Generazione extra di organoidi testicolari murini basati su matrice cellulare ed extra cellulare

Questi protocolli consentono all'utente di produrre un gran numero di organoidi testicolari funzionali strutturalmente mimetici ed endocrini in ambienti ecm e senza DCM in condizioni di coltura 2D o 3D. Queste tecniche sono altamente riproducibili, facilmente applicabili alle impostazioni standard del laboratorio biologico e utilizzano solo strumenti e materiali comuni. Gli organoidi testicolari sono un nuovo strumento per simulare la spermatogenesi e l'endocrinologia riproduttiva in vitro, e potrebbero un giorno consentire lo studio della gametogenesi in vitro.

Inizia posizionando la supina di topo eutanasiata su un tappetino di dissezione e sterilizzando l'addome con il 70% di etanolo. Tenda la pelle dell'addome inferiore con le forcep e aprila con le forbici. Individuare i teste nelle regioni inguinali in basso a sinistra e a destra dell'addome e tagliare le loro connessioni ai deferenti vas e a qualsiasi tessuto connettivo ancorante.

Quindi sollevare l'intero teste dall'animale. Mettilo in una piastra di Petri di BM pre-equilibrato. Al microscopio a dissezione, fare una piccola incisione nella tunica albuginea su un'estremità di ogni testicolo con piccole forbici a micro dissezione o strappando delicatamente con due forcep fini. Tenendo il testicolo dall'estremità opposta dell'incisione, spremere delicatamente con forcep fini e spingere in un movimento di spazzamento verso il foro nella tunica, che rilascerà il tessuto testicolare come un unico pezzo coeso.

Tagliare il tessuto a pezzi più piccoli. Posizionare i pezzi in un millilitro di soluzione di dissociazione prebellica uno e incubarli a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'incubazione, triturare delicatamente le provette 50 volte con una pipetta P1000.

Assicurarsi che i tubuli si separino l'uno dall'altro e dal tessuto interstiziale. Se rimangono grumi, incubare per altri cinque minuti e triturare di nuovo. Aggiungere 33 microlitri di soluzione di materiale ialuronidasi per un millilitro della miscela di dissociazione.

Quindi triturare 50 volte con una pipetta P1000 e incubare il campione a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, triturarlo 50 volte con una pipetta P200. Dopo aver fatto in modo che non siano presenti tubuli visibili o grumi di cellule, dissetare gli enzimi di dissociazione aggiungendo FBS al 10% del volume totale del campione e triturarlo più volte con una pipetta P200.

Bagnare il centro di un colino a celle da 40 micrometri con mezzi e aspirarlo via, quindi aggiungere il campione al filtro pre-bagnato e filtrarlo per produrre una sospensione a cella singola. Centrifugare la sospensione a 100 volte g per sette minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in BM fresco. Contare le cellule vitali su un emocitometro usando l'esclusione blu del tripano, quindi ri-centrifugarle e rimescolarle in BM fresco. Per la coltura priva di ECM 2D, le sospensioni a cella singola a piastre direttamente su vetrini a camera a quattro pozzi e posizionano le diapositive in un incubatore Celsius di 35 gradi.

Per la coltura 2D ECM, erogare 100 microlitri di mezzo a matrice extracellulare diluito uno-a-uno freddo in uno scivolo a camera a quattro porri, assicurando che il gel copra il fondo del piatto. Posizionare lo scivolo nell'incubatore per un minimo di 30 minuti per consentire all'ECM di polimerizzare in un gel, quindi aggiungere sopra la sospensione cellulare. Per una cultura senza ECM 3D, metti i piatti 3D Petri in agarosio in un piatto di coltura da 24 pozzetti e coprili con un millilitro di BM. Lasciare equilibrare i piatti in BM per almeno 30 minuti in un incubatore di 35 gradi Celsius, quindi scartare il BM e ripetere ancora una volta l'equilibrazione con un millilitro di BM fresco. Rimuovere tutti i BM dal pozzo e erogare 200 microlitri di BM fresco intorno ma non all'interno della rientranza centrale della piastra di Petri 3D, quindi raccogliere l'eventuali BM rimanenti dall'interno della rientranza di semina della cella centrale del micro inserto del pozzo.

