Name: Un metodo di rilevamento quantitativo per i microRNA nel rene di un modello murino di danno renale ischemico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Scopri un metodo di rilevamento quantitativo dei microRNA nel rene di un modello murino di danno renale ischemico. Questo protocollo utilizza PCR in tempo reale per analizzare l'espressione genica e identificare biomarcatori per la diagnosi dell'AKI.

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<ol><li>Kelly, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure%3A+much+more+than+a+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Seminas+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure: much more than a kidney disease.</a> Seminas in Nephrology. 26 (2), 105-113 (2006).</li>
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<li>Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+Development+and+Disease%3A+Background%2C+Mechanisms%2C+and+Therapeutic+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches.</a> Physiological Reviews. 96 (4), 1297-1325 (2016).</li>
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<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+miR-126+is+a+potential+biomarker+to+predict+the+onset+of+type+2+diabetes+mellitus+in+susceptible+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 463 (1-2), 60-63 (2015).</li>
<li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-21+is+a+key+therapeutic+target+for+renal+injury+in+a+mouse+model+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).</li>
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<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+%28miRQC%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li>
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<li>Jonas, S., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+molecular+understanding+of+microRNA-mediated+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing.</a> Nature Reviews. Genetics. 16 (7), 421-433 (2015).</li>
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<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+of+miRNA-17-5p%2C+miRNA-21+and+miRNA-106a+level+during+rat+kidney+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Yi+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Changes of miRNA-17-5p, miRNA-21 and miRNA-106a level during rat kidney ischemia-reperfusion injury.</a> Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 95 (19), 1488-1492 (2015).</li>
<li>Saikumar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+circulation%2C+and+excretion+profile+of+microRNA-21%2C+-155%2C+and+-18a+following+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%3A+an+Official+Journal+of+the+Society+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Expression, circulation, and excretion profile of microRNA-21, -155, and -18a following acute kidney injury.</a> Toxicological Sciences: an Official Journal of the Society of Toxicology. 129 (2), 256-267 (2012).</li>
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<li>Zhou, J., Chen, H., Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+the+expression+profile+of+non-coding+RNAs+involved+in+ischemia%2Freperfusion-induced+acute+kidney+injury+in+mice+using+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of the expression profile of non-coding RNAs involved in ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury in mice using RNA sequencing.</a> Oncotarget. 8 (59), 100196-100215 (2017).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profile+by+next-generation+sequencing+in+a+novel+rat+model+of+contrast-induced+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profile by next-generation sequencing in a novel rat model of contrast-induced acute kidney injury.</a> Annals of Translational Medicine. 7 (8), 178(2019).</li>
<li>Colbert, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model-specific+role+of+microRNA-223+as+a+mediator+of+kidney+injury+during+experimental+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">A model-specific role of microRNA-223 as a mediator of kidney injury during experimental sepsis.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (2), 553-559 (2017).</li>
<li>Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., El Nahas, A. M., Haylor, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+body+temperature+in+a+rat+model+of+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury.</a> Transplantation Proceedings. 39 (10), 2983-2985 (2007).</li>
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<li>Rockett, J. C., Hellmann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirming+microarray+data--is+it+really+necessary%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Confirming microarray data--is it really necessary.</a> Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Pinzetta conica a punta piegata senza gancio</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>MA-47</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>tampone di lavaggio 1</td></tr><tr><td>Buffer RWT</td><td>Qiagen</td><td>1067933</td><td>tampone di lavaggio 2</td></tr><tr><td>topi C57B6</td><td>SLC</td><td>non assegna</td><td></td></tr><tr><td>pinza con denti</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>MA-49</td><td></td></tr><tr><td>pinza senza denti</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>MA-48-1</td><td></td></tr><tr><td>Clip emostatiche</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>KN&minus; Piastra</td> di reazione ottica a 96 pozzetti 353 <td></td></tr><tr><td>MicroAmp per qRT-PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316813</td><td>Piastra di reazione a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>Pellicola adesiva ottica MicroAmp Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>pellicola adesiva per piastra di reazione a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>miRNA-132-3p primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00003458</td><td>5'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG</td></tr><tr><td>miRNA-17-5p primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00029274</td><td>5'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG</td></tr><tr><td>miRNA-18a-5p primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00031514</td><td>5'UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG</td></tr><tr><td>miRNA-212-3p primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00003815</td><td>5'UAACAGUCUCCAGUCACGGCC</td></tr><tr><td>miRNA-21a-5p primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00009079</td><td>5'UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA</td></tr><tr><td>miRNA-223-3p primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00003871</td><td>5'UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA</td></tr><tr><td>miRNA-574-5p primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00043617</td><td>5'UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>colonna di spin a base di membrana di silice</td></tr><tr><td>miScript II RT kit</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR kit</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td></td></tr><tr><td>QIA trituratore</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>sistema di triturazione dei biopolimeri in una microcentrifuga centrifuga</td></tr><tr><td>centrifuga reagente di lisi QIAzol</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>reagente di lisi a base di fenolo/guanidina</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Flex Sistema di PCR in tempo reale Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>strumento di PCR in tempo reale</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Versione software 1.2.1.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>software dello strumento PCR in tempo reale</td></tr><tr><td>RNU6-2 primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td> forbici chirurgiche <td>non divulgate</td></tr><tr><td></td><td>Natsume Seisakusho</td><td>B-2</td><td></td></tr><tr><td>Applicatore di clip vascolari</td><td>VITALITEC</td><td>1621420</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo di rilevamento quantitativo per i microrna nel rene di un modello murino di danno renale ischemico

