Name: Plasmodium falciparum Coltura di gametociti e infezione da zanzare attraverso lalimentazione artificiale della membrana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-03T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Impara a coltivare gametociti infettivi di Plasmodium falciparum e a infettare le zanzare mediante alimentazione artificiale della membrana. Questo metodo facilita lo studio della biologia della trasmissione della malaria.

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Gli autori ringraziano Bloomberg Philanthropies per il sostegno finanziario al Johns Hopkins Malaria Research Institute (JHMRI). Questo lavoro non sarebbe stato possibile senza l'esperienza fornita dalle strutture di base per insetti e parassitologia JHMRI.

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<li>Swearingen, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+Plasmodium+Sporozoite+Surface%3A+Identification+of+Surface-Exposed+Proteins+and+Demonstration+of+Glycosylation+on+CSP+and+TRAP+by+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Interrogating the Plasmodium Sporozoite Surface: Identification of Surface-Exposed Proteins and Demonstration of Glycosylation on CSP and TRAP by Mass Spectrometry-Based Proteomics.</a> PLoS Pathogens. 12 (4), 1005606(2016).</li>
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<li>Miura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inter-laboratory+comparison+of+standard+membrane-feeding+assays+for+evaluation+of+malaria+transmission-blocking+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">An inter-laboratory comparison of standard membrane-feeding assays for evaluation of malaria transmission-blocking vaccines.</a> Malaria Journal. 15, 463(2016).</li>
<li>Miura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualification+of+Standard+Membrane-Feeding+Assay+with+Plasmodium+falciparum+Malaria+and+Potential+Improvements+for+Future+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Qualification of Standard Membrane-Feeding Assay with Plasmodium falciparum Malaria and Potential Improvements for Future Assays.</a> PLoS One. 8 (3), 57909(2013).</li>
</ol>

Gli Autori non hanno nulla da rivelare.

I metodi qui descritti sono stati utilizzati con successo presso il Johns Hopkins Malaria Research Institute per più di 10 anni15,16,17,18,19,20,21,22. I gametociti prodotti utilizzando questo protocollo sono stati utilizzati per saggi gametocitocidi ad alt...

