Name: Somministrazione in vitro e in vivo dellipertermia magnetica con nanoparticelle utilizzando un sistema di consegna personalizzato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Scopri l'ipertermia magnetica con nanoparticelle per applicazioni precliniche in neuroscienza e biotecnologia. Questo metodo garantisce consegna precisa, monitoraggio termico accurato e riproducibilità nei modelli animali.

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Lo studio è stato finanziato dai numeri di sovvenzione: NCI P30 CA023108 e NCI U54 CA151662.

Il Dartmouth College Animal Care and Use Program è accreditato dall'American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (iAAALAC) e aderisce a tutte le linee guida e i regolamenti UDSA e NIH (Office of Laboratory Animal Welfare). Tutti gli studi in vivo sono stati approvati dal Dartmouth College Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). La procedura di eutanasia aderisce alle linee guida AVMA 2020 per l'eutanasia degli animali.
1. Strumentazione/progettazione del sistema
<ol><li>Progetta un'antenna AMF personalizzata (bobina) per essere un anello chiuso, scegliendo le forme per creare il campo magnetico desiderato. Utilizzare le formule e le caratteristiche di induttanza dalla scelta del generatore di potenza per progettare bobine compatibili per generare il campo desiderato. Utilizzare diversi design per esperimenti in vitro e in vivo.</li>
	<li>Assicurarsi che l'induttanza dell'antenna AMF rientri nell'intervallo accettabile del generatore di corrente. Aggiungere o sottrarre condensatori per abbinare (sintonizzare) l'antenna al generatore di energia.</li>
	<li>Per gli esperimenti in vitro, progettare una bobina elicoidale a 14 giri, diametro interno 2 cm e lunghezza 14 cm, che può contenere tubi da 1,5 ml, consentendo il trattamento di più campioni contemporaneamente. Isolare la bobina con un polimero vinilico e utilizzare un distanziatore in polistirolo per separare la bobina dai tubi. I dettagli delle specifiche di progettazione e le considerazioni sono presenti nel file supplementare 1.</li>
	<li>Per gli esperimenti in vivo, acquista una bobina elicoidale per tutto il corpo costruita su misura da un produttore con informazioni di progettazione proprietarie. Utilizzare tubi quadrati da 8 mm (poiché crea un campo più uniforme all'interno del foro della bobina) e un concentratore nell'area di trattamento mirata. Rendere il concentratore lungo 5,0 cm, con un totale di 5 giri per ottenere un diametro interno di 3,6 cm, diametro esterno di 5,2 cm e avere la sua posizione nell'area di trattamento mirata. Circondare la bobina con un guscio in policarbonato.</li>
	<li>Utilizzare un generatore AMF con potenza e frequenza regolabili, nominale a 10 kW o superiore come fonte di alimentazione. L'induttanza abbina la fonte di alimentazione e le antenne/bobine a un intervallo da 0,62 a 1,18 μHenries (μH), consentendo frequenze comprese tra 30-300 kHz. Raffreddare il generatore utilizzando acqua riciclata attraverso una pompa centrifuga, pressione regolata a 50 psi.</li>
	<li>Raffreddare le bobine con un refrigeratore da 5,6 tonnellate di capacità di raffreddamento che pompa il 25% di fluido termovettore a base di glicole etilenico diluito con acqua attraverso l'antenna AMF. Impostare la temperatura del refrigeratore in modo tale che l'antenna non riscaldi o raffreddi il campione.</li>
	<li>Per il contenimento degli animali, costruire un supporto tubolare che può essere sospeso al centro della bobina con un traferro di 0,5 cm tra il supporto e la superficie della bobina. Collegare una pompa dell'aria condizionata regolabile che fa circolare l'aria attraverso il guscio attorno alla bobina e impostarla per mantenere una normale temperatura interna animale. Collegare la macchina per anestesia al supporto tubolare dell'animale vicino alla testa dell'animale per garantire la corretta erogazione dell'anestesia.</li>
	<li>Per il contenimento delle cellule, creare un apparato che faccia circolare l'acqua da un bagno d'acqua attraverso il distanziatore in cui sono posizionati i tubi. Impostare la temperatura di questo bagnomaria in modo che i tubi siano circondati dall'acqua a 37 °C.</li>
	<li>Utilizzare sonde a fibre ottiche per monitorare le temperature all'interno del tumore, il nucleo dell'animale e l'ambiente animale o per studi in vitro, monitorando la temperatura del pellet cellulare e l'acqua che circonda i tubi.</li>
	<li>Utilizzare nanoparticelle magnetiche di ossido di ferro di dimensioni 100 nm per tutti gli esperimenti. NOTA: La concentrazione e il tasso di assorbimento specifico (SAR) sono due caratteristiche che devono essere considerate quando si scelgono le nanoparticelle, in quanto influenzano direttamente il possibile riscaldamento e la dose termica18.</li>
</ol>2. Ipertermia in vitro
<ol><li>Coltura B16F10 cellule di melanoma murino in terreni RPMI con 10% FBS e 1% Pen/streptococco. Piastra 150.000 celle/pozzetto in piastre a 6 pozzetti, con 2 ml di mezzo completo.</li>
