Name: RNA Blot Analisi per il rilevamento e la quantificazione dei microRNA vegetali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 41 s
Description: Scopri la tecnica di ibridazione Northern modificata per rilevare e quantificare microRNA vegetali con alta precisione. Questo metodo utilizza gel di acrilammide al 15% per migliorare la risoluzione dei piccoli RNA di 20-24 nucleotidi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori riconoscono l'accesso al laboratorio di radiazioni fornito dall'istituto ospitante e BRIT per il radioisotopo. Il laboratorio PVS è supportato dal National Center for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research and grants (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Svizzera/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) del Dipartimento di Biotecnologia, Governo dell'India. MP riconosce DBT-Research Associateship, DBT, Government of India.

1. Preparazione di un gel di poliacrilammide denatura 15%
<ol><li>Pesare e aggiungere 4,8 g di urea, aggiungere 3,75 mL del 40% di acrilammide: soluzione bisacrilamide (19:1) e 1 mL di 10x TBE pH 8.2 in un tubo sterile da 50 mL.</li>
	<li>Sciogliere l'urea con un bagno d'acqua impostato a 60 gradi centigradi in una soluzione chiara.</li>
	<li>Make-up il volume a 10 mL utilizzando acqua sterile appena autoclaved e raffreddare il mix di gel a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare una soluzione fresca per solifati di ammonio al 10%.</li>
</ol>2. Assemblaggio delle lastre di vetro e dell'unità di elettroforesi
<ol><li>Lavare tutto l'apparato necessario per l'elettroforesi gel e l'elettro-blotting con detergente. Strofinare delicatamente con una spugna morbida per rimuovere il tampone residuo e acrilammide, risciacquare con acqua e lasciarli asciugare.</li>
	<li>Assemblare entrambi i piatti di vetro insieme e metterli saldamente sulla spugna. Utilizzare una piastra spessa 1 mm per questa configurazione. Assicurarsi che le piastre siano allo stesso livello per evitare perdite.</li>
	<li>Per la miscela di gel da 10 mL, aggiungere 8 L di TEMED e 80 ll di soluzione persultante di ammonio appena preparata 10% (w/v).</li>
	<li>Senza indugio, mescolare delicatamente e versare questo tra le lastre di vetro assemblate. Mettere il pettine con attenzione. Evitare di generare bolle d'aria in questo passaggio.</li>
	<li>Lasciare il gel a polimerizzare per circa 45 min.</li>
	<li>Lavare il gel polimerizzato con acqua sterile prima di essere posizionato all'interno della configurazione del gel.</li>
	<li>Assemblare le piastre all'interno della cassetta in esecuzione e rimuovere delicatamente il pettine.</li>
	<li>Versare sterile appena preparato 1x TBE, pH 8.2 nel serbatoio.</li>
	<li>Lavare i pozzi con attenzione pipetting il tampone per rimuovere i cristalli di sale. Questo passaggio aiuta il campione di RNA a funzionare uniformemente attraverso il gel.</li>
	<li>Eseguire una pre-esecuzione a 80 V per 30 min.</li>
</ol>3. Preparazione del tinrito e dei campioni di carico
<ol><li>Per 10 mL di gel carico colorante, pesare 5 mg di bromofenolo blu, 5 mg di xilene cyanol, aggiungere 10 mL di formamide di deionizzato con attenzione e mescolare bene.</li>
	<li>Aliquota di 10 g di RNA totale in un tubo sterile da 1,5 mL e asciugare i campioni con un speedvac. Non asciugare eccessivamente i campioni.</li>
	<li>Risospendere i campioni di RNA in 8: l'ora di carico.</li>
	<li>Riscaldare i campioni a 98 gradi centigradi per 2 min, raffreddare per 1 min a RT, vortice e girare i campioni, per 3 volte. Questo passaggio è essenziale per una corretta sospensione e a sua volta questo aiuta nel caricamento uguale dei campioni.</li>
</ol>4. Elettroforesi gel
<ol><li>Interrompere la pre-esecuzione e lavare i pozze prima del caricamento del campione.</li>
	<li>Riscaldare i campioni a 98 gradi centigradi per 1 min e caricare i campioni caldi nel pozzo utilizzando punte capillari. Inserire la punta sul fondo del pozzo, in modo che il campione occupi uno strato sottile nel pozzo.</li>
	<li>Caricamento completo di tutti i campioni. Includere per caricare l'RNA marcatore decennale.</li>
	<li>Eseguire il gel a 80 V fino a quando il colorante blu bromofenolo corre quasi completamente. Il blu bromofenolo corre a 10 bp in un gel di acrilammide denatura del 15%.</li>
</ol>5. Preparazione per l'elettrosbilazione
