Name: Meningitidis di Neisseria Infezione di cellule endoteliali cerebrali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Scopri come utilizzare cellule endoteliali cerebrali derivate da iPSC per studiare le interazioni ospite-patogeno con Neisseria meningitidis. Questo modello umano migliora la comprensione delle infezioni del sistema nervoso centrale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

L.M.E. è supportato dal programma di formazione alla ricerca DFG GRK2157 dal titolo "3D Tissue Models for Studying Microbial Infections by Human Pathogens" assegnato ad A.S-U. B.J.K. è sostenuto da una borsa di studio post-dottorato della Fondazione Alexander von Humboldt. Inoltre, ringraziamo Lena Wolter per la sua assistenza tecnica nella generazione delle iPSC-BEC in cultura.

<ol><li>Rua, R., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Meningeal+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Advances in Meningeal Immunity.</a> Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).</li>
<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li>
<li>Rouphael, N. G., Stephens, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis%3A+Biology%2C+microbiology%2C+and+epidemiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis: Biology, microbiology, and epidemiology.</a> Methods in Molecular Biology. , (2012).</li>
<li>Stephens, D. S., Greenwood, B., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemic+meningitis%2C+meningococcaemia%2C+and+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Epidemic meningitis, meningococcaemia, and Neisseria meningitidis.</a> Lancet. 369 (9580), 2196-2210 (2007).</li>
<li>Le Guennec, L., Coureuil, M., Nassif, X., Bourdoulous, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+used+by+bacterial+pathogens+to+cross+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Strategies used by bacterial pathogens to cross the blood-brain barrier.</a> Cellular Microbiology. , (2020).</li>
<li>Doran, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions+in+bacterial+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions in bacterial meningitis.</a> Acta Neuropathologica. 131 (2), 185-209 (2016).</li>
<li>Cunha, C. S. E., Griffiths, N. J., Virji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+opc+invasin+binds+to+the+sulphated+tyrosines+of+activated+vitronectin+to+attach+to+and+invade+human+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis opc invasin binds to the sulphated tyrosines of activated vitronectin to attach to and invade human brain endothelial cells.</a> PLoS Pathogens. , (2010).</li>
<li>Coureuil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningococcus+hijacks+a+%CE%B22-adrenoceptor%2F%CE%B2-arrestin+pathway+to+cross+brain+microvasculature+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meningococcus hijacks a β2-adrenoceptor/β-arrestin pathway to cross brain microvasculature endothelium.</a> Cell. 143 (7), 1149-1160 (2010).</li>
<li>Bernard, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+Neisseria+meningitidis+utilizes+CD147+for+vascular+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pathogenic Neisseria meningitidis utilizes CD147 for vascular colonization.</a> Nature Medicine. 20 (7), 725-731 (2014).</li>
<li>Slanina, H., Hebling, S., Hauck, C. R., Schubert-Unkmeir, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+invasion+by+neisseria+meningitidis+requires+a+functional+interplay+between+the+focal+adhesion+kinase%2C+Src+and+cortactin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cell invasion by neisseria meningitidis requires a functional interplay between the focal adhesion kinase, Src and cortactin.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li>
<li>Unkmeir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+mediates+Opc-dependent+internalization+of+Neisseria+meningitidis+in+human+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin mediates Opc-dependent internalization of Neisseria meningitidis in human brain microvascular endothelial cells.</a> Molecular Microbiology. 46 (4), 933-946 (2002).</li>
<li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%3A+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2015).</li>
<li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Derivation of Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).</li>
<li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retinoic+acid-enhanced%2C+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160(2014).</li>
<li>Hollmann, E. K., Bailey, A. K., Potharazu, A. V., Neely, M. D., Bowman, A. B., Lippmann, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Fluids and Barriers of the CNS. , (2017).</li>
<li>Kim, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Group+B+Streptococcus+and+Blood-Brain+Barrier+Interaction+by+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Brain+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells.</a> mSphere. , (2017).</li>
<li>Kim, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+agalactiae+disrupts+P-glycoprotein+function+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Streptococcus agalactiae disrupts P-glycoprotein function in brain endothelial cells.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 26(2019).</li>
<li>Kim, B. J., Shusta, E. V., Doran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past+and+Current+Perspectives+in+Modeling+Bacteria+and+Blood%E2%80%93Brain+Barrier+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Past and Current Perspectives in Modeling Bacteria and Blood–Brain Barrier Interactions.</a> Frontiers in Microbiology. , (2019).</li>
<li>Martins Gomes, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Brain+Endothelial+Cells+as+a+Cellular+Model+to+Study+Neisseria+meningitidis+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection.</a> Frontiers in Microbiology. , (2019).</li>