	<li>Determinare il trattamento appropriato per ogni pozzetto, cioè cellule senza mNP e senza AMF, cellule con mNP e senza AMF, cellule senza mNP e AMF, cellule con mNP e AMF. NOTA: Inoltre, assicurarsi che ci siano controlli appropriati se si combina l'ipertermia con un'altra terapia. L'AMF viene eseguito in un laboratorio di ricerca standard adattato con le capacità di alimentazione e raffreddamento necessarie.</li>
	<li>24 ore dopo la placcatura, aggiungere mNP ai pozzetti appropriati come determinato nella fase precedente. Aggiungere mNPs ad una concentrazione di 3 mg di ferro/ml. Assicurarsi che gli mNP siano distribuiti in tutto il pozzo, creando una soluzione di supporti / mNP (rimuovendo i vecchi supporti, aggiungendo questa soluzione) o aggiungendo direttamente gli mNP e ruotando delicatamente le piastre per una distribuzione omogenea.</li>
	<li>Iniziare il trattamento, 48 ore dopo l'aggiunta di mNP, quando i pozzetti sono ~ 80% confluenti, rimuovendo i mezzi e lavando i pozzetti con mezzi freschi. Rimuovere il supporto.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 ml di tripsina a ciascun pozzetto trattato e ruotare delicatamente. Utilizzare un microscopio per verificare che le cellule siano staccate.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di supporto a ciascun pozzetto per raccogliere le cellule in tubi da 1,5 ml. Raccogliere tutte le celle dal pozzo (~1 x 106 celle). Utilizzare un tubo separato chiaramente etichettato per ciascun pozzetto.</li>
	<li>Spingere i tubi a 60 x g per 2-3 minuti per consentire alle celle di pellettare. Trattenere il pellet nel supporto.</li>
	<li>Posizionare i tubi nel distanziatore pieno d'acqua all'interno della bobina. Impostare la temperatura del bagno d'acqua in modo tale che il fluido e il pellet cellulare siano mantenuti a 37 °C. Monitorare la temperatura all'interno del tubo e del bagno d'acqua utilizzando sonde di temperatura a fibre ottiche separate.</li>
	<li>Accendere il refrigeratore, controllare che il refrigerante scorra attraverso la bobina. Accendere la fonte di alimentazione e regolare la percentuale massima in base al campo desiderato. Azionare l'elettrobobina a 14 giri, alimentata da un generatore da 10 kW, a 165 kHz e 23,87 kA/m (300 Oe).</li>
	<li>Posizionare una sonda di temperatura in fibra ottica separata in uno dei tubi. Trattare le cellule fino alla dose termica del protocollo precedentemente determinata. Un esempio è 30 min a 43 °C (CEM43 di 30).</li>
	<li>Risospendere le celle nel mezzo che si trova nei loro tubi e ri-placcare in nuove piastre a 6 pozzetti. Etichettare chiaramente i nuovi piatti. L'obiettivo è quello di ri-placcare tutte le cellule raccolte (~1 x 106 celle). NOTA: Dovrebbero essere utilizzate nuove piastre a 6 pozzetti per garantire che le cellule coltivate ricevano il trattamento. Se vengono utilizzate le vecchie piastre, potrebbero essere ancora rimaste cellule sulle piastre che non sono state tripsinizzate con successo.</li>
	<li>Se necessario, per la successiva procedura sperimentale, lisare le cellule per l'analisi dell'espressione di RNA o proteine.</li>
</ol>3. Ipertermia in vivo
<ol><li>Coltura cellulare e inoculazione<ol><li>Coltura B16F10 cellule di melanoma murino in terreni RPMI con 10% FBS e 1% Pen/streptococco. Utilizzare piastre / piatti che forniscano abbastanza cellule per l'inoculazione del numero desiderato di animali. Ad esempio, piatti da 10.100 mm, placcati a 100.000 cellule saranno confluenti con abbastanza cellule per 20 iniezioni di topi entro 48 ore.</li>
		<li>Tripsinizzare le cellule e raccogliere utilizzando supporti RPMI puri (senza FBS o penna / streptococco).</li>
		<li>Contare le cellule e creare una soluzione per la concentrazione desiderata di cellule, in base al volume di inoculazione e al numero di mouse.</li>
		<li>Anestetizzare topi femmina C57Bl/6 di 6 settimane usando isoflurano vaporizzato e ossigeno. Mettere gli animali in una scatola di plexiglass con il 5% di isoflurano e il 95% di ossigeno fino a quando non vengono indotti. Una volta indotto, rimuovere l'animale e usare un cono facciale al 2% di isoflurano per completare i passaggi 3.1.5-3.1.7 e 3.3.3-3.3.6. NOTA: Per l'anestesia durante il trattamento utilizzare un contenimento dell'anestesia incorporato. Seguire i protocolli istituzionali standard per l'anestesia del topo. Prima della sperimentazione animale garantire l'approvazione IACUC appropriata. Dopo l'anestesia, riportare l'animale in gabbia e monitorare il recupero per garantire che non ci siano complicazioni.</li>
		<li>Controlla la mancanza di risposta ai riflessi di raddrizzamento.</li>
		<li>Rasare il fianco destro usando un rasoio elettrico.</li>
		<li>Pulire l'area di iniezione con una salvietta imbevuta di alcool. Iniettare 1-2 x 106 cellule, utilizzando una siringa di vetro da 100 μL con un ago da 28 G, dispersa in 50 μL di terreno per via intradermica sul fianco destro rasato di anestetizzato.</li>
