della cavità extra-addominale per esporre il rene e l'uretere destro e utilizzare una pinza angolata per sollevare l'uretere destro. Legare l'uretere in due punti con suture intrecciate di seta 4-0, lasciando legami più lunghi per la sutura che è più vicina al rene, e tagliare tra le suture. Tenendo con cura la sutura rimanente, sezionare senza mezzi termini il tessuto connettivo e il grasso lungo il rene e identificare un vaso sanguigno che non sia le arterie o le vene renali che forniscono sangue al rene destro. Legare il vaso e, quando il rene destro è stato sufficientemente staccato, legare la vena renale e l'arteria. Usando un batuffolo di cotone inumidito con PBS, spingi delicatamente l'intestino verso il lato destro della cavità addominale extra per esporre il rene sinistro e coprire l'intestino con un telo inumidito. Dopo aver preparato il rene sinistro come dimostrato, bloccare l'arteria renale e la vena a un centimetro dal rene per indurre l'ischemia renale sinistra. Un'ischemia di successo può essere confermata visivamente da un graduale e uniforme oscuramento del tessuto renale. Quando l'ischemia è confermata, riportare il tessuto intestinale nella cavità addominale, facendo attenzione a evitare torsioni intestinali, e chiudere e drappeggiare temporaneamente la pelle addominale. Dopo 25-45 minuti, rimuovere il morsetto e confermare che la riperfusione del flusso sanguigno e il colore dei reni migliorino. Dopo aver confermato che l'intestino non è attorcigliato, instillare PBS intraperitoneale e chiudere il muscolo addominale e la pelle in due strati utilizzando suture di nylon 4-0. 24 ore dopo l'induzione della lesione ischemica, riaprire l'incisione della linea mediana e utilizzare un ago calibro 27 per raccogliere il sangue dalla vena cava inferiore. Praticare un'incisione sulla linea mediana nella parete toracica e inserire un ago calibro 23 nel ventricolo sinistro. Dopo aver confermato il riflusso nell'ago, praticare un'incisione nel lobo destro del fegato e iniettare 20 millilitri di PBS. Il fegato cambierà da rosso a rosa, confermando che è stata drenata una quantità sufficiente di sangue. Usa pinze e forbici per rimuovere il rene sinistro e lava il tessuto asportato in una ciotola di PBS. Quindi utilizzare la pinza per rimuovere la fascia renale senza seccare il rene e tagliare il rene a metà lungo la linea mediana verticale. Per la purificazione dei microRNA, mettere 30 milligrammi del campione di rene congelato in un omogeneizzatore di vetro contenente 700 microlitri di reagente di lisi a base di fenilguanidina su ghiaccio e ruotare lentamente e ripetutamente il pestello per omogeneizzare completamente il campione. Quando il tessuto è stato completamente dissociato, trasferire il lisato omogeneizzato nel sistema di triturazione del biopolimero in una colonna di centrifuga per microcentrifuga in una provetta di raccolta da due millilitri e raccogliere il campione sul fondo della provetta mediante centrifugazione. Trasferire il lisato in una nuova provetta da microcentrifuga contenente 140 microlitri di cloroformio e mescolare la provetta per inversione per 15 secondi con il tappo ben stretto. Dopo un'incubazione di due o tre minuti a temperatura ambiente, sedimentare il campione mediante centrifugazione e trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga contenente 1,5 volte il volume di etanolo al 100% senza disturbare il pellet. Mescolare il campione per cinque secondi mediante vortice prima di trasferire 700 microlitri di campione in una colonna di centrifuga a base di membrana di silice in una provetta di raccolta da due millilitri. Dopo una breve centrifugazione, scartare il flusso continuo e lavare il campione due volte con 500 microlitri di tampone di lavaggio 2 in una nuova colonna di centrifuga a base di membrana di silice per lavaggio per rimuovere eventuali tracce di sale. Dopo il secondo lavaggio, centrifugare nuovamente la colonna di centrifuga a base di membrana di silice e, dopo aver scartato il flusso, trasferire la colonna in una nuova provetta di raccolta da 1,5 millilitri. Aggiungere 25 microlitri di acqua priva di RNasi alla colonna e incubare il campione per cinque minuti a temperatura ambiente prima di centrifugare nuovamente il campione. Quindi trasferire l'eluite contenente microRNA da 25 microlitri in una nuova provetta per microcentrifuga. In questo studio, sono stati studiati sette microRNA espressi nell'uomo che erano sovraregolati nei reni di topi con danno renale acuto. I livelli di sei dei microRNA sono risultati significativamente aumentati nei reni dei topi con danno da riperfusione ischemica rispetto a quelli dei topi finti utilizzando la PCR quantitativa in tempo reale, come dimostrato. Anche i livelli sierici, di azoto ureico e creatinina nel sangue e la necrosi tubulare acuta sono stati significativamente sovraregolati.

I biomarcatori per la diagnosi di IRI e il trattamento specifico dell'AKI rimangono poco chiari. Spero che la ricerca sui microRNA avanzi e contribuisca alla diagnosi e al trattamento dell'AKI.