<li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Psychomotor+Retardation+using+iPSCs+from+MCT8-Deficient+Patients+Indicates+a+Prominent+Role+for+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Psychomotor Retardation using iPSCs from MCT8-Deficient Patients Indicates a Prominent Role for the Blood-Brain Barrier.</a> Cell Stem Cell. , (2016).</li>
<li>Lim, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+Disease+iPSC-Derived+Brain+Microvascular+Endothelial+Cells+Reveal+WNT-Mediated+Angiogenic+and+Blood-Brain+Barrier+Deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits.</a> Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).</li>
<li>Stebbins, M. J., Wilson, H. K., Canfield, S. G., Qian, T., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+characterization+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells.</a> Methods. 101, 93-102 (2016).</li>
<li>Neal, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Fully+Defined+Differentiation+Scheme+for+Producing+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cells+from+Human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).</li>
<li>Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+effects+of+cell+seeding+density+on+the+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells.</a> Fluids and Barriers of the CNS. , (2015).</li>
<li>Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+brain+endothelial+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+is+enhanced+by+rho-associated+coiled+coil-containing+kinase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+-+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of brain endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells is enhanced by rho-associated coiled coil-containing kinase inhibition.</a> Tissue Engineering - Part C: Methods. , (2016).</li>
<li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Science Advances. , (2017).</li>
<li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-Derived+Endothelial+Cells+and+Microengineered+Organ-Chip+Enhance+Neuronal+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-Derived Endothelial Cells and Microengineered Organ-Chip Enhance Neuronal Development.</a> Stem Cell Reports. , (2018).</li>
<li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells%2C+astrocytes%2C+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. , (2017).</li>
<li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Rho-associated+protein+kinase+%28ROCK%29+inhibitor+to+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. , (2012).</li>
<li>Schubert-Unkmeir, A., Sokolova, O., Panzner, U., Eigenthaler, M., Frosch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+pattern+in+human+brain+endothelial+cells+in+response+to+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Gene expression pattern in human brain endothelial cells in response to Neisseria meningitidis.</a> Infection and Immunity. 75 (2), 899-914 (2007).</li>
<li>Sokolova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Neisseria+meningitidis+with+human+brain+microvascular+endothelial+cells%3A+Role+of+MAP-+and+tyrosine+kinases+in+invasion+and+inflammatory+cytokine+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interaction of Neisseria meningitidis with human brain microvascular endothelial cells: Role of MAP- and tyrosine kinases in invasion and inflammatory cytokine release.</a> Cellular Microbiology. 6 (12), 1153-1166 (2004).</li>
<li>Alimonti, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+crosses+an+in+vitro+human+blood+brain+barrier+model%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Zika virus crosses an in vitro human blood brain barrier model.</a> Fluids and Barriers of the CNS. , (2018).</li>
<li>Kim, B. J., Schubert-unkmeir, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Models+for+Studying+the+Interaction+of+Neisseria+meningitidis+with+Human+Brain+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neisseria+meningitidis%3A+Methods+and+Protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro Models for Studying the Interaction of Neisseria meningitidis with Human Brain Endothelial Cells.</a> Neisseria meningitidis: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1969, 135-148 (2019).</li>
<li>Kim, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+induction+of+Snail1+contributes+to+blood-brain+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Bacterial induction of Snail1 contributes to blood-brain barrier disruption.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2473-2483 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La modellazione dei BEC e della BBB ha avuto delle sfide, poiché i BEC umani primari e immortalizzati, in vitro, tendono a mancare di fenotipi di barriera robusti. L'avvento delle tecnologie delle cellule staminali umane ha permesso la generazione di cellule BEC derivate da iPSC che mantengono i fenotipi tipici della BBB come i marcatori endoteliali, l'espressione della giunzione stretta, le proprietà di barriera, la risposta ad altri tipi di cellule del SNC e i trasportatori funzionali dell'efflusso 12,13,14,15...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61400">Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae</a>. The Authors section was updated from:
Leo M. Endres1 
Alexandra Schubert-Unkmeir1 
Brandon J. Kim1,2 
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of W&#252;rzburg 
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
to:
Leo M. Endres1 
Sarah F. Hathcock2 
Alexandra Schubert-Unkmeir1 
Brandon J. Kim1,2 
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of W&#252;rzburg 
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61400">Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

