Valutazione PCR in tempo reale quantitativa delle espressioni di microRNA nel rene del topo con ostruzione ureterale unilaterale
27 agosto 2020
Descriviamo un metodo per valutare l'espressione del microRNA nei reni dei topi con ostruzione ureterale unilaterale (UUO) mediante reazione a catena di polimerasi di trascrizione inversa quantitativa. Questo protocollo è adatto per studiare i profili di espressione del microRNA renale nei topi con UUO e nel contesto di altre condizioni patologiche.
Questo metodo consente di fornire espressione di microRNA nei reni dei topi con una vasta gamma di condizioni patologiche, come la fibrosi renale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la profilazione dell'espressione del microRNA con elevata precisione e sensibilità utilizzando un processo semplice che consente di risparmiare tempo e previene gli errori tecnici. Per eseguire l'intervento chirurgico fittizio, utilizzare forbici chirurgiche e pinzette per fare un'incisione nella pelle all'addome e tagliare il muscolo e la membrana peritoneale dalla vescica al bordo inferiore sinistro delle costole.
Inumidire due tamponi di cotone con PBS e tirare con cura l'intestino di lato. Posizionare i tamponi inumiditi per identificare il rene sinistro e l'uretero. Chiudere la membrana peritoneale e quindi l'incisione con nylon 4-0.
Per eseguire l'ostruzione uretrale unilaterale, o UUO, fare un'incisione nella pelle all'addome e tagliare il muscolo e la membrana peritoneale come dimostrato per l'intervento fittizio. Posizionare una siringa da 2,5 millilitri sotto il mouse. Inumidire due tamponi di cotone con PBS, quindi tirare accuratamente l'intestino di lato con le pinzette e posizionare i tamponi per identificare l'ureter sinistro.
Usa le pinzette per sollevare il rene sinistro. Usa la seta 4-0 per ligare l'uretero sinistro in due punti a circa un centimetro di distanza. Tagliare l'uretro nel punto centrale delle due legature e quindi utilizzare suture di nylon 4-0 per chiudere la membrana peritoneale e l'incisione.
Dopo aver tagliato la membrana peritoneale, come precedentemente dimostrato, sollevarla con una pinzetta e utilizzare forbici chirurgiche per fare un'incisione laterale sul bordo superiore, quindi continuare l'incisione lungo il bordo più basso delle costole. Identificare il rene sinistro e refluirlo con PBS fino a quando il rene diventa giallo-bianco. Rimuovere il rene tagliando l'arteria renale sinistra e la vena con le forbici chirurgiche e posizionarlo in una piastra di Petri, quindi lavarlo con cura con PBS.
Tagliare il rene in circa campioni da 10 milligrammi con le forbici chirurgiche e le pinzette, mettere ogni pezzo di rene nel proprio tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e chiudere il tappo del tubo. Mettere un campione di rene nell'omogeneizzatore di silicone e aggiungere 700 microlitri di un reagente di lisi a base di fenile/guanidina. Premere e torcere lentamente il pestello dell'omogeneizzatore contro il campione di rene per omogeneizzarlo.
Ripetere la pressatura e la torsione fino a quando il campione non viene completamente sciolto nel reagente dellalisi. Per omogeneizzare ulteriormente il campione, trasferire il lisato omogeneizzato nella colonna di spin del biopolimero e ruotarlo a 14.000 volte G per tre minuti, quindi trasferire il lisato precipitato in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri inutilizzato. Unire il lisato nel tubo con 140 microlitri di cloroformio e cappuccio saldamente il tubo.
Per mescolare il llysato e il cloroformio, invertire il tubo 15 volte. Incubare i campioni per due o tre minuti a temperatura ambiente, quindi girarli a 12.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Senza disturbare il precipitato, trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e aggiungere 1,5 volte il suo volume di etanolo al 100%.
Vortice la miscela per cinque secondi. Caricare 700 microlitri del campione su una colonna di spin ancorata a membrana in un tubo di raccolta a due millilitri. Chiudere il tappo della colonna e ruotare la colonna a 15.000 volte G per 15 secondi, quindi gettare via il lisato precipitato nel tubo di raccolta.