<ol><li>Tagliare la membrana di nylon alle dimensioni della piastra di vetro ed etichettare la membrana nell'angolo in alto a destra con una matita HB.</li>
	<li>Posizionare delicatamente la membrana sulla superficie dell'acqua sterile, rivolto verso il lato etichettato verso la superficie dell'acqua. Pre-immergere la membrana per 15 min.</li>
	<li>Tagliare 4 pezzi di carta assorbente I alle dimensioni del pad in fibra.</li>
	<li>Preparare il sandwich gel per posizionare il lato grigio della cassetta in un vassoio pulito.</li>
	<li>Pre-bagnato il cuscinetto in fibra e posizionarlo sopra la cassetta. Rimuovere le bolle d'aria.</li>
	<li>Pre-bagnato un pezzo di carta assorbente in 1x TBE e posizionare sopra il pad in fibra. Rimuovere le bolle d'aria facendo rotolare una pipetta di plastica sulla carta. Posare un altro pezzo di carta da urlo pre-bagnato e rimuovere le bolle d'aria.</li>
	<li>Rimuovere con attenzione il gel dalla cassetta in esecuzione e posizionarlo sopra l'impostazione del sandwich, in modo che il primo campione di RNA caricato sia verso destra.</li>
	<li>Immergere delicatamente la membrana preimbente in 1x TBE e posizionarla sopra il gel, rivolto verso il basso. Stendere per rimuovere le bolle d'aria.</li>
	<li>Immergere un pezzo di carta assorbente, posarlo sulla membrana e rimuovere le bolle d'aria. Immergere un altro pezzo di carta assorbendo, posizionarlo sopra il setup sandwich e rimuovere le bolle d'aria.</li>
	<li>Completare il panino posizionando un pad in fibra pre-bagnato sopra l'installazione e chiudere saldamente la cassetta.</li>
	<li>Posizionare la cassetta transblot nel modulo e riempire 1x TBE, pH 8.2 fino al segno di gonfiore.</li>
	<li>Trasferire a 10 V, peruna notte a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Dopo il trasferimento, posizionare la membrana umida su un foglio di carta e collegare immediatamente l'RNA alla membrana mediante irradiazione con luce UV da 254 nm (120.000 "joule/cm2). La macchia incrociata potrebbe essere immagazzinata a 4 gradi centigradi per un'ulteriore ibridazione.</li>
</ol>6. Preparazione della sonda etichettata radio
<ol><li>Progettare una sonda completamente complementare al piccolo RNA che deve essere rilevato.</li>
	<li>Etichetta fine della sonda utilizzando ƳP32ATP (ottenuto da BRIT) alla sua fine di 5' combinando i componenti come da ricetta prevista nella Tabella 1.</li>
	<li>Incubare la miscela di reazione di cui sopra a 37 gradi centigradi per 30 min.</li>
	<li>Separare ƳP32ATP non etichettati dalla sonda utilizzando una colonna Sephadex G-25 in base al protocollo del produttore.</li>
</ol>7. Ibridazione della macchia
<ol><li>Posizionare la macchia collegata incrociata, lato RNA rivolto in alto all'interno di una bottiglia di ibridazione.</li>
	<li>Mescolare vigorosamente il buffer di ibridazione ultra-sensibile, aggiungerne 10 mL e incubare la macchia all'interno di un forno di ibridazione mantenuto a 35 gradi centigradi, con rotazione.</li>
	<li>Eseguire la pre-ibridazione per 20 min.</li>
	<li>Togliere delicatamente la bottiglia dal forno e aggiungere la sonda etichettata nel buffer di ibridazione.</li>
	<li>Ibridare la macchia a 35 gradi centigradi, con rotazione per 12 h.</li>
	<li>Dopo l'ibridazione trasferire attentamente la soluzione di ibridazione in tubo da 15 mL. Questa soluzione può essere conservata a 4 gradi centigradi fino al riutilizzo.</li>
	<li>Eseguire un lavaggio rapido della macchia per 2 min per rimuovere la soluzione di ibridazione in eccesso aggiungendo 2x buffer SSC più 0.5% SDS. Eliminare la soluzione.</li>
	<li>Incubare la macchia con buffer SSC 2x più 0,5% SDS per 35 gradi centigradi, con rotazione per 30 min.</li>
	<li>Lavare nuovamente la macchia con buffer SSC da 0,5 x più 0,5% SDS per 35 oC, con rotazione per 30 min.</li>
	<li>Posizionare la macchia all'interno di un coperchio di ibridazione, rimuovere il buffer in eccesso e sigillarlo.</li>
	<li>Esponilo a uno schermo di imager senza radiazioni durante la notte all'interno di una cassetta.</li>
	<li>Rilevare il segnale di ibridazione utilizzando imager biomolecolare e analizzare i risultati utilizzando un software adatto.</li>
	<li>Strisciare la macchia incubandolo a 80 gradi centigradi, con rotazione per 30 min con buffer SSC 0,5 X più 0,1% SDS e 0,1 X buffer SSC più 0,1% SDS per 30 min.</li>
</ol>