La barriera emato-encefalica (BBB) e la barriera meningea sangue-liquido cerebrospinale (mBCSFB) sono barriere cellulari estremamente strette che separano la circolazione dal sistema nervoso centrale (SNC) e sono costituite principalmente da cellule endoteliali cerebrali (BEC) altamente specializzate1,2. Insieme, i BEC mantengono una corretta omeostasi cerebrale regolando i nutrienti e i prodotti di scarto dentro e fuori il cervello, escludendo molte tossine, farmaci e agenti patogeni 1,2. La meningite batterica si verifica quando i batteri trasmissibili per via ematica sono in grado di interagire e penetrare la barriera formata dai BEC e causare infiammazione. Neisseria meningitidis (Nm, meningococco) è un batterio Gram-negativo che colonizza il rinofaringe del 10-40% degli individui sani, ma in alcuni casi può causare gravi malattie sistemiche3. Negli individui affetti, Nm può ottenere l'accesso al flusso sanguigno dove può causare porpora fulminante e penetrare i BEC ottenendo l'accesso al SNC causando la meningite3. La NM è una delle principali cause di meningite batterica in tutto il mondo e, nonostante gli sforzi di vaccinazione, è ancora una delle cause primarie di meningite4. L'intervento medico moderno, come il trattamento antibiotico, ha reso queste condizioni sopravvissute, tuttavia le persone colpite da meningite spesso rimangono con danni neurologici permanenti 5,6.
Studi precedenti hanno identificato i fattori batterici e la segnalazione dell'ospite che contribuiscono alle interazioni Nm-BEC 7,8,9,10,11. Le adesine e le invasine identificate, come la proteina di opacità Opc e i pili di tipo IV, così come i recettori come CD147, sono stati condotti su vari modelli BEC in vitro, tuttavia questi modelli mancano di molte proprietà di definizione della BBB 7,9,11,12. La comprensione completa delle interazioni Nm-BEC rimane elusiva a causa in parte dell'incapacità di utilizzare modelli in vivo, della protezione vaccinale incompleta e della mancanza di robusti modelli BEC umani in vitro.
La modellazione degli hBEC in vitro è stata impegnativa a causa delle proprietà uniche dei BEC. Rispetto alle cellule endoteliali periferiche, le BEC hanno una serie di fenotipi che migliorano le loro proprietà di barriera, come l'elevata resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER) dovuta a complesse giunzioni strette12. Una volta rimossi dal microambiente cerebrale, i BEC perdono rapidamente le loro proprietà di barriera, limitando l'utilità di modelli primari o immortalizzati in vitro che formano solo una debole barriera12,13. La combinazione della specificità umana delle infezioni da NM, la mancanza di robusti modelli in vivo e le sfide che modellano i BEC umani in vitro crea la necessità di modelli migliori per comprendere la complessa interazione ospite-patogeno tra Nm e BAC. Recentemente, utilizzando tecnologie di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) modello, le cellule simili a BEC sono state derivate da iPSC che imitano meglio le BEC in vivo12,13,14,15. Le iPSC-BEC sono di origine umana, facilmente scalabili e possiedono i fenotipi BEC attesi rispetto alle loro controparti primarie o immortalizzate12,13,14,15. Inoltre, noi e altri abbiamo dimostrato che le iPSC-BEC sono utili per modellare varie malattie del SNC come l'interazione ospite-patogeno, la malattia di Huntington e il deficit di MCT8 che causa la sindromedi Allan-Hurndon-Dudley 16,17,18,19,20,21 . Qui, dimostriamo come derivare le iPSC-BEC da fonti rinnovabili di iPSC e l'infezione delle iPSC-BEC con Nm che porta all'attivazione della risposta immunitaria innata. Riteniamo che questo modello sia utile per interrogare l'interazione ospite-patogeno che non può essere ricapitolata in altri modelli in vitro ed è particolarmente utile quando si esaminano le interazioni con patogeni specifici per l'uomo come il Nm.