A Quantitative Detection Method for MicroRNAs in the Kidney of an Ischemic Kidney Injury Mouse Model

Qui, è stato studiato il profilo di espressione dei miRNA nei topi AKI. Il profilo di espressione dei miRNA è stato studiato in vari organi e tessuti nei topi. I miRNA sono importanti regolatori post-trascrizionali e sono ora ampiamente studiati nella caratterizzazione di una varietà di malattie, tra cui l'AKI. I miRNA hanno il potenziale per aiutare a chiarire le condizioni patologiche ed essere applicati al trattamento di AKI12. Le principali cause di AKI sono l'IRI, l'insulto nefrotossico e la ...

Un metodo di rilevamento quantitativo per i microRNA nel rene di un modello murino di danno renale ischemico

MicroRNAs (miRNAs) are involved in various disease states and are effective biomarkers for the early diagnosis of diseases and treatment in mice. However, ...

L'alterata espressione di microRNA nell'AKI può essere utile per i biomarcatori e la terapia. Questo protocollo è semplice e raggiunge risultati costanti tra i laboratori. L'IRI del rene rappresenta uno dei principali fattori di rischio per l'AKI. La quantificazione dei microRNA che vengono alterati dall'IRI porta a una diagnosi. I microRNA purificati da un campione di rene vengono applicati ad altri sistemi. Monitorare attentamente l'ipotermia, l'idratazione intestinale e la profondità dell'anestesia durante la procedura. Questo perché ci sono molte tecniche manuali a cui abituarsi.[Narratore] Dopo aver confermato la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi, posizionare il mouse anestetizzato su un cuscinetto chirurgico riscaldato in posizione supina. Dopo aver praticato un'incisione addominale sulla linea mediana, utilizzare un batuffolo di cotone inumidito con PBS per spingere delicatamente l'intestino sul lato sinistro della cavità extra-addominale per esporre il rene e l'uretere destro e utilizzare una pinza angolata per sollevare l'uretere destro. Legare l'uretere in due punti con suture intrecciate di seta 4-0, lasciando legami più lunghi per la sutura che è più vicina al rene, e tagliare tra le suture. Tenendo con cura la sutura rimanente, sezionare senza mezzi termini il tessuto connettivo e il grasso lungo il rene e identificare un vaso sanguigno che non sia le arterie o le vene renali che forniscono sangue al rene destro. Legare il vaso e, quando il rene destro è stato sufficientemente staccato, legare la vena renale e l'arteria. Usando un batuffolo di cotone inumidito con PBS, spingi delicatamente l'intestino verso il lato destro della cavità addominale extra per esporre il rene sinistro e coprire l'intestino con un telo inumidito. Dopo aver preparato il rene sinistro come dimostrato, bloccare l'arteria renale e la vena a un centimetro dal rene per indurre l'ischemia renale sinistra. Un'ischemia di successo può essere confermata visivamente da un graduale e uniforme oscuramento del tessuto renale. Quando l'ischemia è confermata, riportare il tessuto intestinale nella cavità addominale, facendo attenzione a evitare torsioni intestinali, e chiudere e drappeggiare temporaneamente la pelle addominale. Dopo 25-45 minuti, rimuovere il morsetto e confermare che la riperfusione del flusso sanguigno e il colore dei reni migliorino. Dopo aver confermato che l'intestino non è attorcigliato, instillare PBS intraperitoneale e chiudere il muscolo addominale e la pelle in due strati utilizzando suture di nylon 4-0. 