	</ol></li>
	<li>Crescita tumorale/iniezione di nanoparticelle<ol><li>Misura i tumori in 3 dimensioni usando i calibri (lunghezza, larghezza e profondità) e calcola i volumi per (lunghezza x larghezza x profondità x π)/6.</li>
		<li>Quando i volumi tumorali raggiungono 120 mm 3 (+/- 20 mm3), mettere gli animali in studio. Progettare lo studio, assicurandosi che ci siano gruppi di controllo e trattamento appropriati che includano coorti di terapia combinata (cioè controllo, mNPH, radiazioni e la combinazione).</li>
		<li>Anestetizzare i topi che riceveranno mNP come descritto al punto 3.1.4.</li>
		<li>Pulire l'area con una salvietta imbevuta di alcool. Iniettare mNPs nel tumore 3 ore prima del trattamento con AMF. Iniettare un volume tale che la dose sia di 7,5 mg di ferro/cm3 di tumore. NOTA: Dati non pubblicati dal laboratorio suggeriscono che l'assorbimento massimo di mNP avviene a 3-6 ore.</li>
	</ol></li>
	<li>Trattamento AMF<ol><li>Anestetizzare il mouse e posizionarlo su una piastra riscaldante per mantenere la temperatura interna.</li>
		<li>Controlla la mancanza di risposta ai riflessi di raddrizzamento. Rimuovere il marchio auricolare o altri oggetti metallici sul mouse.</li>
		<li>Posizionare delicatamente una sonda di temperatura in fibra ottica lubrificata nel retto del mouse.</li>
		<li>Posizionare un catetere nel tumore, rimuovendo l'ago. Tagliare il catetere in modo tale che non sporga troppo dal tumore. NOTA: I cateteri di temperatura a fibre ottiche vengono posizionati e rimossi mentre i topi sono in anestesia generale, cioè i cateteri sono in posizione solo durante la procedura di riscaldamento del tumore. Ai topi viene somministrata una singola dose sottocutanea di un farmaco per l'analgesia dei FANS, ketoprofene (5 mg / kg), al momento della procedura. Non abbiamo osservato disagio o morbilità a breve o lungo termine associati al posizionamento dei cateteri.</li>
		<li>Inserire una sonda di temperatura a fibra ottica a 3 sensori nel catetere. Il catetere protegge i sensori della sonda di temperatura in fibra ottica.</li>
		<li>Fissare la sonda rettale e intratumorale alla coda dell'animale per assicurarsi che rimangano in posizione.</li>
		<li>Posizionare il mouse in un tubo da 50 ml, dirigersi verso il basso. Il tubo dovrebbe avere un foro vicino alla testa dove l'anestesia sarà collegata e consegnata.</li>
		<li>Posizionare il tubo all'interno della bobina e ricollegare l'anestesia.</li>
		<li>Posizionare una sonda di temperatura in fibra ottica liberamente nel tubo per misurare la temperatura ambiente.</li>
		<li>Accendere il refrigeratore e assicurarsi che il refrigerante sia in circolazione.</li>
		<li>Controllare e assicurarsi che il software del computer visualizzi le varie temperature e iniziare la registrazione per consentire la visualizzazione di un calcolo CEM43 in tempo reale. Il CEM43 richiesto è la dose precedentemente determinata. NOTA: Prima di accendere il magnete, assicurarsi che nessun oggetto metallico sia attaccato all'animale, poiché questi si riscaldano rapidamente. Inoltre, assicurati che tutti nella stanza non abbiano un pacemaker e che sia sicuro per loro essere lì.</li>
		<li>Accendere il magnete a bassa percentuale di potenza.</li>
		<li>Assicurarsi che le sonde di temperatura in fibra ottica registrino le variazioni di temperatura. Le temperature aumenteranno una volta attivato l'AMF all'aumentare del campo. Assicurarsi che la temperatura interna dell'animale rimanga a 38 °C. Regolare la temperatura interna utilizzando la camicia ad aria condizionata.</li>
		<li>Regolare la forza del campo magnetico cambiando l'alimentazione sul generatore, utilizzando il quadrante di controllo incorporato, che a sua volta controlla il livello di temperatura nel tumore.</li>
		<li>Spegnere l'AMF una volta che la dose desiderata, come precedentemente determinato dall'utente (ad esempio CEM43 40), è stata raggiunta all'interno del tumore.</li>
		<li>Una volta spento l'AMF, rimuovere il tubo dalla bobina.</li>
		<li>Rimuovere il mouse dal tubo, estraendo le varie sonde e catetere. Se necessario, etichettare l'animale con un nuovo marchio auricolare metallico.</li>
		<li>Una volta completati i trattamenti, spegnere il refrigeratore.</li>
		<li>Recuperare gli animali dall'anestesia garantendo l'assenza di complicazioni. Monitorare il loro comportamento per garantire il ritorno alla normalità.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La progettazione e l'implementazione di questo sistema fornisce la capacità di condurre esperimenti accurati e riproducibili in vitro e in vivo di ipertermia di nanoparticelle magnetiche. È fondamentale che il sistema sia progettato in modo tale che la frequenza AMF e l'intensità del campo siano adeguatamente abbinate al tipo di nanoparticelle magnetiche, alla concentrazione, alla posizione e alla temperatura del tessuto desiderate. Inoltre, il monitoraggio accurato della temperatura in tempo reale è fondamentale per la ...