<table><tbody><tr><td>Accutase (1x)</td><td>Sigma</td><td>A6964</td><td>Reagente di dissociazione cellulare enzimatica</td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Acido retinoico all-trans (RA)</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31 (PECAM-1)</td><td>Thermo Scientific (Labvision)</td><td>RB-10333</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Claudin-5</td><td>Invitrogen</td><td>4C3C2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Glut-1</td><td>Thermo Scientific (Labvision)</td><td>SPM498 (MA5-11315)</td><td></td></tr><tr><td>Anti-occludina</td><td>Invitrogen</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VE-caderina</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-52751</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>33-9100</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Proteose Peptone</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoetanolo</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>Piastre e matracci per colture cellulari</td><td>Centrifuga Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Heraeus Megafuge 1.0R)</td><td>Cabina</td> di biosicurezza Thermo Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>Classe II</td><td>Incubatore a CO2 Nuaire</td><td>NU-437-400E</td><td></td></tr><tr><td>(Incubatore a CO2 con camicia d'aria DHD Autoflow)</td><td>Nuaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Columbia ager + 5 % sangue di pecora</td><td>Biomerieux</td><td>43049</td><td></td></tr><tr><td>Filtri in poliestere Costar Transwell (12 o 24 pozzetti)</td><td>Corning</td><td>3460, 3470</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosio</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ROTH</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore epiteliale di volt-ohm (Millicell ERS-2) con elettrodo STX</td><td>Merck (Millipore)</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NO3)3</td><td>ROTH</td><td>5632.1</td><td></td></tr> Microscopio a fluorescenza per <tr><td>fibronectina</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>(Eclipse Ti)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer (Neubauer)</td><td>A. Hartenstein</td><td>ZK06</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti basici umani (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Terreno libero da siero endoteliale umano (hESFM)</td><td>Gibco</td><td>11111-044</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito (Wilovert)</td><td>Hund (Will Wetzlar)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iPS(IMR90)-4 cellule</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Per preparare 110 ml di integratore Kellogg's, preparare 100 ml di 4 g/ml di glucosio, 0,1 g/ml di glutammina e 0,2 mg/ml di tiamina pirofosfato e 10 ml di 5 mg/ml di Fe(NO3)3 e combinare le soluzioni. Filtrare, sterilizzare e conservare aliquotato a -20 °C.</td></tr><tr><td>Sostituzione del siero knockout (KOSR)</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina (GlutaMAX)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>LunaScript RT SuperMix Kit</td><td>NEB</td><td>E3010L</td><td>kit di sintesi di cDNA</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Matrix Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>ROTH</td><td>4627,5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ROTH</td><td>KK36.1</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette (Research Plus)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>ROTH</td><td>6329</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento dell'RNA NucleoSpin</td> Kit di <td>isolamento dell'RNA</td><td>740955</td> di <td>Machery-Nagel</td></tr><tr><td>Pipette boy (Accu-Jet Pro)</td><td>Marchio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero plasmaderivato povero di piastrine, bovino (PDS)</td><td>Fisher</td><td>50-443-029</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25742</td><td>qPCR master mix</td></tr><tr><td>qPCR film qPCR (MicroAmp Optical Adhesive Film)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4211971</td><td></td></tr><tr><td>piastre qPCR (MicroAmp Fast 96-well)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore ROCK, Y27632 dicloridrato</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR termociclatore (StepOnePlus)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StemFlex terreno basale + 50x integratore StemFlex</td><td>Gibco</td><td>A3349401</td><td>Terreno di mantenimento delle cellule staminali</td></tr><tr><td>Rotore a secchiello oscillante (Heraeus #2704)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiamina pirofosfato</td><td>Sigma</td><td>C8754-5G</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di blu di tripano, 0,4%</td> <td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-033</td><td>Reagente di dissociazione cellulare non enzimatica (EDTA)</td></tr></tbody></table>

