RNA Blot Analisi per il rilevamento e la quantificazione dei microRNA vegetali

Ehilà. Quindi questo è un piccolo protocollo RNA settentrionale. È un derivato del protocollo originariamente ottimizzato da Dr.Rashid Akbergenov.

In questo metodo, si possono rilevare piccoli RNA di lunghezza compresa tra 20 e 24 nucleotidi, in modo molto preciso e ad altissima risoluzione. Il protocollo è fondamentalmente una forma modificata di analisi tradizionale del Nord, ma qui, la percentuale di acrilammide è piuttosto alta, è del 15%. Questo nord può essere usato per rilevare l'RNA piccolo già noto, sia micro RNA che altro insieme di piccoli RNA, quando la sequenza è nota o può essere utilizzata per la conferma dell'abbondanza di piccoli RNA provenienti da set di dati di sequenziamento di nuova generazione.

Il vantaggio di questo metodo è che, non si può solo guardare l'abbondanza di micro RNA, ma anche l'abbondanza di precursori, ad esempio i micro RNA possono tralascio un precursore che è di circa 30 per essere lungo poche centinaia di nucleotidi, questo può anche essere rilevato contemporaneamente, insieme al micro RNA. Il protocollo è molto semplice, molto semplice, ma bisogna essere molto cauti durante l'esecuzione di alcuni passaggi critici elencati alla fine di questo protocollo. Per la preparazione di 10 mL di miscela di gel, aggiungere 4,8 grammi di urea, 3,75 mL di soluzione di acrilammide al 40% e 1 mL di TBE 10X appena preparato, pH 8,2 e mescolare delicatamente la soluzione.

Sciogliere completamente l'urea, riscaldando la miscela in un bagno d'acqua, fino a quando la soluzione non appare chiara. Impostare il volume a 10 mL, utilizzando acqua MilliQ sterile e raffreddare il mix di gel a temperatura ambiente. Lavare l'apparecchio richiesto con detergente, strofinare delicatamente per rimuovere il TBE residuo e l'acrilammide.

Risciacquarli ulteriormente con acqua MilliQ e lasciare asciugare. Assemblare la piastra di vetro insieme, assicurarsi che entrambi siano allo stesso livello. Posizionarli saldamente sulla spugna.

Aggiungere 8 micro litri di TEMED e 80 micro litri di APS appena preparato al 10% al mix di gel. Mescolare delicatamente e versare il mix di gel sulle piastre assemblate. Assicurarsi che il gel non perda.

Posizionare il pettine con attenzione. Lasciare polimerizzare il gel per circa 45 minuti. Dopo la polimerizzazione del gel, rimuovere le lastre di vetro dall'assemblaggio.

Lavare le lastre di vetro con acqua MilliQ. E mettili nella cassetta di corsa. Posizionare la cassetta di corsa all'interno del serbatoio.

Versare 1X TBE preparato al momento, pH 8.2. Rimuovere attentamente il pettine. Lavare accuratamente i pozzi del gel tubazione il tampone.

Questo passaggio rimuove i precipitati di urea dal pozzo e facilita l'RNA a correre uniformemente attraverso il gel. Chiudere il coperchio dell'apparecchio e pre-eseguire il gel vuoto a 80 volt per 30 minuti, per verificare la presenza di eventuali perdite tampone. Per la preparazione del colorante di carico da 10 mL, pesare 5 mg di blu bromofenolo, 5 mg di cianolo di xilene e aggiungere 10 mL di formamide deioinizzata e mescolarli bene.

Aliquota il colorante e conservare a 4 gradi per un ulteriore utilizzo. Aliquota 10 microgrammi di RNA totale in tubi sterili da 1,5 ml. Assicurarsi che la qualità dell'RNA, cioè

il rapporto 260:230 è maggiore o più vicino a due. Posizionare il tubo all'interno di un speedVac e asciugare a vuoto i campioni. Sospendere di nuovo i campioni di RNA essiccati in 8 micro litri di colorante di carico.