<ol><li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431, 356-363 (2004).</li>
<li>Anushree, N., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Plant+miRNA+Biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Indian+National+Science+Academy%22%5BJournal%5D)">Regulation of Plant miRNA Biogenesis.</a> Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).</li>
<li>Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+sequence+signature+is+essential+for+robust+plant+miRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , (2020).</li>
<li>Chen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((22-Nucleotide+RNAs+trigger+secondary+siRNA+biogenesis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).</li>
<li>Shivaprasad, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+superfamily+regulates+nucleotide+binding+site-leucine-rich+repeats+and+other+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs.</a> Plant Cell. 24, 859-874 (2012).</li>
<li>Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraordinary+transgressive+phenotypes+of+hybrid+tomato+are+influenced+by+epigenetics+and+small+silencing+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs.</a> The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).</li>
<li>Akbergenov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+geminivirus-derived+small+RNAs+in+different+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species.</a> Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).</li>
<li>Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR828+and+miR858+regulate+VvMYB114+to+promote+anthocyanin+and+flavonol+accumulation+in+grapes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes.</a> Journal of Experimental Botany. , (2019).</li>
<li>Li, C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Small+RNAs+by+Northern+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).</li>
<li>Swetha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+domestication-related+phenotypes+in+indica+rice+are+due+to+loss+of+miRNA-mediated+laccase+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing.</a> The Plant Cell. , (2018).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Questo metodo può essere ampiamente utilizzato per il rilevamento e la quantificazione di piccoli RNA, compresi i miRNA meno abbondanti. Il protocollo descrive principalmente i passaggi per decolorare l'RNA totale in un buffer di carico, la separazione delle dimensioni mediante elettroforesi gel, il trasferimento di RNA in una membrana, il collegamento incrociato dell'RNA sulla membrana e l'ibridazione utilizzando sonde oligo radioetichettate desiderate.
Il passo critico per qualsiasi esperime...