meningitidis di neisseria infezione di cellule endoteliali cerebrali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte

Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

La meningite meningococcica è un'infezione pericolosa per la vita che si verifica quando Neisseria meningitidis (meningococco , Nm) può accedere al sistema nervoso centrale (SNC) penetrando nelle cellule endoteliali cerebrali (BEC) altamente specializzate. Poiché Nm è un patogeno specifico per l'uomo, la mancanza di solidi sistemi modello in vivo rende difficile lo studio delle interazioni ospite-patogeno tra Nm e BEC e stabilisce la necessità di un modello basato sull'uomo che imiti i BEC nativi. I BEC possiedono proprietà di barriera più strette rispetto alle cellule endoteliali periferiche caratterizzate da complesse giunzioni strette e da un'elevata resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER). Tuttavia, molti modelli in vitro , come i BEC primari e i BEC immortalizzati, mancano o perdono rapidamente le loro proprietà di barriera dopo la rimozione dal microambiente neurale nativo. I recenti progressi nelle tecnologie delle cellule staminali umane hanno sviluppato metodi per derivare cellule endoteliali simili al cervello da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) che fenopiano meglio le BEC rispetto ad altri modelli umani in vitro . L'uso di BEC derivati da iPSC (IPSC-BEC) per modellare l'interazione Nm-BEC ha il vantaggio di utilizzare cellule umane che possiedono proprietà di barriera BEC e può essere utilizzato per esaminare la distruzione della barriera, l'attivazione immunitaria innata e l'interazione batterica. Qui dimostriamo come derivare le iPSC-BEC dalle iPSC oltre alla preparazione batterica, all'infezione e alla raccolta del campione per l'analisi.

Il protocollo qui descritto è adattato da Stebbins et al. ed evidenzia il processo per differenziare le iPSC in cellule endoteliali simili al cervello che possiedono proprietà BBB e come utilizzare questo modello per gli studi di infezione utilizzando iPSC-BEC con Nm19,22. Le iPSC-BEC, se differenziate correttamente, mostrano proprietà di barriera strette misurate da TEER che sono spesso superiori a 2000 Ω·cm2 ed esprimono marcatori endoteliali come VE...

Il protocollo qui descritto evidenzia i principali passaggi nella differenziazione delle cellule endoteliali cerebrali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte, nella preparazione di Neisseria meningitidis per l'infezione e nella raccolta di campioni per altre analisi molecolari.

Meningitidis di Neisseria Infezione di cellule endoteliali cerebrali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte

Meningococcal meningitis is a life-threatening infection that occurs when Neisseria meningitidis (meningococcus, Nm) can gain access to the central ...