L'ipertermia è stata storicamente utilizzata nella terapia del cancro, da sola o in combinazione con altri trattamenti. Sebbene abbia una lunga storia di utilizzo, il metodo più vantaggioso per fornire questo trattamento è ancora in discussione e dipende dal sito e dalla posizione della malattia. I metodi per la somministrazione di ipertermia includono microonde, radiofrequenza, ultrasuoni focalizzati, laser e nanoparticelle metalliche (come oro o ossido di ferro)1,2,3,4. Questi metodi di somministrazione possono portare a una gamma di temperature di trattamento dal livello di febbre fino a centinaia di gradi C. L'effetto biologico dell'ipertermia dipende principalmente dalle temperature utilizzate e dalla durata del trattamento5. Per questo manoscritto e scopo, ci stiamo concentrando sull'ipertermia delle nanoparticelle magnetiche (mNPH). Questo metodo consente variazioni di temperatura focalizzate, localizzate, ben monitorate e controllate, utilizzando nanoparticelle di ossido di ferro non tossiche, approvate dalla FDA.
Una trappola di altre modalità di ipertermia è la mancanza di un preciso targeting cellulare; L'ipertermia non ha un rapporto terapeutico intrinsecamente elevato, pertanto è necessaria un'attenta termometria e targeting6. mNPH consente l'iniezione sistemica o intratumorale di mNP, con il calore generato solo dove si trovano gli mNP, indirizzando così il trattamento direttamente al tumore. mNPH può essere efficace quando le nanoparticelle magnetiche si trovano all'interno o all'esterno della cellula. Per la terapia del cancro, la panoramica generale di mNPH è che le nanoparticelle magnetiche vengono iniettate (per via intratumorale o endovenosa), quindi viene applicato un campo magnetico alternato, causando il costante riallineamento dei poli magnetici delle nanoparticelle, portando ad un riscaldamento localizzato delle cellule e dei tessuti associati alle nanoparticelle 7,8 . Regolando il volume delle nanoparticelle e la frequenza/forza del campo magnetico alternato (AMF), è possibile controllare attentamente la temperatura generata all'interno del tessuto.
Questo trattamento funziona bene nei tumori che si trovano vicino alla superficie corporea, poiché i tumori più profondi richiedono AMF più forte, quindi il rischio di riscaldamento a correnti parassite aumenta9. Ci sono prove che l'ipertermia viene utilizzata clinicamente come monoterapia, tuttavia, spesso l'ipertermia è combinata con radioterapia o chemioterapia, portando ad un effetto anti-cancro più mirato10,11,12. L'evidenza clinica dell'ipertermia che funziona in combinazione con la radioterapia è stata esaminata in una precedente pubblicazione13. Il nostro laboratorio ha trattato con successo una varietà di animali, dai topi ai maiali e tumori canini spontanei, utilizzando il metodo mNPH12,14,15. Questo protocollo è progettato per coloro che sono interessati a studiare gli effetti del trattamento di ipertermia localizzata, da solo o in combinazione con altre terapie.
Uno dei fattori più importanti nell'ipertermia è essere in grado di misurare e comprendere, in tempo reale, la dose termica erogata al tessuto bersaglio/tumorale. Un metodo standard per calcolare e confrontare la dose consiste nella dimostrazione dei minuti equivalenti cumulativi di riscaldamento a 43 °C; Questo algoritmo consente di confrontare le dosi indipendentemente dal sistema di erogazione, le temperature massime e minime (all'interno di un intervallo specifico) e i parametri di riscaldamento/raffreddamento 5,16. Il calcolo CEM funziona meglio per temperature comprese tra 39-57 °C5. Ad esempio, in alcuni degli studi che abbiamo eseguito, abbiamo scelto una dose termica di CEM43 30 (cioè 30 minuti a 43 °C). La scelta di questa dose ci ha permesso di esaminare un sicuro, efficace, effetti immunogenetici in vitro, sia da solo, sia in combinazione con una singola dose di radiazioni17.
Con l'ipertermia magnetica a nanoparticelle, ci sono diversi fattori che devono essere considerati nella costruzione di un sistema di consegna appropriato. La progettazione della strumentazione include importanti fattori di sicurezza, come l'uso di un refrigeratore per garantire che l'apparecchiatura di erogazione del campo magnetico rimanga fredda anche quando funziona ad alta potenza e procedure fail-safe che impediscono l'accensione del sistema se tutti i sistemi di temperatura, valutazione della potenza e controllo non sono stati attivati. Inoltre, ci sono importanti fattori biologici che devono essere considerati sia in situazioni in vivo che in vitro. Quando si utilizzano cellule in coltura, è necessario trattare nei terreni di crescita e mantenere una temperatura vitale costante per evitare cambiamenti fisiologici che potrebbero influenzare i risultati. Per i singoli tipi di nanoparticelle, è importante conoscere il tasso di assorbimento specifico (SAR) quando si calcolano i parametri di riscaldamento basati su AMF. Allo stesso modo, è importante conoscere la concentrazione di mNP/Fe, nelle cellule e nei tessuti, necessaria per ottenere il riscaldamento desiderato. I metodi in vivo richiedono ancora più attenzione ai dettagli poiché l'animale deve essere mantenuto in anestesia durante il trattamento e la temperatura corporea interna dell'animale deve essere mantenuta a un livello normale durante tutto il trattamento. Permettere all'animale di abbassarsi della temperatura corporea, come avviene in anestesia, può influire sui risultati complessivi, rispetto alla dose termica del tessuto da trattare.
In questo manoscritto, discutiamo i metodi utilizzati per progettare e costruire un versatile sistema di ipertermia magnetica a nanoparticelle, nonché importanti fattori d'uso che devono essere considerati. Il sistema descritto consente la somministrazione robusta, coerente, biologicamente appropriata, sicura e ben controllata dell'ipertermia di nanoparticelle magnetiche. Infine, va notato che gli studi mNPH che conduciamo spesso coinvolgono altre terapie come radioterapia, chemioterapia e immunoterapia. Affinché questi risultati siano significativi, è importante determinare in che modo il calore erogato può influenzare l'efficacia e/o la sicurezza-tossicità di altre modalità (o viceversa) e il benessere dell'animale. Per questo motivo e per le situazioni dosimetriche e terapeutiche precedentemente menzionate, è essenziale prestare la massima attenzione all'accuratezza del dosaggio dell'ipertermia con nanoparticelle magnetiche e alle misurazioni continue della temperatura del nucleo e del target. L'obiettivo di questo protocollo è fornire un metodo e una descrizione semplici e coerenti per la somministrazione di ipertermia magnetica a nanoparticelle sicura ed efficace.