La malaria è causata dai parassiti Plasmodium e viene trasmessa ai loro ospiti vertebrati attraverso il morso infettivo delle zanzare Anopheles femminili. Secondo il rapporto 2019 dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), ci sono stati circa 405.000 decessi, su un totale di 228 milioni di casi di malaria1. La maggior parte dei decessi correlati alla malaria sono stati concentrati nella regione africana, specialmente tra i bambini sotto i cinque anni di età. Mentre il tasso di incidenza complessivo della malaria è diminuito a livello globale dal 2010, negli ultimi anni il declino si è stabilizzato e sono urgentemente necessarie ulteriori strategie di controllo per eliminare la malattia.
Gli stadi ciclici del sangue asessuato dei parassiti della malaria causano patogenesi della malattia e un piccolo sottoinsieme di questi si differenzia in gametociti femminili e maschili. I gametociti del Plasmodium falciparum sono unici in natura in quanto impiegano 7-10 giorni per svilupparsi attraverso cinque stadi morfologicamente distinti. I gametociti immaturi dallo stadio I al IV sono sequestrati nel parenchima del midollo osseo e rimangono in gran parte assenti dalla circolazione periferica2,3,4,5. Gli eritrociti infettati da gametociti maturi allo stadio V vengono rilasciati nel flusso sanguigno e circolano liberamente per essere assorbiti dalle zanzare. Una volta all'interno del midgut della zanzara, i gametociti vengono attivati, attraverso un cambiamento di temperatura e l'esposizione all'ambiente midgut, si trasformano in gameti femminili e maschili e iniziano lo sviluppo degli stadi di zanzara, che culmina con gli stadi infettivi degli sporozoiti nelle ghiandole salivari della zanzara6,7.
Da quando Trager e Jenson8 hanno descritto un metodo standardizzato per la coltura di P. falciparum, gli studi sugli stadi del sangue asessuato sono notevolmente progrediti. Tuttavia, la mancanza di un sistema di coltura affidabile per le fasi sessuali ha reso difficile lo studio dei gametociti di P. falciparum, della biologia della trasmissione e degli stadi delle zanzare. Negli ultimi anni sono stati pubblicati diversi metodi che hanno aiutato i laboratori a stabilire colture di gametociti9,10,11,12. Questo manoscritto descrive un protocollo standardizzato e affidabile per la coltura di gametociti di P. falciparum che può rappresentare una risorsa preziosa per la comunità di ricerca sulla malaria. Questo metodo consente la robusta produzione di gametociti maturi e infettivi che, insieme a un protocollo standardizzato di alimentazione delle zanzare, si traduce in un'infettività delle zanzare altamente affidabile. Questi metodi sono stati stabiliti per mantenere la fornitura ininterrotta di gametociti e parassiti dello stadio di zanzara. In questo manoscritto, descriviamo un protocollo di coltura dei gametociti approfondito (Figura 1), la preparazione di alimentatori a membrana di vetro e l'infezione delle zanzare usando questi alimentatori a membrana (Figura 2), la dissezione del midgut (Figura 3) e la ghiandola salivare delle zanzare (Figura 4) e la quantificazione dell'infezione nella zanzara dopo la dissezione del midgut e della ghiandola salivare.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di zucchero</td><td></td><td></td><td></td>10%</tr><tr><td>Pipetta sierologica</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Tubo conico da 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica da 1 ml</td><td>Falcon</td><td>357521</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica da 25 ml</td><td>Falcon</td><td>357535</td><td></td></tr><tr><td>37 gradi C Incubatore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubo conico</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>pipetta sierologica da 5 ml</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>piastre per coltura tissutale a 6 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta in vetro da 9"</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Anopheles Mosquitoes</td><td>JHMRI, nucleo dell'insetto</td><td>Usiamo A. stephensi o A. gambiae (chiglia)</td>contatore cellulare Bagno d'acqua circolante pinza a punta fine Fisherbrand 12-000-122 Essiccatore in vetro Sigma GS1L Essiccatore in vetro Alimentatore a membrana in vetro <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG183570</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini</td><td>Fisherbrand</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Sangue umano O+</td><td>JHU</td><td></td><td>Lavare i globuli rossi tre volte con RPMI e conservare in frigorifero al 50% di ematocrito</td></tr><tr><td>Siero umano O+</td><td>Banca</td><td></td> del sangue interstatale <td>Pool di almeno 6 unità di siero da donatori diversi e congelare le aliquote a -20& gradi; C.</td></tr><tr><td>Ipoxantina</td><td>Sigma</td><td>H9337</td><td>Produce 500 volte lo stock in 1M NaOH</td></tr><tr><td>Mercurochrome</td><td>Sigma</td><td>M7011</td><td>Preparare una soluzione madre all'1% in PBS che può essere diluita allo 0,1% quando necessario</td></tr><tr><td>Microscopio per micropipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td></td><td>Qualsiasi microscopio con obiettivo 10x, 40x e 100x funzionerà.</td></tr><tr><td>Coppe per zanzare Coppe</td><td>Neptune</td> N-acetilglucosamina <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>A3286</td><td>Opzionale e necessario solo quando sono richiesti gametociti puri.</td></tr><tr><td>Rete</td><td></td><td></td><td>Assicurarsi che possa contenere zanzare e consentire l'alimentazione del sangue</td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td></td><td></td> Parafilm PBS Thermo Scientific 249964 <td></td></tr><tr><td>Punte</td><td></td><td></td><td></td>per pipette</tr><tr><td>Pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td>Plasmodium falciparum NF54 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BEI Resources</td><td>MRA-1000</td><td>Congelare un gran numero di colture di passaggio precoce per assicurarsi di avere una fornitura costante</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>CV-041-CV</td><td>Il terreno contiene glutammina e HEPES</td></tr><tr><td>Scaldavetrini</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td>Opzionale per i terreni, aggiungere solo quando si utilizza la miscela di gas malaria durante il</td></tr><tr>bagno <td></td><td>d'acqua</td> di incubazione della coltura<td></td><td></td></tr><tr><td>Acido Xanturenico</td><td>Sigma</td><td>D120804</td><td>Per terreni di flagellazione</td></tr></tbody></table>

plasmodium falciparum coltura di gametociti e infezione da zanzare attraverso l'alimentazione artificiale della membrana

Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding

La malaria rimane uno dei più importanti problemi di salute pubblica, causando morbilità e mortalità significative. La malaria è una malattia trasmessa dalle zanzare trasmessa attraverso un morso infettivo dalla zanzara femmina Anopheles. Il controllo della malaria alla fine si baserà su una moltitudine di approcci, che includono modi per bloccare la trasmissione da, attraverso e dalle zanzare. Per studiare in laboratorio gli stadi delle zanzare dei parassiti della malaria, abbiamo ottimizzato un protocollo per la coltura di gametociti di Plasmodium falciparum altamente infettivi, uno stadio parassitario necessario per la trasmissione dall'ospite umano al vettore della zanzara. I gametociti di P. falciparum maturano attraverso cinque fasi morfologicamente distinte, che richiedono circa 1-2 settimane. La coltura dei gametociti descritta in questo protocollo viene completata in 15 giorni e sono infettive per le zanzare dai giorni 15-18. Questi protocolli sono stati sviluppati per mantenere un ciclo continuo di infezione dei gametociti competenti e per mantenere l'apporto ininterrotto degli stadi di zanzara del parassita. Qui, descriviamo la metodologia della coltura dei gametociti e come infettare le zanzare con questi parassiti usando alimentatori a membrana di vetro.