Riscaldare i campioni a 98 gradi per due minuti. Raffreddarli per un minuto a temperatura ambiente. Vortice i campioni di RNA raffreddati per garantire una corretta riaspensione nel colorante di carico.

Gira i tubi. Ripetere i passaggi di riscaldamento, raffreddamento e vortice per tre volte per ottenere RNA a flusso libero. Interrompere la pre-corsa del gel.

Lavare accuratamente i pozzi, prima di caricare il campione, per rimuovere i depositi dell'urea all'interno dei pozzi. Riscaldare i campioni di RNA ri-sospesi a 98 gradi per un minuto. Caricare i campioni a caldo nei pozzi utilizzando punte capillari.

Evitare di introdurre bolle d'aria. Caricamento completo di tutti i campioni e assemblare il coperchio. Eseguire il gel a 80 volt per tre ore o fino a quando il blu bromofenolo non scorre completamente.

Utilizzare una membrana in nylon caricata positivamente per il trasferimento. Tagliarlo alle dimensioni della piastra di vetro. Etichetta la membrana nell'angolo in alto a destra.

Posizionare delicatamente la membrana sulla superficie dell'acqua MilliQ sterile assicurarsi di posizionare il lato dell'etichetta verso il basso, rivolto verso la superficie dell'acqua. Prendi un vassoio pulito e prepara un sandwich di gel per il trasferimento elettro. Posizionare il lato grigio della cassetta verso il basso.

Versare 1X TBE leggermente sopra il livello della cassetta. Pre-bagnare il cuscinetto in fibra in 1X TBE e spremerlo per rimuovere le bolle d'aria. Tagliare due pezzi di carta assorbente alle dimensioni del cuscinetto in fibra.

Pre-bagnare un pezzo di carta assorbente in 1X TBE e posizionarlo sul pad in fibra. Rimuovere le bolle d'aria facendo rotolare una pipetta di plastica sulla carta. Pre-bagnare un altro pezzo di carta assorbente in 1X TBE e posarlo sulla cassetta.

Rotolare per rimuovere le bolle d'aria. Ora la configurazione sandwich è pronta per il trasferimento elettro. Dopo aver completato l'elettroforesi, interrompere la corsa e rimuovere il coperchio dall'apparecchio.

Rimuovere la cassetta in esecuzione dalla configurazione. Eserti le lastre di vetro dalla cassetta da corsa. Rimuovere con cura il gel dall'assieme.

Appoggialo sulla carta assorbente in modo che il primo campione di RNA caricato sia verso la tua destra. Immergere delicatamente la membrana pre-imbevuta in 1X TBE e posizionarla sul gel, rivolto verso il basso sul lato etichettato. Non lasciare asciugare la membrana e il gel.

Rotolare delicatamente per rimuovere la bolla d'aria. Immergere un pezzo di carta assorbente in 1X TBE e posarlo sulla membrana. Rimuovere le bolle d'aria.

Posizionare un altro pezzo di carta assorbente e rimuovere le bolle d'aria. Completare il sandwich posando il cuscinetto in fibra sopra l'assemblaggio. Chiudere saldamente la cassetta.

Posizionare la cassetta trans-macchia nel modulo. Riempire il serbatoio con 1X TBE, pH 8.2, fino al segno di soffiatura. Chiudere il coperchio dell'apparecchio e trasferirlo a 10 volt durante la notte a 4 gradi o in una stanza fredda.

Mantenere pronto il cross linker UV e impostarlo su 1200, poco prima del completamento del trasferimento elettro. Dopo il completamento del trasferimento, rimuovere la cassetta dal modulo. Posizionare la membrana umida su un foglio A4, posizionando il lato contrassegnato verso l'alto.

Collegare l'RNA alla membrana per irradiazione con luce UV di 254 nanometri a joule da 120 milli. La macchia cross-linked può essere conservata a quattro gradi o utilizzata per l'ibridazione. Progetta una sonda completamente gratuita per il piccolo RNA che deve essere rilevato.