<table><tbody><tr><td>.25% Tripsina</td><td>Corning</td><td>45000-664</td><td>disponibile da molte aziende</td></tr><tr><td>Provette da 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf 22363204</td><td>disponibile da molte aziende</td></tr><tr><td>B16F10 cellule di melanoma murino</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>C57/Bl6 topi</td><td>Charles river</td><td>027C57BL/6</td><td>topi femmina di 6 settimane</td></tr><tr><td>Chiller</td><td>Thermal Care</td><td>Refrigeratore serie NQ 5</td><td>che raffredda la bobina</td></tr><tr><td>Fluido refrigerante</td><td>Dow Chemical Company</td><td>Dowtherm SR-1</td><td>Fluido di raffreddamento dell'antenna</td></tr><tr><td>Fetale Siero bovino fetale</td><td>Hyclone</td><td>SH30071</td><td>disponibile da molte aziende</td></tr><tr><td>Sonde in fibra ottica, software e telaio</td><td>Software FISO</td><td></td><td>FISO evolution utilizzato per leggere le temperature</td></tr><tr><td>Telecamera IR</td><td>Flir</td><td></td><td>telecamera a infrarossi per monitorare il riscaldamento involontario</td></tr><tr><td>di nanoparticelle di ossido di ferro</td><td>micromod Partikeltechnologie GmbH</td><td>Bionizzato NanoFerrite</td><td>destrano rivestito di ossido di ferro nanoparticelle</td></tr><tr><td>bobina di topo, solenoide</td><td>Fluxtrol</td> costruito <td>su misura</td><td></td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina</td><td>Corning</td><td>45000-652</td><td>disponibile da molte aziende</td></tr><tr><td>generatore RF</td><td>Huttinger</td><td>Fonte di alimentazione</td> <td>TIG 10/300</td></tr><tr><td>Supporto RPMI</td><td>Corning</td><td>45000-396</td><td>disponibile da molte aziende</td></tr></tbody></table>