24 ore dopo l'induzione della lesione ischemica, riaprire l'incisione della linea mediana e utilizzare un ago calibro 27 per raccogliere il sangue dalla vena cava inferiore. Praticare un'incisione sulla linea mediana nella parete toracica e inserire un ago calibro 23 nel ventricolo sinistro. Dopo aver confermato il riflusso nell'ago, praticare un'incisione nel lobo destro del fegato e iniettare 20 millilitri di PBS. Il fegato cambierà da rosso a rosa, confermando che è stata drenata una quantità sufficiente di sangue. Usa pinze e forbici per rimuovere il rene sinistro e lava il tessuto asportato in una ciotola di PBS. Quindi utilizzare la pinza per rimuovere la fascia renale senza seccare il rene e tagliare il rene a metà lungo la linea mediana verticale. Per la purificazione dei microRNA, mettere 30 milligrammi del campione di rene congelato in un omogeneizzatore di vetro contenente 700 microlitri di reagente di lisi a base di fenilguanidina su ghiaccio e ruotare lentamente e ripetutamente il pestello per omogeneizzare completamente il campione. Quando il tessuto è stato completamente dissociato, trasferire il lisato omogeneizzato nel sistema di triturazione del biopolimero in una colonna di centrifuga per microcentrifuga in una provetta di raccolta da due millilitri e raccogliere il campione sul fondo della provetta mediante centrifugazione. Trasferire il lisato in una nuova provetta da microcentrifuga contenente 140 microlitri di cloroformio e mescolare la provetta per inversione per 15 secondi con il tappo ben stretto. Dopo un'incubazione di due o tre minuti a temperatura ambiente, sedimentare il campione mediante centrifugazione e trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga contenente 1,5 volte il volume di etanolo al 100% senza disturbare il pellet. Mescolare il campione per cinque secondi mediante vortice prima di trasferire 700 microlitri di campione in una colonna di centrifuga a base di membrana di silice in una provetta di raccolta da due millilitri. Dopo una breve centrifugazione, scartare il flusso continuo e lavare il campione due volte con 500 microlitri di tampone di lavaggio 2 in una nuova colonna di centrifuga a base di membrana di silice per lavaggio per rimuovere eventuali tracce di sale. Dopo il secondo lavaggio, centrifugare nuovamente la colonna di centrifuga a base di membrana di silice e, dopo aver scartato il flusso, trasferire la colonna in una nuova provetta di raccolta da 1,5 millilitri. Aggiungere 25 microlitri di acqua priva di RNasi alla colonna e incubare il campione per cinque minuti a temperatura ambiente prima di centrifugare nuovamente il campione. Quindi trasferire l'eluite contenente microRNA da 25 microlitri in una nuova provetta per microcentrifuga. In questo studio, sono stati studiati sette microRNA espressi nell'uomo che erano sovraregolati nei reni di topi con danno renale acuto. I livelli di sei dei microRNA sono risultati significativamente aumentati nei reni dei topi con danno da riperfusione ischemica rispetto a quelli dei topi finti utilizzando la PCR quantitativa in tempo reale, come dimostrato. Anche i livelli sierici, di azoto ureico e creatinina nel sangue e la necrosi tubulare acuta sono stati significativamente sovraregolati.I biomarcatori per la diagnosi di IRI e il trattamento specifico dell'AKI rimangono poco chiari. Spero che la ricerca sui microRNA avanzi e contribuisca alla diagnosi e al trattamento dell'AKI.