Erogare la sospensione a cella singola nella rientranza centrale e triturare delicatamente su e giù. Mettere il piatto in un incubatore umidificato di 35 gradi Celsius per la coltura. Il giorno successivo, rimuovere lentamente e con cura i supporti esistenti da intorno alla piastra di Petri 3D di agarosio e sostituirli con un millilitro di BM fresco. Gli organoidi avrebbero dovuto compattarsi durante la notte, permettendo loro di riposare sul fondo.

Per le impostazioni cultura 3D ECM, preparare una sospensione a cella singola combinando parti uguali della sospensione cellulare in BM con ECM pre-scongelato a freddo. Triturare più volte per assicurarsi che sia ben miscelato. Quindi erogare immediatamente la miscela in uno scivolo a camera a quattro po porsi, assicurandosi che copra l'intero fondo della piastra.

Incubare i vetrini della camera a 35 gradi Celsius e lasciare che il suo contenuto polimerizzi per almeno 30 minuti. Dopo la polimerizzazione, aggiungere 500 microlitri di BM sopra la coltura. Cultura tutti i tipi di modello organoide a 35 gradi Celsius.

Per tutti i tipi di cultura, scambia metà dei loro supporti con BM fresco ogni due giorni. Questo protocollo è stato utilizzato per ottenere la generazione di organoidi entro 24 ore utilizzando cellule testicolari murine giovanili. I tessuti generati con successo sono stati inizialmente osservati come ammassi cellulari 3D.

Negli ambienti ECM, i cluster di celle possedevano margini chiari tra il cluster e l'ambiente circostante. Sono stati osservati anche cluster cellulari che migrano attraverso l'ECM e si fondono insieme. La cultura 3D ECM richiedeva molto più tempo per assemblare strutture de novo rispetto a tutti gli altri metodi di coltura.

E la cultura 3D ECM-free ha prodotto i cluster più grandi con un unico cluster grande e compatto all'interno di ogni pozzo della piastra di Petri di agarosio 3D. Per valutare se i modelli organoidi assomigliano al tessuto nativo, i costrutti biologici sono stati sondati per marcatori specifici delle cellule e visualizzati con immunofluorescenza. I metodi 2D ECM e 3D ECM-free producevano organoidi con una morfologia interna altamente mimetica di compartimentazione testicolare.

Un'analisi a lungo termine è stata eseguita sugli organoidi assemblati senza ECM 3D. Gli organoidi sono stati coltivati per 14 giorni e quindi sondati per marcatori specifici della cellula e della struttura. Sono state osservate strutture simili a tubuli.

Gli organoidi senza ECM 3D sono stati studiati anche per la funzione endocrina in una coltura di 12 settimane con stimolazione della gonadotropina. Il testosterone e l'inibina B sono stati entrambi quantificati da mezzi con condizione organoide. Dopo 12 settimane, le gonadotropine sono state rimosse per 48 ore, causando una diminuzione delle concentrazioni di testosterone e inibina B.

Quando le gonadotropine sono state restituite, entrambe le concentrazioni ormonali sono aumentate significativamente, dimostrando una corretta reattività endocrina. L'assemblaggio organoide sfrutta il comportamento autonomo delle cellule testicolari immature vitali. Gli esperimenti creativi possono essere facilmente ideati utilizzando miscele cellulari personalizzate ordinate o ibride.

Dopo il seeding cellulare, l'imaging video in diretta o l'imaging time-lapse possono essere utilizzati per quantificare l'auto-assemblaggio organoide. Attraverso la coltura, gli organoidi e il mezzo di condizione possono essere raccolti per analisi istologiche e aminoacidi.