somministrazione in vitro e in vivo dell'ipertermia magnetica con nanoparticelle utilizzando un sistema di consegna personalizzato

In Vitro and In Vivo Delivery of Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using a Custom-Built Delivery System

L'ipertermia è stata a lungo utilizzata nel trattamento del cancro. Le tecniche sono variate dall'inserimento intratumorale di barre di ferro calde, a nanoparticelle magnetiche mirate agli anticorpi tumorali erogate per via sistemica, a temperature da 39 ° C (livello di febbre) a 1.000 ° C (elettrocauterizzazione) e tempi di trattamento da secondi a ore. La relazione temperatura-tempo (dose termica) detta l'effetto con alte dosi termiche con conseguente ablazione tissutale e dosi termiche più basse con conseguenti effetti subletali come aumento del flusso sanguigno, accumulo di farmaci e stimolazione immunitaria. Una delle terapie mediche attuali più promettenti è l'ipertermia con nanoparticelle magnetiche (mNPH). Questa tecnica prevede l'attivazione di nanoparticelle magnetiche, che possono essere veicolate sistemicamente o intratumoralmente, con un campo magnetico alternato non invasivo e non tossico. La dimensione, la costruzione e l'associazione delle nanoparticelle magnetiche e la frequenza e l'intensità del campo magnetico sono i principali determinanti del riscaldamento. Abbiamo sviluppato strumentazione e tecniche sofisticate per fornire ipertermia magnetica riproducibile con nanoparticelle in modelli animali grandi e piccoli e cellule in coltura. Questo approccio, che utilizza il monitoraggio continuo della temperatura in tempo reale in più posizioni, consente la somministrazione di dosi termiche ben definite al tessuto bersaglio (tumore) o alle cellule, limitando al contempo il riscaldamento dei tessuti non bersaglio. Il controllo e il monitoraggio precisi della temperatura, in più siti, e l'uso dell'algoritmo standard del settore (minuti equivalenti cumulativi a 43 °C / CEM43), consente una determinazione e una quantificazione accurate della dose termica. Il nostro sistema, che consente un'ampia varietà di temperature, dosi termiche ed effetti biologici, è stato sviluppato attraverso una combinazione di acquisizioni commerciali e sviluppi interni di ingegneria e biologia. Questo sistema è stato ottimizzato in modo da consentire la rapida conversione tra tecniche ex vivo, in vitro e in vivo. L'obiettivo di questo protocollo è dimostrare come progettare, sviluppare e implementare una tecnica e un sistema efficaci per fornire ipertermia riproducibile e accurata con terapia magnetica con nanoparticelle (mNP).

Studi in vitro Le cellule raggiungeranno e manterranno la temperatura e la dose termica desiderate solo se la quantità e la concentrazione delle nanoparticelle magnetiche / ferro e dell'AMF sono opportunamente abbinate. Quando si utilizzano nanoparticelle magnetiche per riscaldare le cellule in vitro (e in vivo), va notato che per ottenere l'ipertermia in cellule con nanoparticelle magnetiche internalizzate, sarà necessario un livello specifico di mNP / Fe intracellulare e sarà necessario il numero e ...

Questo protocollo presenta le tecniche e la metodologia necessarie per la consegna accurata dell'ipertermia delle nanoparticelle magnetiche utilizzando un sofisticato sistema di consegna e monitoraggio.

Somministrazione in vitro e in vivo dell'ipertermia magnetica con nanoparticelle utilizzando un sistema di consegna personalizzato

Hyperthermia has long been used in the treatment of cancer. Techniques have varied from the intra-tumoral insertion of hot iron rods, to systemically ...