La recente scoperta di piccoli RNA regolatori, i microRNA, ha guidato la ricerca nella loro comprensione e del loro ruolo nelle piante e negli animali1. I precursori lunghi dei miRNA vengono elaborati in miRNA maturi da 21 a 24 nt da HYL1 e specifiche proteine simili adicer2,,3. Un miRNA da 22 nt può avviare il silenziamento a cascata generando siRNA secondari4. Gli studi hanno dimostrato il ruolo dei miRNA e dei siRNA secondari nello sviluppo, nel destino cellulare e nelle risposte allo stress5,6.
L'ibridazione settentrionale è un metodo sperimentale regolarmente impiegato per rilevare specifiche molecole di RNA. Questo metodo personalizza il suo utilizzo nel rilevamento di circa 19 -24 nt lunghi piccoli RNA da un pool di RNA totali7. In questa dimostrazione viene illustrato l'utilizzo di questa tecnica per il rilevamento e la quantificazione dei miRNA. Questo metodo utilizza l'etichettatura delle sonde utilizzando i radioisotopi; pertanto, i livelli di miRNA nel campione possono essere rilevati con una maggiore sensibilità. A differenza dei metodi basati su PCR, questo metodo garantisce la quantificazione dell'espressione e la determinazione delle dimensioni dei miRNA. In questo protocollo, mostriamo passaggi cruciali che migliorano il rilevamento di miRNA. Abbiamo modificato le fasi di blotting e ibridazione per ottenere il rilevamento del segnale ad alta risoluzione dei miRNA. Questa tecnica può essere utilizzata anche per il rilevamento di altri piccoli RNA endogeni come siRNA, RNA tasi-secondari e snoRNA.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di acrilammide-bisacrilammide al 40%</td><td>Sigma</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio (APS)</td><td>BioRad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>Carta assorbente carta assorbente</td><td>whatmann I</td><td>1001-125</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Sigma</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>Punte di caricamento capillare</td><td>BioRad</td><td>2239915</td><td></td></tr><tr><td>Deionizzato formamide</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>Blocco riscaldante</td><td>Eppendorff</td><td>5350</td><td></td></tr><tr><td>Hybond N+nylon</td><td>membrana GE</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Bottiglia di ibridazione</td><td>Sigma</td><td>Z374792-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Forno di ibridazione</td><td>Thermo Scientific</td><td>1211V79</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammina (TEMED)</td><td>Sigma</td><td>T7024-25ml</td><td></td></tr><tr><td>PhosphorImager</td><td>GE- Scanner per tifoni</td><td>29187194</td><td></td></tr><tr><td>Schermo e cassetta PhosphorImager</td><td>GE healthcare</td><td>GE28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Gilson, modelli: P20 e P10</td><td>FA10002M, FA10003M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta in plastica</td><td>Falcon</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio in gel di poliacrilammide</td><td>BioRad</td><td>1658003EDU</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 colonna</td><td>GE healthcare</td><td>27532501</td><td></td></tr><tr><td>Speed Vac concentratore</td><td>Thermo Scientific</td><td>20-548-130</td><td></td></tr><tr><td>Spinwin</td><td>Tarsons</td><td>1010</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleotide chinasi (PNK)</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio Transblot</td><td>BioRad</td><td>1703946</td><td></td></tr><tr><td>ULTRAHyb tampone di ibridazione</td><td>Ambion</td><td>AM8670</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Fischer Scientific</td><td>15985</td><td></td></tr><tr><td>UV-crosslinker</td><td>UVP</td><td>CL-1000L</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Tarsons</td><td>3020</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>NEOLAB</td><td>D-8810</td><td></td></tr><tr><td>Xilene cianolo</td><td>Sigma</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr></tbody></table>

rna blot analisi per il rilevamento e la quantificazione dei microrna vegetali

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

I microRNA (miRNA) sono una classe di RNA non codificanti endogenamente espressi, da 21 nt piccoli RNA coinvolti nella regolazione dell'espressione genica sia nelle piante che negli animali. La maggior parte dei miRNA agisce come interruttori negativi dell'espressione genica mirata ai geni chiave. Nelle piante, le trascrizioni primarie di miRNA (pri-miRNA) sono generate dalla polimerasi RNA II e formano lunghezze variabili di strutture stabili ciclo-stelo chiamate pre-miRNA. Un endonuclease, simile a Dicer1, elabora i pre-miRNA in duplex miRNA-miRNA. Uno dei filamenti del duplex miRNA-miRNA è selezionato e caricato sulla proteina Argonaute 1 o sui suoi omologhi per mediare la scissione degli mRNA bersaglio. Sebbene i miRNA siano molecole chiave di segnalazione, il loro rilevamento viene spesso effettuato con metodi non ottimali basati sulla PCR anziché con un'analisi sensibile delle macchie settentrionali. Descriviamo un metodo settentrionale semplice, affidabile ed estremamente sensibile che è ideale per la quantificazione dei livelli di miRNA con una sensibilità molto elevata, letteralmente da qualsiasi tessuto vegetale. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per confermare la dimensione, la stabilità e l'abbondanza di miRNA e dei loro precursori.

In questa dimostrazione, abbiamo rilevato e quantificato l'espressione di miR397 in diversi tessuti di indica var whiteponni (Figura 1). miR397 è un miRNA da 22 nt e miRNA conservato. L'espressione di miR397 può essere rilevata in tutti i campioni testati. Secondo i dati di sequenziamento di nuova generazione, il campione 1 (tessuto di semina) ha miR397 a 5 letture per milione (rpm). Abbiamo rilevato il suo segnale comodamente, indicando che il metodo è molto sensibile e pu...