Questo protocollo dimostra l'uso di cellule endoteliali cerebrali derivate da iPSC per esaminare le interazioni tra ospite e patogeno a livello delle barriere emato-encefaliche, come le barriere meningee sangue-CSF, in un modello in grado di imitare meglio le cellule endoteliali cerebrali in vivo. L'esame in vitro delle proprietà della barriera delle cellule endoteliali cerebrali e delle interazioni con agenti patogeni specifici per l'uomo può essere impegnativo a causa delle limitazioni nella modellazione. Le cellule endoteliali cerebrali derivate da iPSC sono particolarmente utili per queste applicazioni in quanto possiedono fenotipi di barriera superiori e sono di origine umana.Mantenere le cellule staminali pluripotenti indotte, o iPSC, a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in piastre a sei pozzetti con due millilitri di terreno di mantenimento delle cellule staminali. Per far passare le cellule, aspirare il terreno da un pozzetto non confluente e aggiungere un millilitro di reagente di dissociazione cellulare non enzimatico. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per sette minuti.Nel frattempo, sostituire la soluzione di gel della matrice su una nuova piastra a sei pozzetti con due millilitri di terreno di mantenimento delle cellule staminali fresche per pozzetto. Aspirare il reagente di dissociazione cellulare, facendo attenzione a non aspirare cellule ancora attaccate alla piastra. Sciacquare il fondo del pozzetto con sei millilitri di terreno di mantenimento delle cellule staminali fino a quando tutte le cellule non sono completamente staccate.Seminare la nuova piastra a sei pozzetti con densità variabili, in genere da uno a sei o da uno a 12 per la normale manutenzione. Agitare la piastra avanti e indietro e da sinistra a destra, facendo una pausa tra i movimenti di agitazione alternati fino a quando il mezzo non si è stabilizzato. Quindi mettilo nell'incubatrice.Aggiungere un millilitro di reagente di dissociazione cellulare enzimatica in ciascun pozzetto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per sette minuti. Per disattivare il reagente di dissociazione cellulare, trasferire un millilitro della sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri con almeno due millilitri di terreno di mantenimento delle cellule staminali fresche. Centrifugare la sospensione cellulare a 1500 G per cinque minuti.Quindi risospendere il pellet cellulare in un millilitro di terreno di mantenimento delle cellule staminali e contare le cellule con un emocitometro. Risospendere 7,5 volte 10 alla quinta cellula in 12 millilitri di terreno di mantenimento delle cellule staminali e 10 inibitori micromolari della roccia. Aspirare la matrice da un matraccio T75 e trasferire la sospensione cellulare nel pallone.Agitare il pallone per distribuire le cellule e metterlo nell'incubatore. Aggiornare il terreno ogni giorno per i due giorni successivi per rimuovere l'inibitore della roccia e supportare la crescita delle colonie di cellule staminali. Il terzo giorno, inizia la differenziazione cambiando il mezzo in un mezzo non condizionato.Cambia il mezzo ogni giorno per i prossimi cinque giorni. Sei giorni dopo l'inizio della differenziazione, espandere selettivamente la popolazione di cellule endoteliali passando alla cellula endoteliale o al terreno EC con 20 nanogrammi per millilitro di bFGF e 10 micromolari di acido retinoico. Incubare le cellule per due giorni.Preparare la soluzione di collagene IV e fibronectina secondo le indicazioni del manoscritto e utilizzarla per rivestire piastre di coltura cellulare e inserti di membrana. Aspirare il mezzo EC dalle cellule e aggiungere 12 millilitri di reagente di dissociazione cellulare. Incubare il pallone a 37 gradi Celsius fino a quando il 90% delle cellule non si è staccato.Durante il tempo di incubazione, rimuovere la soluzione di rivestimento dalle piastre e dagli inserti