Questo metodo è significativo perché fornisce il modo più robusto e riproducibile per fornire il trattamento di ipertermia con nanoparticelle magnetiche in modelli preclinici. Questa tecnica consente l'erogazione precisa e coerente dell'ipertermia con nanoparticelle monitorando e controllando accuratamente l'ambiente locale, la fisiologia animale e la dose termica. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che il riscaldamento delle nanoparticelle deve rimanere confinato al tessuto bersaglio.È essenziale utilizzare una termometria abbondante e appropriata per garantire riproducibilità e sicurezza. 24 ore dopo la piastra, le cellule di melanoma murino B16 F10 aggiungono nanoparticelle magnetiche a una concentrazione finale di tre milligrammi di ione per millilitro. Assicurarsi che le nanoparticelle siano distribuite uniformemente in tutto il pozzetto creando in anticipo una soluzione stock di terreni e nanoparticelle magnetiche.48 ore dopo l'aggiunta delle nanoparticelle, aggiungere 0,5 millilitri di tripsina a ciascun pozzetto da trattare e agitare delicatamente la piastra. Usa un microscopio per verificare che le cellule siano staccate. Quindi, aggiungere un millilitro di terreno a ciascun pozzetto e raccogliere tutte le cellule in provette da 1,5 millilitri utilizzando una provetta separata chiaramente etichettata per ciascun pozzetto.Centrifugare i tubi a 60 G per due o tre minuti per pellettare le cellule. Quindi posizionare i tubi nel distanziatore pieno d'acqua all'interno della bobina. Impostare la temperatura del bagno d'acqua per mantenere il media e il pallet delle celle a 37 gradi Celsius.Impostare sonde di temperatura in fibra ottica separate per monitorare la temperatura all'interno del tubo e del bagno d'acqua. Accendere il refrigeratore e verificare che il liquido di raffreddamento scorra attraverso la serpentina. Quindi accendere la fonte di alimentazione e regolare la percentuale del massimo sul campo desiderato.Azionare la bobina del solenoide a 14 giri alimentata da un generatore da 10 kilowatt a 165 kilohertz e 23,87 kiloampere per metro. Trattare le cellule fino al raggiungimento di una dose termica precedentemente determinata dal protocollo. Dopo il trattamento, risospendere le cellule pellettate nel mezzo all'interno delle provette e riplaccarle in nuove piastre a sei pozzetti chiaramente etichettate.Dopo aver anestetizzato il topo, pulire il tumore con una salvietta imbevuta di alcol. Iniettare le nanoparticelle magnetiche nel tumore tre ore prima del trattamento con AMF. Dopo tre ore, anestetizzare nuovamente il topo e verificare la mancanza di risposta ai riflessi di raddrizzamento.Rimuovere il marchio auricolare o qualsiasi altro oggetto metallico sul mouse e posizionare delicatamente una sonda di temperatura in fibra ottica lubrificata nel retto. Posizionare il catetere nel tumore. Rimuovere l'ago.Quindi tagliare il catetere in modo che non sporga troppo dal tumore. Inserire una sonda di temperatura in fibra ottica a tre sensori nel catetere, che proteggerà i sensori. Fissare la sonda rettale e intratumorale alla coda dell'animale.Metti il topo in un tubo da 50 millilitri che dovrebbe avere un foro vicino alla testa dove l'anestesia può essere collegata e somministrata. Posizionare il tubo all'interno della configurazione della bobina e ricollegare l'anestesia. Posizionare una sonda di temperatura a fibre ottiche senza stringere nel tubo per misurare la temperatura dell'ambiente.Quindi accendere il refrigeratore e assicurarsi che il liquido di raffreddamento venga fatto circolare. Verificare che il software del computer visualizzi le varie temperature e iniziare la registrazione per consentire la visualizzazione in tempo reale di un calcolo CEM43 in cui la dose CEM43 richiesta avrebbe dovuto essere precedentemente determinata. Accendere il magnete a una percentuale di potenza bassa e assicurarsi che le sonde di temperatura in fibra ottica registrino le variazioni di temperatura.In breve, che la temperatura interna dell'animale rimanga a 38 gradi Celsius, regolandola con la camicia d'aria condizionata. Regola l'intensità del campo magnetico modificando la potenza che controlla il livello di temperatura nel tumore. Spegnere l'AMF una volta raggiunta la dose desiderata.Rimuovere il tubo dalla bobina e rimuovere il mouse dal tubo. Quindi, spegnere il refrigeratore. Estrarre le sonde e i cateteri e, se necessario, etichettare l'animale con un nuovo marchio auricolare in metallo.Monitorare il topo durante il recupero dall'anestesia, assicurandosi che riprenda il comportamento normale e che non ci siano complicazioni. Per l'ipotermia in vivo, è essenziale posizionare il maggior numero possibile di sonde di temperatura in fibra ottica in siti strategici per una valutazione dell'efficacia e della sicurezza in tempo reale. Queste sonde consentono di registrare la temperatura durante l'esperimento, consentendo un'accurata dosimetria e storia termica.Qui vengono mostrate le curve generate durante un esperimento in vivo, evidenziando la capacità di monitorare attentamente la temperatura e regolare il sistema per mantenere le temperature del tumore entro l'intervallo desiderato. I grafici del vulcano mostrano geni differenziali espressi dopo il trattamento di ipertermia con nanoparticelle magnetiche in vitro e in vivo, dimostrando come le tecniche molecolari possano essere utilizzate per monitorare gli effetti dell'ipertermia. Per un'erogazione costante del trattamento è necessario un monitoraggio accurato delle temperature tumorali, della temperatura interna degli animali e della dose termica.Dopo l'ipertermia, possono essere eseguite diverse analisi per comprendere l'effetto e il meccanismo del trattamento. E altre terapie possono essere implementate per un maggiore effetto terapeutico.