Questo metodo dimostra l'uso della tecnica di ibridazione settentrionale per rilevare i miRNA dall'estratto totale di RNA.

RNA Blot Analisi per il rilevamento e la quantificazione dei microRNA vegetali

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Ehilà. Quindi questo è un piccolo protocollo RNA settentrionale. È un derivato del protocollo originariamente ottimizzato da Dr.Rashid Akbergenov.In questo metodo, si possono rilevare piccoli RNA di lunghezza compresa tra 20 e 24 nucleotidi, in modo molto preciso e ad altissima risoluzione. Il protocollo è fondamentalmente una forma modificata di analisi tradizionale del Nord, ma qui, la percentuale di acrilammide è piuttosto alta, è del 15%. Questo nord può essere usato per rilevare l'RNA piccolo già noto, sia micro RNA che altro insieme di piccoli RNA, quando la sequenza è nota o può essere utilizzata per la conferma dell'abbondanza di piccoli RNA provenienti da set di dati di sequenziamento di nuova generazione.Il vantaggio di questo metodo è che, non si può solo guardare l'abbondanza di micro RNA, ma anche l'abbondanza di precursori, ad esempio i micro RNA possono tralascio un precursore che è di circa 30 per essere lungo poche centinaia di nucleotidi, questo può anche essere rilevato contemporaneamente, insieme al micro RNA. Il protocollo è molto semplice, molto semplice, ma bisogna essere molto cauti durante l'esecuzione di alcuni passaggi critici elencati alla fine di questo protocollo. Per la preparazione di 10 mL di miscela di gel, aggiungere 4,8 grammi di urea, 3,75 mL di soluzione di acrilammide al 40% e 1 mL di TBE 10X appena preparato, pH 8,2 e mescolare delicatamente la soluzione.Sciogliere completamente l'urea, riscaldando la miscela in un bagno d'acqua, fino a quando la soluzione non appare chiara. Impostare il volume a 10 mL, utilizzando acqua MilliQ sterile e raffreddare il mix di gel a temperatura ambiente. Lavare l'apparecchio richiesto con detergente, strofinare delicatamente per rimuovere il TBE residuo e l'acrilammide.Risciacquarli ulteriormente con acqua MilliQ e lasciare asciugare. Assemblare la piastra di vetro insieme, assicurarsi che entrambi siano allo stesso livello. Posizionarli saldamente sulla spugna.Aggiungere 8 micro litri di TEMED e 80 micro litri di APS appena preparato al 10% al mix di gel. Mescolare delicatamente e versare il mix di gel sulle piastre assemblate. Assicurarsi che il gel non perda.Posizionare il pettine con attenzione. Lasciare polimerizzare il gel per circa 45 minuti. Dopo la polimerizzazione del gel, rimuovere le lastre di vetro dall'assemblaggio.Lavare le lastre di vetro con acqua MilliQ. E mettili nella cassetta di corsa. Posizionare la cassetta di corsa all'interno del serbatoio.Versare 1X TBE preparato al momento, pH 8.2. Rimuovere attentamente il pettine. Lavare accuratamente i pozzi del gel tubazione il tampone.Questo passaggio rimuove i precipitati di urea dal pozzo e facilita l'RNA a correre uniformemente attraverso il gel. Chiudere il coperchio dell'apparecchio e pre-eseguire il gel vuoto a 80 volt per 30 minuti, per verificare la presenza di eventuali perdite tampone. Per la preparazione del colorante di carico da 10 mL, pesare 5 mg di blu bromofenolo, 5 mg di cianolo di xilene e aggiungere 10 mL di formamide deioinizzata e mescolarli bene.Aliquota il colorante e conservare a 4 gradi per un ulteriore utilizzo. Aliquota 10 microgrammi di RNA totale in tubi sterili da 1,5 ml. Assicurarsi che la qualità dell'RNA, cioèil rapporto 260:230 è maggiore o più vicino a due. Posizionare il tubo all'interno di un speedVac e asciugare a vuoto i campioni. Sospendere