Lavare accuratamente il campione aggiungendo 700 microlitri di tampone di lavaggio uno alla colonna di spin ancorata a membrana in un tubo di raccolta a due millilitri. Quindi ripetere la centrifugazione e gettare via il tubo di raccolta. Ripetere il lavaggio due volte con 500 microlitri di tampone di lavaggio due per lavaggio.
Dopo l'ultimo lavaggio, ruotare la colonna di spin ancorata a membrana in un tubo di raccolta da due millilitri a 15.000 volte G per un minuto e gettare via il lisato precipitato. Trasferire la colonna di spin ancorata a membrana in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Sciogliere l'RNA totale aggiungendo 30 microlitri di acqua priva di RNasi alla colonna, chiudere il cappuccio della colonna e lasciarlo per cinque minuti a temperatura ambiente.
Quindi gira la colonna a 15.000 volte G per un minuto. Trasferire il campione contenente RNA totale in un nuovo tubo di microcentrifugo sul ghiaccio e misurare la concentrazione di RNA totale per spettrofotometria. Preparare una soluzione di mixaggio principale in base alle indicazioni del manoscritto e aggiungere otto microlitri a ciascun tubo di una striscia di tubi a otto pozzi.
Dopo aver regolato la densità totale dell'RNA, posizionare un'aliquota di 12 microliter dell'RNA totale in ogni tubo e chiudere il cappuccio. Centrifugare i tubi per 15 secondi. Mettere i tubi nel termociclo e incubarli per 60 minuti a 37 gradi Celsius.
Al termine, incubarli immediatamente per cinque minuti a 95 gradi Celsius per la sintesi di cDNA. Trasferire il cDNA in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e diluirlo 10 volte con acqua distillata. Vortice e centrifuga il tubo per cinque secondi, quindi eseguire PCR quantitativo in tempo reale, come descritto nel manoscritto testuale.
Questo protocollo è stato utilizzato per creare un modello unilaterale di topo ostruzione uretrale tramite legatura ureterale sinistra in topi maschi di otto settimane del peso di 20-25 grammi. Gli ureteri erano completamente ostruito da una doppia legatura con suture di seta 4-0. I reni sono stati raccolti a otto giorni dopo l'intervento chirurgico.
I dati del microRNA qRT-PCR indicavano che il livello di microRNA 3070-3p era significativamente aumentato e i livelli di microRNA, 7218-5p e microRNA 7219-5p sono diminuiti nei reni dei topi UUO rispetto ai controlli. Quando si tenta questo protocollo, ricordarsi di ripetere la torsione del campione di rene fino a quando non viene completamente sciolto nel reagente di lisi a base di fenil/ guanidina per ottenere una buona estrazione di RNA.
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Panoramica
In questo articolo viene descritto un metodo per valutare l'espressione dei microRNA nei reni di topi con ostruzione unilaterale dell'uretere (UUO) mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa con trascrizione inversa. La tecnica consente un'elevata accuratezza e sensibilità nell'analisi dell'espressione dei microRNA in diverse condizioni patologiche.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biologia
- Patologia renale
Sfondo
- I microRNA svolgono un ruolo cruciale nella regolazione genica.
- L'ostruzione unilaterale dell'uretere (UUO) è un modello per lo studio delle malattie renali.
- La comprensione dei profili di microRNA può fornire informazioni sulla fibrosi renale.
- I metodi attuali potrebbero mancare di sensibilità e accuratezza.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per valutare l'espressione dei microRNA nei tessuti renali.
- Facilitare la ricerca sulle malattie renali e sui meccanismi alla base di queste patologie.
- Migliorare la comprensione del ruolo dei microRNA nelle condizioni patologiche.
Metodi Utilizzati
- Reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR).
- Chirurgia fittizia per preparare il modello murino.
- Utilizzo di strumenti chirurgici per la manipolazione del tessuto.
- Applicazione di PBS per la manipolazione del tessuto.