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Prelevare le cellule microgliali murine aderenti in una piastra multipozzetto.Aggiungere nanoparticelle magnetiche rivestite di acido poliacrilico (MNP) al pozzetto del test, lasciando un altro pozzetto non trattato come controllo.Incubare le cellule per consentire l'assorbimento di MNP tramite endocitosi, consentendone l'internalizzazione.Lavare con tampone per rimuovere gli MNP non legati.Aggiungere una soluzione enzimatica per staccare le cellule.Trasferire le celle staccate in provette e...

Danno cellulare indotto dall'ipertermia magnetica nelle cellule microgliali murine

Apparecchiatura compatibile MRI progettato su misura basato sul laser riscaldamento è stato sviluppato per fornire riscaldamento locale di tumori sottocutanei per attivare il rilascio di agenti di liposomi termosensibili specificamente alla regione tumorale.

Appositamente studiata apparecchi di riscaldamento a base laser per la Release Innescata di Cisplatino da termosensibile liposomi con Risonanza Magnetica Guidance Immagine

Questo manoscritto descrive l'erogazione efficiente, non virale miR alle cellule endoteliali da un vettore PEI / MNP e la loro magnetizzazione. Così, oltre alla modificazione genetica, questo approccio consente di orientamento delle cellule magnetica e risonanza magnetica rilevabilità. La tecnica può essere utilizzata per migliorare le caratteristiche dei prodotti cellulari terapeutici.

preparazione e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caratterizzazione di magnetizzato miR-modificato cellule endoteliali

Questo manoscritto descrive la preparazione di microgeli magnetici e sensibili alla temperatura attraverso un'emulsione indotta dalla temperatura senza reazione chimica. Questi microgeli sensibili sono stati sintetizzati mescolando le nanoparticelle di poli ( N- isopropilacrilammide) (PNIPAAm), polietileniminina (PEI) e Fe 3 O 4 -NH 2 per il potenziale utilizzo in liberazione a rilascio di sostanze magnetiche e termiche.

Poli sensibile magnetico e termico (<em&gt; N</em&gt; -isopropilacrilammide) per il rilascio controllato magneticamente attivato

Qui viene presentato un protocollo per la fabbricazione di microbolle a guscio di nanoparticelle di ossido di ferro (NSM) attraverso l'autoassemblaggio, la sinergizzazione della reattività magnetica, acustica e ottica in un'unica piattaforma nanoterapeutica per l'ipertermia magnetica e la terapia del cancro combinata fototermica.

Microbolle magnetiche, acustiche e ottiche a tripla risposta per ipertermia magnetica e terapia del cancro combinata pototermica

Presentato qui è un protocollo per utilizzare l'ipertermia controllata, generata da ultrasuoni focalizzati ad alta intensità guidati da risonanza magnetica, per innescare il rilascio di farmaci da liposomi sensibili alla temperatura in un modello murino di rabdomiosarcoma.

Ipertermia generata da ultrasuoni focalizzati ad alta intensità guidata da risonanza magnetica: un metodo di trattamento fattibile in un modello di rabdomiosarcoma murino

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Consegna di nanoparticelle di un carico utile di oligonucleotidi in un modello animale multiforme di glioblastoma

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Induzione di una lieve ipertermia mirata in modelli di tumore murino attraverso la conversione fototermica della luce nel vicino infrarosso mediante nanobarre d'oro intratumorali

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Somministrazione in vitro e in vivo dellipertermia magnetica con nanoparticelle utilizzando un sistema di consegna personalizzato (Video) | JoVE Journal

Somministrazione in vitro e in vivo dell'ipertermia magnetica con nanoparticelle utilizzando un sistema di consegna personalizzato

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