precedentemente preparati e lasciarli asciugare in una cappa sterile. Una volta che le cellule si sono staccate, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per creare una sospensione a singola cellula. Trasferire le cellule in una provetta da 50 millilitri e diluirle con un volume uguale di terreno privo di siero endoteliale umano.Quindi contare le cellule con un emocitometro. Pellettare le celle a 1500 G per 10 minuti. Quindi risospenderli in un terreno EC appena preparato con bFGF e acido retinoico per una concentrazione di 2 milioni di cellule per millilitro.Aggiungere 500 microlitri di sospensione cellulare alla parte superiore di un inserto a 12 pozzetti e 1,5 millilitri di terreno alla base. Distribuire le cellule in modo uniforme sull'inserto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, cambiare il terreno in EC senza bFGF o acido retinoico.Posizionare il volt/ohmmetro epiteliale nella cappa di biosicurezza e collegare gli elettrodi. Disinfettare gli elettrodi immergendoli in etanolo al 70% per almeno cinque minuti e lasciarli asciugare completamente. Rimuovere le cellule dall'incubatore e misurare immediatamente la resistenza elettrica transendoteliale, o TEER, posizionando l'elettrodo più corto sopra l'inserto e l'elettrodo più lungo nel mezzo che circonda l'inserto.Il giorno prima dell'esperimento di infezione, iniziare una coltura notturna dei batteri da brodo congelato. Striare Neisseria meningitidis su Columbia Agar con il 5% di sangue di pecora e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica durante la notte. I batteri patogeni, come la Neisseria meningitidis, hanno il potenziale per causare malattie nell'uomo.È importante formare adeguatamente le persone che lavorano con tali microrganismi e utilizzare sempre le migliori pratiche e indossare DPI adeguati. Il giorno successivo, preparare il terreno PPM plus fresco secondo le indicazioni del manoscritto e inoculare 10 millilitri di terreno con i batteri e incubare la coltura. Mentre i batteri sono in incubazione, sostituire il terreno nelle cellule endoteliali cerebrali derivate da iPSC, quindi centrifugare la coltura batterica a 4.000 G per 10 minuti.Aspirare il fluido e risospendere il pellet in 250 microlitri di PBS. Regolare a un OD600 di circa 0,4, che è circa una volta 10 per l'ottava unità formante colonie per millilitro. Diluire i batteri alla molteplicità di infezione desiderata con il terreno EC e infettare le cellule con 100 microlitri della sospensione batterica preparata per pozzetto.Quindi incubare le cellule per il tempo desiderato di infezione. Se differenziate correttamente, le cellule endoteliali cerebrali derivate da iPSC mostrano proprietà di barriera strette che sono spesso superiori a 2000 ohm centimetri quadrati e marcatori endoteliali, come VE-caderina e CD-31. Inoltre, esprimono e localizzano i marcatori di giunzione stretta Claudin-5, Occludin e ZO-1, così come i trasportatori, come Glut-1.Dopo l'infezione da Neisseria meningitidis, le cellule sovraregolano le citochine neutrofile e pro-infiammatorie, come CXCL8, CXCL1, CXCL2, CCL20 e IL6. Quando si esegue la differenziazione cellulare, la manutenzione quotidiana e il raggiungimento della densità di semina ottimale iniziale durante la divisione delle cellule sono fondamentali. Seguendo i passaggi descritti qui, i ricercatori possono raccogliere una varietà di campioni per studiare molti aspetti dell'interazione post-patogena, dalle risposte infiammatorie alla disfunzione delle cellule endoteliali cerebrali.L'avvento delle cellule endoteliali cerebrali derivate dalle iPSC ha aperto le porte al campo delle barriere cerebrali per studiare un'ampia gamma di malattie in cui le cellule endoteliali sono compromesse. Poiché alcuni patogeni del SNC sono specifici per l'uomo, dimostriamo l'uso di un sistema basato sull'uomo con l'agente patogeno specifico per l'uomo Neisseria meningitidis