di nuovo i campioni di RNA essiccati in 8 micro litri di colorante di carico.Riscaldare i campioni a 98 gradi per due minuti. Raffreddarli per un minuto a temperatura ambiente. Vortice i campioni di RNA raffreddati per garantire una corretta riaspensione nel colorante di carico.Gira i tubi. Ripetere i passaggi di riscaldamento, raffreddamento e vortice per tre volte per ottenere RNA a flusso libero. Interrompere la pre-corsa del gel.Lavare accuratamente i pozzi, prima di caricare il campione, per rimuovere i depositi dell'urea all'interno dei pozzi. Riscaldare i campioni di RNA ri-sospesi a 98 gradi per un minuto. Caricare i campioni a caldo nei pozzi utilizzando punte capillari.Evitare di introdurre bolle d'aria. Caricamento completo di tutti i campioni e assemblare il coperchio. Eseguire il gel a 80 volt per tre ore o fino a quando il blu bromofenolo non scorre completamente.Utilizzare una membrana in nylon caricata positivamente per il trasferimento. Tagliarlo alle dimensioni della piastra di vetro. Etichetta la membrana nell'angolo in alto a destra.Posizionare delicatamente la membrana sulla superficie dell'acqua MilliQ sterile assicurarsi di posizionare il lato dell'etichetta verso il basso, rivolto verso la superficie dell'acqua. Prendi un vassoio pulito e prepara un sandwich di gel per il trasferimento elettro. Posizionare il lato grigio della cassetta verso il basso.Versare 1X TBE leggermente sopra il livello della cassetta. Pre-bagnare il cuscinetto in fibra in 1X TBE e spremerlo per rimuovere le bolle d'aria. Tagliare due pezzi di carta assorbente alle dimensioni del cuscinetto in fibra.Pre-bagnare un pezzo di carta assorbente in 1X TBE e posizionarlo sul pad in fibra. Rimuovere le bolle d'aria facendo rotolare una pipetta di plastica sulla carta. Pre-bagnare un altro pezzo di carta assorbente in 1X TBE e posarlo sulla cassetta.Rotolare per rimuovere le bolle d'aria. Ora la configurazione sandwich è pronta per il trasferimento elettro. Dopo aver completato l'elettroforesi, interrompere la corsa e rimuovere il coperchio dall'apparecchio.Rimuovere la cassetta in esecuzione dalla configurazione. Eserti le lastre di vetro dalla cassetta da corsa. Rimuovere con cura il gel dall'assieme.Appoggialo sulla carta assorbente in modo che il primo campione di RNA caricato sia verso la tua destra. Immergere delicatamente la membrana pre-imbevuta in 1X TBE e posizionarla sul gel, rivolto verso il basso sul lato etichettato. Non lasciare asciugare la membrana e il gel.Rotolare delicatamente per rimuovere la bolla d'aria. Immergere un pezzo di carta assorbente in 1X TBE e posarlo sulla membrana. Rimuovere le bolle d'aria.Posizionare un altro pezzo di carta assorbente e rimuovere le bolle d'aria. Completare il sandwich posando il cuscinetto in fibra sopra l'assemblaggio. Chiudere saldamente la cassetta.Posizionare la cassetta trans-macchia nel modulo. Riempire il serbatoio con 1X TBE, pH 8.2, fino al segno di soffiatura. Chiudere il coperchio dell'apparecchio e trasferirlo a 10 volt durante la notte a 4 gradi o in una stanza fredda.Mantenere pronto il cross linker UV e impostarlo su 1200, poco prima del completamento del trasferimento elettro. Dopo il completamento del trasferimento, rimuovere la cassetta dal modulo. Posizionare la membrana umida su un foglio A4, posizionando il lato contrassegnato verso l'alto.Collegare l'RNA alla membrana per irradiazione con luce UV di 254 nanometri a joule da 120 milli. La macchia cross-linked può essere conservata a quattro gradi o utilizzata per l'ibridazione. Progetta una sonda completamente gratuita per il piccolo RNA che deve essere