Misurare il legame nucleotidico a proteine di membrana intatte e funzionali in tempo reale

Poiché l'ATP è un importante messaggero cellulare, abbiamo sviluppato un metodo che ci consente di misurare il legame dell'ATP ai suoi recettori con alta precisione. Utilizzando FRET tra derivati nucleotidici e proteine marcate fluorescentmente, possiamo monitorare il legame nucleotidico ai recettori funzionali intatti in tempo reale e con un'eccellente risoluzione spaziale. Usiamo questo metodo per comprendere gli effetti del metabolismo cellulare sul canale del potassio sensibile all'ATP, che è implicato in alcune forme di diabete.

Per impostare un esperimento di membrana senza tetto, utilizzare prima un paio di pinze per rompere un piccolo frammento da un vetrino di copertura con cellule trasfettate e sciacquare il frammento con PBS. Se il vetrino di copertura è pre-rivestito con polilisina, posizionare il frammento sul fondo di un piatto da 35 millimetri contenente due millilitri di PBS e tenere un sonicatore a sonda da tre millimetri da tre a cinque millimetri sopra il campione, che pulsa a 50 watt e da 20 a 40% di ampiezza per 200-500 millisecondi per aprire il tetto delle celle. Se i vetrini di copertura non sono pre-rivestiti, dopo il risciacquo con PBS, immergere il frammento in un tubo contenente lo 0,1% di poli-L-lisina per circa 30 secondi prima di aprire le celle con una breve sonicazione come dimostrato.

Trasferire il frammento sonicato in un piatto di vetro coperto da 35 millimetri contenente due millilitri di soluzione da bagno e montare il piatto su un microscopio invertito dotato di un obiettivo ad immersione in acqua 60x ad alta apertura numerica. Verificare che la porta della telecamera del microscopio sia collegata a uno spettrografo in serie con una camera CCD ad alta sensibilità e utilizzare una pompa peristaltica per perfondere la camera da bagno con tampone a una portata da 0,5 a un millilitro di tampone al minuto. Per identificare frammenti di membrana senza tetto che esprimono il canale marcato ANAP, visualizzare il campione per individuare membrane con canali fluorescenti.

Inserire parzialmente la maschera dello spettrometro tra la porta della telecamera sul microscopio e lo spettrografo. L'ombra della maschera apparirà sull'immagine della fotocamera. Acquisire un'immagine di campo luminoso e fluorescenza della membrana non coperta per consentire la selezione della regione di interesse per l'analisi.

Avvicinare la punta del sistema di perfusione a microvolume alla membrana non coperta. Per acquisire un'immagine della fluorescenza ANAP, eccitare la membrana con un LED a 385 nanometri attraverso un filtro di eccitazione passa banda 390/18 nanometri e un bordo dicroico a 416 nanometri, raccogliendo la luce emessa attraverso un filtro di emissione longpass a 400 nanometri. Attivare la maschera dello spettrometro e assicurarsi che la luce emessa venga attraversata.

Allineare la regione di interesse con la fessura della maschera dello spettrometro. Attivare le griglie dello spettrometro. Con le griglie in posizione, la luce diffratta dallo spettrometro verrà proiettata sul chip della camera CCD per produrre immagini spettrali.

Le immagini manterranno le informazioni spaziali nella dimensione Y. La dimensione X verrà sostituita con la lunghezza d'onda. Durante la fusione con la soluzione tampone priva di nucleotidi, ottenere una o più esposizioni da 0,1 a dieci secondi per la correzione a valle e la normalizzazione dei dati raccolti durante il resto dell'esperimento.

Quindi, applicare un intervallo di concentrazioni di TNP ATP nella soluzione di bagno per stabilire una curva di risposta alla concentrazione, perfondendo ciascuna soluzione per almeno un minuto per garantire che venga raggiunto uno stato stazionario e ottenere un'esposizione per ciascuna concentrazione. Dopo ogni concentrazione, lavare il TNP ATP con una soluzione di bagno priva di nucleotidi per almeno un minuto prima di acquisire un'immagine di esposizione post-trattamento. Per eseguire un esperimento di fluorometria patch-clamp, prima tirare pipette patch da capillari di vetro borosilicato a parete spessa a una resistenza da 1,5 a 2,5 megaohm quando riempite con soluzione di pipetta.

Quindi, trasferire un vetrino di copertura con cellule trasfettate in un piatto di vetro da 35 millimetri contenente due millilitri di soluzione da bagno e montare il piatto sul microscopio invertito. Perfondere la camera da bagno con la soluzione da bagno e identificare una cellula che esprime canali marcati ANAP. Applicare una leggera pressione positiva su una pipetta patch e posizionare la pipetta in una camera da bagno.

Premere la pipetta contro la membrana della cella e applicare un'aspirazione delicata per ottenere una tenuta gigaohm. Per asportare il cerotto, allontanare rapidamente il portapipette dalla cella rattoppata. Avvicinare la punta della pipetta del cerotto alla punta del sistema di perfusione e verificare che il cerotto si trovi all'interno della fessura della maschera dello spettrometro.

Quindi applicare TNP ATP e raccogliere spettri di immagine. In queste immagini, si può osservare un tipico frammento di membrana senza tetto proveniente da una cellula HEK293T che esprime canali del potassio sensibili all'ATP marcati con proteina fluorescente arancione. In questa immagine spettrale dei canali del potassio sensibili all'ATP marcati ANAP in una membrana senza tetto da una cellula HEK293T esposta a cinque micromolari TNP ATP, si possono osservare due regioni di alta intensità che corrispondono al picco di emissione di ANAP e TNP ATP.

Uno spettro finale può essere ottenuto sottraendo lo spettro di fondo medio dallo spettro medio della regione di interesse. Qui si può osservare la riduzione del picco di fluorescenza ANAP dopo esposizioni multiple. Il picco di fluorescenza da diverse esposizioni in assenza di TNP ATP è stato adattato a un singolo decadimento esponenziale.

Questi dati sono stati poi utilizzati per correggere gli artefatti fotosbiancanti. Qui vengono mostrate immagini spettrali rappresentative da una membrana senza tetto ottenute da una cellula che esprime canali del potassio sensibili all'ATP marcati ANAP in assenza e la presenza di TNP ATP. L'osservazione degli spettri di emissione corretti rivela una netta separazione tra l'emissione fluorescente del donatore e dell'accettore.

In questa figura, vengono mostrate correnti e spettri rappresentativi dei canali del potassio sensibili all'ATP marcati con ANAP da un tipico esperimento di fluorometria patch-clamp. Gli spettri di emissione sono corretti per lo sfondo e lo sbiancamento come dimostrato per le membrane senza tetto. Prestare attenzione ai controlli per verificare che il segnale fluorescente sia specifico per il recettore.

Assicurati che la tua profusione sia veloce, efficiente e completa e mantieni le tue esposizioni il più brevi possibile. Questo metodo risponde alle domande sull'occupazione del recettore e su come si relaziona alla funzione. Altre tecniche FRET utilizzate con una configurazione simile possono sondare i cambiamenti di conferma indotti dal ligando nel recettore.