neisseria-meningitidis-infection-induced-pluripotent-stem-cell

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo metodo descrive come isolare e immortalare cellule endoteliali microvascolari di cervello di topo. Descriviamo un passo-passo protocollo partire dalla omogeneizzazione del tessuto cerebrale, mineralizzazione, semina e immortalizzazione delle cellule. Di solito, ci vogliono circa cinque settimane per ottenere una omogenea, immortalato linea microvascolare delle cellule endoteliali.

Generazione di un immortalato Murine Linea microvascolare Brain Cell endoteliali come<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Cervello Modello barriera

Questo video dimostra un protocollo per indurre la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte in cellule endoteliali cerebrali.

Generazione di cellule endoteliali cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte

Questo video dimostra un processo a più fasi per differenziare le iPSC umane in cellule endoteliali microvascolari cerebrali. Le cellule differenziate risultanti imitano da vicino le cellule endoteliali microvascolari cerebrali, caratterizzate da giunzioni strette, che le rendono ideali per la ricerca sulle malattie cerebrali.

Differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo in cellule endoteliali microvascolari cerebrali

Fonte: Parajuli, B., et.al. Trapianto di microglia derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane in cervello di topi immunocompetenti per via transnasale non invasiva. J. Vis. Exp. (2022).Questo video mostra il trapianto transnasale di cellule di microglia umana derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSMG) in un cervello di topo. La ialuronidasi viene applicata alle narici di un topo impoverito di microglia per migliorare la permeabilità. La sospensione di iPSMG viene...

Trapianto transnasale di cellule microgliali umane derivate da cellule staminali pluripotenti indotte nel cervello di topo

Qui vi presentiamo il nostro metodo stabilito per riprogrammare cellule somatiche umane in libera-transgene iPSCs umane con virus di Sendai, che mostra esito coerente e una maggiore efficienza.

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

Targeting cellule cerebrali residente per discendenza diretta-riprogrammazione offre nuove prospettive per la riparazione del cervello. Qui si descrive un protocollo di come preparare le culture arricchito da pericytes cervello residente da adulto corteccia cerebrale umana e convertirli in neuroni indotti dall'espressione retrovirus-mediata dei fattori di trascrizione Sox2 e Ascl1.

Lineage-riprogrammazione di cellule pericyte-derivate del cervello umano adulto in neuroni indotti

Qui, descriviamo un metodo per indurre la meningite meningococcica attraverso una via intracisternale di infezione nei topi adulti. Vi presentiamo un protocollo passo dopo passo dell'infezione da meningococco dalla preparazione dell'inoculum all'infezione intracisternale; quindi registrare la sopravvivenza animale e valutare i carichi batterici nei tessuti murini.

Indurre Meningococcal Meningitis Serogroup C in Topi tramite consegna intracisternale

Descriviamo un'iniezione intracisternache che impiega un ago piegato sulla punta che può essere stabilizzato al cranio, eliminando così il rischio di danni al parenchyma sottostante. L'approccio può essere utilizzato per la mappatura genetica del destino e manipolazioni delle cellule leptomeningeee e per il monitoraggio del movimento del fluido cerebrospinale.

Induzione di cellule leptomeningeali Modifica tramite iniezione intracisternale

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo adattato per derivare, espandere e crioconservare le cellule endoteliali microvascolari cerebrali ottenute differenziando le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e per studiare le proprietà della barriera eculare nel sangue in un modello ex vivo.

Derivazione, espansione, crioconservazione e caratterizzazione di cellule endoteliali microvascolari cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Il protocollo qui presentato consente il trapianto di microglia umana derivata da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSMG) nel cervello attraverso una via transnasale in topi immunocompetenti. Viene mostrato il metodo per la preparazione e il trapianto transnasale di cellule e la somministrazione di miscela di citochine per il mantenimento di iPSMG.

Trapianto di microglia derivata da cellule staminali pluripotenti indotte umane nel cervello di topi immunocompetenti tramite via transnasale non invasiva

Qui, descriviamo un protocollo, il metodo di coltura cellulare endoteliale estesa (EECM), che consente la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti in cellule simili alle cellule endoteliali microvascolari del cervello (BMEC). Queste cellule mostrano l'espressione della molecola di adesione delle cellule endoteliali e sono quindi un modello di barriera emato-encefalica umana adatto a studiare le interazioni delle cellule immunitarie in vitro.

Differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane in cellule simili a cellule microvascolari simili a cellule endoteliali microvascolari del cervello con un fenotipo immunitario maturo

Scopri come utilizzare cellule endoteliali cerebrali derivate da iPSC per studiare le interazioni ospite-patogeno con Neisseria meningitidis. Questo modello umano migliora la comprensione delle infezioni del sistema nervoso centrale.

Meningitidis di Neisseria Infezione di cellule endoteliali cerebrali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte

Esplora altri video