Somministrazione in vitro e in vivo dell'ipertermia magnetica con nanoparticelle utilizzando un sistema di consegna personalizzato

Questo metodo è significativo perché fornisce il modo più robusto e riproducibile per fornire il trattamento di ipertermia con nanoparticelle magnetiche in modelli preclinici. Questa tecnica consente l'erogazione precisa e coerente dell'ipertermia con nanoparticelle monitorando e controllando accuratamente l'ambiente locale, la fisiologia animale e la dose termica. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che il riscaldamento delle nanoparticelle deve rimanere confinato al tessuto bersaglio.

È essenziale utilizzare una termometria abbondante e appropriata per garantire riproducibilità e sicurezza. 24 ore dopo la piastra, le cellule di melanoma murino B16 F10 aggiungono nanoparticelle magnetiche a una concentrazione finale di tre milligrammi di ione per millilitro. Assicurarsi che le nanoparticelle siano distribuite uniformemente in tutto il pozzetto creando in anticipo una soluzione stock di terreni e nanoparticelle magnetiche.

48 ore dopo l'aggiunta delle nanoparticelle, aggiungere 0,5 millilitri di tripsina a ciascun pozzetto da trattare e agitare delicatamente la piastra. Usa un microscopio per verificare che le cellule siano staccate. Quindi, aggiungere un millilitro di terreno a ciascun pozzetto e raccogliere tutte le cellule in provette da 1,5 millilitri utilizzando una provetta separata chiaramente etichettata per ciascun pozzetto.

Centrifugare i tubi a 60 G per due o tre minuti per pellettare le cellule. Quindi posizionare i tubi nel distanziatore pieno d'acqua all'interno della bobina. Impostare la temperatura del bagno d'acqua per mantenere il media e il pallet delle celle a 37 gradi Celsius.

Impostare sonde di temperatura in fibra ottica separate per monitorare la temperatura all'interno del tubo e del bagno d'acqua. Accendere il refrigeratore e verificare che il liquido di raffreddamento scorra attraverso la serpentina. Quindi accendere la fonte di alimentazione e regolare la percentuale del massimo sul campo desiderato.

Azionare la bobina del solenoide a 14 giri alimentata da un generatore da 10 kilowatt a 165 kilohertz e 23,87 kiloampere per metro. Trattare le cellule fino al raggiungimento di una dose termica precedentemente determinata dal protocollo. Dopo il trattamento, risospendere le cellule pellettate nel mezzo all'interno delle provette e riplaccarle in nuove piastre a sei pozzetti chiaramente etichettate.

Dopo aver anestetizzato il topo, pulire il tumore con una salvietta imbevuta di alcol. Iniettare le nanoparticelle magnetiche nel tumore tre ore prima del trattamento con AMF. Dopo tre ore, anestetizzare nuovamente il topo e verificare la mancanza di risposta ai riflessi di raddrizzamento.

Rimuovere il marchio auricolare o qualsiasi altro oggetto metallico sul mouse e posizionare delicatamente una sonda di temperatura in fibra ottica lubrificata nel retto. Posizionare il catetere nel tumore. Rimuovere l'ago.

Quindi tagliare il catetere in modo che non sporga troppo dal tumore. Inserire una sonda di temperatura in fibra ottica a tre sensori nel catetere, che proteggerà i sensori. Fissare la sonda rettale e intratumorale alla coda dell'animale.

Metti il topo in un tubo da 50 millilitri che dovrebbe avere un foro vicino alla testa dove l'anestesia può essere collegata e somministrata. Posizionare il tubo all'interno della configurazione della bobina e ricollegare l'anestesia. Posizionare una sonda di temperatura a fibre ottiche senza stringere nel tubo per misurare la temperatura dell'ambiente.

Quindi accendere il refrigeratore e assicurarsi che il liquido di raffreddamento venga fatto circolare. Verificare che il software del computer visualizzi le varie temperature e iniziare la registrazione per consentire la visualizzazione in tempo reale di un calcolo CEM43 in cui la dose CEM43 richiesta avrebbe dovuto essere precedentemente determinata. Accendere il magnete a una percentuale di potenza bassa e assicurarsi che le sonde di temperatura in fibra ottica registrino le variazioni di temperatura.

In breve, che la temperatura interna dell'animale rimanga a 38 gradi Celsius, regolandola con la camicia d'aria condizionata. Regola l'intensità del campo magnetico modificando la potenza che controlla il livello di temperatura nel tumore. Spegnere l'AMF una volta raggiunta la dose desiderata.

Rimuovere il tubo dalla bobina e rimuovere il mouse dal tubo. Quindi, spegnere il refrigeratore. Estrarre le sonde e i cateteri e, se necessario, etichettare l'animale con un nuovo marchio auricolare in metallo.

Monitorare il topo durante il recupero dall'anestesia, assicurandosi che riprenda il comportamento normale e che non ci siano complicazioni. Per l'ipotermia in vivo, è essenziale posizionare il maggior numero possibile di sonde di temperatura in fibra ottica in siti strategici per una valutazione dell'efficacia e della sicurezza in tempo reale. Queste sonde consentono di registrare la temperatura durante l'esperimento, consentendo un'accurata dosimetria e storia termica.

Qui vengono mostrate le curve generate durante un esperimento in vivo, evidenziando la capacità di monitorare attentamente la temperatura e regolare il sistema per mantenere le temperature del tumore entro l'intervallo desiderato. I grafici del vulcano mostrano geni differenziali espressi dopo il trattamento di ipertermia con nanoparticelle magnetiche in vitro e in vivo, dimostrando come le tecniche molecolari possano essere utilizzate per monitorare gli effetti dell'ipertermia. Per un'erogazione costante del trattamento è necessario un monitoraggio accurato delle temperature tumorali, della temperatura interna degli animali e della dose termica.

Dopo l'ipertermia, possono essere eseguite diverse analisi per comprendere l'effetto e il meccanismo del trattamento. E altre terapie possono essere implementate per un maggiore effetto terapeutico.