Terminare etichettare la sonda alla sua estremità primaria a cinque utilizzando l'enzima PNK e combinare i componenti come mostrato. Incubare la miscela di reazione a 37 gradi per 30 minuti. Dopo 30 minuti di incubazione utilizzare colonne G-25 per separare le sonde non etichettate dalla miscela di reazione.

Per una migliore etichettatura della sonda, preparare la colonna G-25 prima dell'uso. Posizionare la macchia, lato RNA rivolto verso l'alto, all'interno di una bottiglia di ibridazione. Mescolare vigorosamente il buffer di ibridazione prima dell'uso.

Aggiungere 10 ml di tampone di ibridazione all'interno e posizionare il flacone di ibridazione all'interno del forno di ibridazione, mantenere a 35 gradi con rotazione. Eseguire la pre-ibridazione per 20-30 minuti. Dopo la pre-ibridazione rimuovere la bottiglia dal forno.

Aggiungere delicatamente la sonda etichettata nel buffer di ibridazione. Assicurarsi che le bolle d'aria non siano create. Incubare la macchia all'interno del forno a 35 gradi con rotazione per 12 ore.

Dopo l'ibridazione, rimuovere il buffer di ibridazione dal flacone. Eseguire un lavaggio rapido delle macchie, utilizzando tampone di lavaggio-I. Questo passaggio viene eseguito per rimuovere la soluzione di ibridazione in eccesso dalle macchie.

Incubare ulteriormente le macchie a 35 gradi per 30 minuti utilizzando tampone di lavaggio-I. Eseguire un altro lavaggio utilizzando buffer-II a 35 gradi per 30 minuti. Dopo il lavaggio della macchia, posizionarla all'interno di un coperchio di ibridazione, rimuovere il tampone in eccesso e sigillare.

Posizionarlo all'interno di una cassetta ed esporlo a uno schermo fosfo-imager privo di radiazioni per 12 ore. Rilevare il segnale di ibridazione utilizzando l'imager biomolecolare tifone e analizzare i risultati utilizzando il software ImageJ. Per l'ibridazione della macchia con altre sonde, eseguire passaggi di stripping come illustrato.

Con questa tecnica si può stimare l'abbondanza di micro RNA, così come la sua lunghezza. Da questa immagine, l'espressione del micro RNA 397 può essere rilevata in tutti i campioni. In questa macchia, l'abbondanza del campione uno è di circa 5 letture per milione, come da dati di sequenziamento di prossima generazione, suggerendo che la nostra tecnica può rilevare anche microRNA meno abbondanti.

Inoltre, utilizzando il software di quantificazione ImageJ, è possibile quantificare l'espressione di micro 397 tra i campioni. Qui abbiamo usato U6 e micro RNA 168 come controlli di carico. Mi riferisco ad alcuni passaggi cruciali che devono essere presi in considerazione durante l'esecuzione dell'esperimento.

Assicurarsi di utilizzare RNA di buona qualità per la preparazione del campione. Durante l'essiccazione sottovuoto dei campioni, evitare di asciugarli emparli es. La sospensione dell'RNA nel colorante di carico è fondamentale.

Assicurarsi di preparare un campione a flusso libero. Prestare attenzione durante il caricamento del gel. I pozzi del gel devono essere lavati e il campione deve essere caricato in linea retta all'interno dei pozzi.

Durante il trasferimento elettro, la diffusione della membrana in acqua, poco prima di immergerla in 1X TBE è essenziale, migliora il trasferimento. L'ibridazione della macchia deve essere eseguita a 35 gradi. Mantenere la temperatura del forno di ibridazione.

Per l'uso ripetuto delle macchie, le membrane devono essere conservate a 4 gradi. Dovrebbero essere mantenuti umidi in 2X SSE. A differenza di altri metodi basati su PCR, questo metodo garantisce la quantificazione dell'espressione, nonché la determinazione delle dimensioni dei microRNA.