rilevato.Terminare etichettare la sonda alla sua estremità primaria a cinque utilizzando l'enzima PNK e combinare i componenti come mostrato. Incubare la miscela di reazione a 37 gradi per 30 minuti. Dopo 30 minuti di incubazione utilizzare colonne G-25 per separare le sonde non etichettate dalla miscela di reazione.Per una migliore etichettatura della sonda, preparare la colonna G-25 prima dell'uso. Posizionare la macchia, lato RNA rivolto verso l'alto, all'interno di una bottiglia di ibridazione. Mescolare vigorosamente il buffer di ibridazione prima dell'uso.Aggiungere 10 ml di tampone di ibridazione all'interno e posizionare il flacone di ibridazione all'interno del forno di ibridazione, mantenere a 35 gradi con rotazione. Eseguire la pre-ibridazione per 20-30 minuti. Dopo la pre-ibridazione rimuovere la bottiglia dal forno.Aggiungere delicatamente la sonda etichettata nel buffer di ibridazione. Assicurarsi che le bolle d'aria non siano create. Incubare la macchia all'interno del forno a 35 gradi con rotazione per 12 ore.Dopo l'ibridazione, rimuovere il buffer di ibridazione dal flacone. Eseguire un lavaggio rapido delle macchie, utilizzando tampone di lavaggio-I. Questo passaggio viene eseguito per rimuovere la soluzione di ibridazione in eccesso dalle macchie.Incubare ulteriormente le macchie a 35 gradi per 30 minuti utilizzando tampone di lavaggio-I. Eseguire un altro lavaggio utilizzando buffer-II a 35 gradi per 30 minuti. Dopo il lavaggio della macchia, posizionarla all'interno di un coperchio di ibridazione, rimuovere il tampone in eccesso e sigillare.Posizionarlo all'interno di una cassetta ed esporlo a uno schermo fosfo-imager privo di radiazioni per 12 ore. Rilevare il segnale di ibridazione utilizzando l'imager biomolecolare tifone e analizzare i risultati utilizzando il software ImageJ. Per l'ibridazione della macchia con altre sonde, eseguire passaggi di stripping come illustrato.Con questa tecnica si può stimare l'abbondanza di micro RNA, così come la sua lunghezza. Da questa immagine, l'espressione del micro RNA 397 può essere rilevata in tutti i campioni. In questa macchia, l'abbondanza del campione uno è di circa 5 letture per milione, come da dati di sequenziamento di prossima generazione, suggerendo che la nostra tecnica può rilevare anche microRNA meno abbondanti.Inoltre, utilizzando il software di quantificazione ImageJ, è possibile quantificare l'espressione di micro 397 tra i campioni. Qui abbiamo usato U6 e micro RNA 168 come controlli di carico. Mi riferisco ad alcuni passaggi cruciali che devono essere presi in considerazione durante l'esecuzione dell'esperimento.Assicurarsi di utilizzare RNA di buona qualità per la preparazione del campione. Durante l'essiccazione sottovuoto dei campioni, evitare di asciugarli emparli es. La sospensione dell'RNA nel colorante di carico è fondamentale.Assicurarsi di preparare un campione a flusso libero. Prestare attenzione durante il caricamento del gel. I pozzi del gel devono essere lavati e il campione deve essere caricato in linea retta all'interno dei pozzi.Durante il trasferimento elettro, la diffusione della membrana in acqua, poco prima di immergerla in 1X TBE è essenziale, migliora il trasferimento. L'ibridazione della macchia deve essere eseguita a 35 gradi. Mantenere la temperatura del forno di ibridazione.Per l'uso ripetuto delle macchie, le membrane devono essere conservate a 4 gradi. Dovrebbero essere mantenuti umidi in 2X SSE. A differenza di altri metodi basati su PCR, questo metodo garantisce la quantificazione dell'espressione, nonché la determinazione delle dimensioni dei microRNA.