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Questo articolo viene descritto un protocollo in situ ottimizzato per il rilevamento colorimetrico di espressione microRNA nelle sezioni di rene fisse formalina.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione per tessuti renali fissati in formalina

Il modello murino di danno da riperfusione per ischemia renale qui descritto comprende una nefrectomia destra che fornisce il tessuto di controllo e il bloccaggio del peduncolo renale sinistro per indurre ischemia che provoca danno renale acuto. Questo modello utilizza un approccio laparotomico della linea mediana con tutti i passaggi eseguiti tramite un'unica incisione.

Renale ischemia riperfusione: un modello murino di infortuni e rigenerazione

Questo protocollo descrive un work-up completo del rene che deve essere eseguito in modelli murini di malattia glomerulare. I metodi consentono di dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, che può essere applicato a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

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Descriviamo un metodo per valutare l'espressione del microRNA nei reni dei topi con ostruzione ureterale unilaterale (UUO) mediante reazione a catena di polimerasi di trascrizione inversa quantitativa. Questo protocollo è adatto per studiare i profili di espressione del microRNA renale nei topi con UUO e nel contesto di altre condizioni patologiche.

Valutazione PCR in tempo reale quantitativa delle espressioni di microRNA nel rene del topo con ostruzione ureterale unilaterale

I microRNA sono coinvolti nella patogenesi della nefropatia da IgA. Abbiamo sviluppato un metodo affidabile per rilevare i livelli di espressione di microRNA nei reni di un modello murino di nefropatia IgA (topi HIGA). Questo nuovo metodo faciliterà il coinvolgimento dei miRNA nella nefropatia da IgA.

Rilevazione dell'espressione di microRNA nei reni di topi nefropatici con immunoglobuline A

Presentiamo un metodo per valutare l'espressione di microRNA nel rene e nel siero di topi con compromissione renale dipendente dall'età mediante reazione quantitativa a catena della polimerasi a trascrizione inversa.

Valutazione quantitativa della reazione a catena della polimerasi in tempo reale dell'espressione di microRNA nel rene e nel siero di topi con compromissione renale dipendente dall'età

Qui, forniamo miRNA esogeni sintetizzati artificialmente al rene tramite iniezione di vena della coda di un vettore non virale e nanoparticelle di polietilenimina in diversi modelli murini di malattie renali. Ciò ha portato a una significativa sovraespressione del miRNA bersaglio nel rene, con conseguente progressione inibita della malattia renale in diversi modelli murini.

Rilascio di miRNA esogeno sintetizzato artificialmente al rene utilizzando nanoparticelle di polietilenimina in diversi modelli murini di malattie renali

Questo articolo presenta un modello ischemico di CKD utilizzando IRI renale unilaterale con nefrectomia controlaterale eseguita un giorno prima della raccolta del campione; questo protocollo consente la valutazione funzionale basata sul siero, la sopravvivenza elevata e la patologia riproducibile della MRC entro 28 e 42 giorni, fornendo una piattaforma versatile per studi meccanicistici e interventistici.

Modello murino di transizione da malattia renale acuta a cronica indotta da ischemia/lesione da reperfusione renale

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Trapianto di isole isolate è stato proposto di essere un potenziale trattamento per il diabete di tipo 1. Qui si descrive un metodo per isolare le isole dal pancreas del mouse e trapiantarle allo spazio sottocapsulare del rene.

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Un metodo di rilevamento quantitativo per i microRNA nel rene di un modello murino di danno renale ischemico

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