Risultati principali
- Il metodo consente un'accurata profilazione dei microRNA.
- Elevata sensibilità nel rilevamento dei livelli di microRNA nei tessuti renali.
- Semplifica lo studio di varie patologie renali.
- Riduce gli errori tecnici rispetto ai metodi tradizionali.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce uno strumento prezioso per la ricerca renale.
- Migliora la comprensione delle funzioni dei microRNA nelle malattie renali.
- Studi futuri potranno sfruttare questa tecnica per applicazioni più ampie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
Un'accurata profilazione dell'espressione dei microRNA nei modelli di fibrosi renale supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione dei rischi meccanicistici nella scoperta di farmaci per le malattie renali. Questo metodo di qRT-PCR consente una quantificazione riproducibile dei miRNA associati alla malattia, fornendo una previsione affidabile per l'analisi dei percorsi metabolici e l'allineamento dei biomarcatori. Esso colma una lacuna critica nell'analisi dei tessuti renali, facilitando test ipotetici in fase iniziale e la priorizzazione del portafoglio di ricerca.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando la disregolazione dei miRNA nella fibrosi renale indotta da UUO.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro affidabile per l'isolamento e la misurazione dei miRNA da tessuto renale, riducendo la variabilità tecnica.
- Valore predittivo: Supporta la validazione funzionale dei bersagli collegando le variazioni nell'espressione dei miRNA a vie biologiche rilevanti per la malattia.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera dati quantitativi standardizzati sull'espressione di miRNA adatti all'ottimizzazione del saggio e alla preparazione per lo screening.
- Valore operativo: Offre elevata sensibilità e specificità nella rilevazione di miRNA, consentendo una valutazione affidabile degli effetti dei composti.
- Scalabilità: Utilizza un processo semplificato di estrazione e qRT-PCR compatibile con applicazioni a medio rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega i risultati ottenuti nella fase di scoperta sui miRNA alla validazione preclinica in un modello di fibrosi clinicamente rilevante.
- Allineamento del Biomarcatore: Facilita la valutazione di miRNA-3070-3p, miRNA-7218-5p e miRNA-7219-5p come potenziali biomarcatori traslazionali.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione fornendo letture molecolari riproducibili da tessuto renale malato.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'identificazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, fornendo dati di fenotipizzazione molecolare che informano le decisioni iniziali.
- Biologia della Scoperta: Consente la verifica di ipotesi sui meccanismi mediati da miRNA nella fibrosi renale attraverso un profilo preciso dell'espressione.
- Screening: Produce output quantitativi e riproducibili che supportano analisi affidabili di screening di composti e relazioni struttura-attività.
- Analisi: Fornisce valori di Ct normalizzati e misurazioni del fold-change che permettono confronti tra diverse condizioni e valutazioni statistiche.
- Ricerca Translazionale: Si allinea alla continuità preclinica utilizzando un modello UUO rilevante per la malattia per valutare le variazioni di miRNA associate alla patologia.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata per l'analisi di miRNA applicabile a diversi modelli e progetti di malattie renali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi guidati da miRNA.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità tra laboratori attraverso un flusso di lavoro ben definito e controllato per la contaminazione.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo l'eliminazione precoce dei rischi associati agli obiettivi sulla base di un fenotipaggio molecolare solido.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio fornendo dati quantitativi sui miRNA che informano la selezione e la progressione degli obiettivi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dell'RNA, nella generazione di modelli chirurgici e nell'ottimizzazione della qRT-PCR.
- Presuppone l'accesso a strumenti chirurgici, apparecchiature per l'omogeneizzazione e strumentazione per PCR in tempo reale.
- Necessita della standardizzazione dei passaggi di estrazione dell'RNA e di sintesi del cDNA tra diversi utilizzatori e sedi.
- Comporta considerazioni di adattamento nell'applicare il protocollo a diverse regioni renali o modelli di malattia.
- Include limitazioni pratiche legate alla variabilità del rendimento dell'RNA e alla necessità di replicati tecnici per garantire la robustezza dei dati.