rna-blot-analysis-for-detection-quantification-plant

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

In questo video, dimostriamo il northern blot, una tecnica di ibridazione per rilevare e quantificare i microRNA (miRNA) dall'RNA totale estratto dal tessuto vegetale.

Northern Blot per rilevare e quantificare microRNA specifici nell'estratto di RNA totale di tessuto vegetale

Molecular segnalazione sia attraverso gli estrogeni e microRNA sono fondamentali nello sviluppo del cancro al seno e la crescita. Estrogeni attiva i recettori degli estrogeni, che sono fattori di trascrizione. Molti fattori di trascrizione in grado di regolare l'espressione dei microRNA, e microRNA regolati dagli estrogeni possono essere profilato utilizzando diverse tecniche su larga scala.

Profiling di microRNA regolati dagli estrogeni in cellule di carcinoma mammario

Lo scopo di questa pubblicazione è quello di visualizzare e discutere le fasi operative di un protocollo Northern Blot avanzata su RNA estratto da Drosophila melanogaster embrioni, cellule e tessuti. Questo protocollo è particolarmente utile per il rilevamento efficiente delle piccole specie di RNA.

Maggiore Northern Blot rilevazione di piccoli RNA specie in Drosophila melanogaster

MicroRNA circolanti sono recentemente emersi come biomarcatori promettenti e innovativi per vari tipi di cancro e di altre malattie. L'obiettivo di questo articolo è quello di discutere di tre diverse piattaforme di PCR real-time sonda-based e metodi che sono disponibili per quantificare e determinare l'abbondanza dei microRNA circolanti.

Base-Probe Real-time PCR Approcci per la misurazione quantitativa dei microRNA

Descriviamo l'uso di una piattaforma di espressione genica multiplexata ad alto rendimento che quantifica l'espressione genica mediante codifica a barre e conteggio di molecole in substrati biologici senza la necessità di amplificazione. Abbiamo utilizzato la piattaforma per quantificare l'espressione di microRNA (miRNA) nel sangue intero in soggetti con e senza sindrome dell'intestino irritabile.

Perturbazioni di circolazione miRNA nella sindrome dell&#39;intestino irritabile rilevato utilizzando una piattaforma di espressione genica multiplex high-throughput

Questo rapporto descrive un metodo veloce e affidabile per la convalida di mRNA bersaglio di Mirna cellulari. Il metodo utilizza biotinilati sintetici basati su Locked Nucleic Acid LNA miRNA imita per catturare destinazione mRNA. Successivamente, biglie magnetiche rivestite con streptavidina sono impiegati per pulldown il bersaglio mRNA per quantificazione da reazione a catena della polimerasi qPCR.

Biotina-based Pulldown Assay Validate mRNA Mirna obiettivi del cellulare

Una pipeline bioinformatica, vale a dire miRDeep-P2 (miRDP2 in breve), con criteri di miRNA vegetale aggiornati e un algoritmo revisionato, potrebbe analizzare in modo accurato ed efficiente i trascrittimi di microRNA nelle piante, in particolare per le specie con genomi complessi e di grandi dimensioni.

Una pipeline di bioinformatica per analizzare in modo accurato ed efficiente i trascrittomi di microRNA nelle piante

In questo articolo viene descritta una strategia dettagliata per l'isolamento di piccoli RNA, l'arricchimento dei microRNA e la preparazione di campioni per il sequenziamento ad alto valore di velocità effettiva. Viene quindi descritto come elaborare le letture di sequenza e allinearle ai microRNA, utilizzando strumenti open source.

Una pipeline completa per l'isolamento e la sequenza dei microRNA e la loro analisi tramite gli strumenti open source

Il saggio di immunoprecipitazione dell'RNA metilato è un metodo a base di anticorpi utilizzato per arricchire i frammenti di RNA metilati. Accoppiato con il sequenziamento profondo, porta all'identificazione di trascrizioni che trasportano la modifica m5C.

Test di immunoprecipitazione dell'RNA metilato per studiare m5C Modifica in Arabidopsis

Qui, presentiamo una nuova pipeline di miRNA completamente automatizzata, mirMachine che 1) può identificare i miRNA noti e nuovi in modo più accurato e 2) è completamente automatizzata e liberamente disponibile. Gli utenti possono ora eseguire un breve script di invio per eseguire la pipeline mirMachine completamente automatizzata.

mirMachine: uno sportello unico per l'annotazione dei miRNA vegetali

Il protocollo descrive un test di ibridazione in immunofluorescenza tandem con tessuto incluso in paraffina fissato in formalina per rilevare e quantificare contemporaneamente microRNA e proteine multiplexate.

Amplificazione e riconoscimento dei microRNA attraverso l'ibridazione in situ dell'acido nucleico bloccato come nuovo metodo di rilevamento e quantificazione

Scopri la tecnica di ibridazione Northern modificata per rilevare e quantificare microRNA vegetali con alta precisione. Questo metodo utilizza gel di acrilammide al 15% per migliorare la risoluzione dei piccoli RNA di 20-24 nucleotidi.

RNA Blot Analisi per il rilevamento e la quantificazione dei microRNA vegetali

Esplora altri video