Qui presentiamo i risultati di una serie di alimentazioni a membrana utilizzando colture di gametociti P. falciparum NF54 generate utilizzando il protocollo sopra (vedi (Figura 5). La coltura dei gametociti è stata iniziata con circa lo 0,5% di coltura asessuata a stadio misto il giorno 0, che è cresciuta fino a un picco di parassitemia di circa il 15% entro il giorno 4 e il giorno 5. Come mostrato nella Figura 5A a questa alta parassitemia, i parassiti...

Indagini dettagliate sugli stadi delle zanzare dei parassiti della malaria sono fondamentali per progettare efficaci strategie di blocco della trasmissione. Questo protocollo dimostra come coltura efficacemente gametociti infettivi e quindi nutrire questi gametociti alle zanzare per generare stadi di zanzara di P. falciparum.

Plasmodium falciparum Coltura di gametociti e infezione da zanzare attraverso l'alimentazione artificiale della membrana

Malaria remains one of the most important public health problems, causing significant morbidity and mortality. Malaria is a mosquito borne disease ...

I gametociti sono responsabili della trasmissione del parassita della malaria. La generazione di gametociti infettivi in laboratorio è fondamentale per studiare la biologia della trasmissione negli stadi delle zanzare e per generare sporozoiti per i risultati degli stadi successivi. Questi metodi sono semplici da adottare per qualsiasi laboratorio e la dimostrazione visiva aiuterà a condividere queste procedure con la comunità mondiale della malaria.A dimostrare la procedura con me saranno i miei colleghi, Godfree Mlambo, il nostro ricercatore senior associato, e Sachie Kanatani, il nostro borsista post-dottorato, entrambi del Johns Hopkins Malaria Research Institute. Per impostare una coltura di gametociti, centrifugare cinque millilitri di coltura di alimentazione in una centrifuga e risospendere il pellet in 30 millilitri di terreno completo. Mescolare 1,2 millilitri di globuli rossi impacchettati con il contenuto della provetta e aggiungere cinque millilitri della sospensione risultante a ciascun pozzetto di una piastra di coltura a sei pozzetti.Quindi mettere il piatto in un barattolo di candele a 37 gradi Celsius. Ogni giorno per i successivi 15-18 giorni, aspirare attentamen

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La tubercolosi e la malaria sono due delle infezioni più diffuse negli esseri umani e le principali cause di morbilità e mortalità nelle popolazioni povere nei tropici. Abbiamo stabilito un sistema modello sperimentale per lo studio esito della malaria, tubercolosi coinfezione nei topi dopo la sfida con entrambi i patogeni tramite il loro percorso naturale di infezione.

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Il test standard di alimentazione a membrana (SMFA) è considerato il gold standard per la valutazione e l'identificazione di potenziali composti antimalarici. Questo sistema di alimentazione artificiale viene utilizzato per infettare le zanzare per valutare ulteriormente gli effetti di tali composti sull'intensità e la prevalenza del parassita Plasmodium falciparum .

Test standard di alimentazione a membrana per la rilevazione dell'infezione da Plasmodium falciparum in vettori di zanzare Anopheles

Qui descriviamo un nuovo metodo per aiutare a chiarire i meccanismi dell'immunità cellulare al Plasmodium durante la fase ematica dell'infezione. Questo è un test in vitro che misura l'uccisione dei globuli rossi infetti da parte dei linfociti citotossici.

In vitro Saggio dell'uccisione dei globuli rossi infetti da plasmodio da parte di linfociti citotossici

La malaria si trasmette attraverso l'inoculazione dello stadio sporozoite di Plasmodium da parte di zanzare infette. Il Plasmodium transgenico ci ha permesso di comprendere meglio la biologia della malaria e ha contribuito direttamente agli sforzi di sviluppo del vaccino contro la malaria. In questo articolo descriviamo una metodologia semplificata per generare sporozoiti transgenici di Plasmodium berghei .

Generazione di sporozoiti geneticamente modificati di Plasmodium berghei

La genetica chimica prevede la sostituzione di un residuo gatekeeper con un amminoacido contenente una catena laterale diversa nel locus bersaglio. Qui, abbiamo generato un parassita mutante contenente un allele ipomorfico di cdpk1 e identificato le vie compensatorie adottate dal parassita nel background mutante.

Comprensione dello sviluppo di vie compensatorie in un parassita mutante della malaria che ospita allele ipomorfico di chinasi simili alle piante

Lo sviluppo sessuale del Plasmodium avviene nell'intestino medio della zanzara. Prendere di mira le fasi sessuali del parassita è una strategia promettente per bloccare la trasmissione. Abbiamo sviluppato Ookluc, un P. berghei transgenico che esprime nanoluciferasi dopo la formazione dello zigote, consentendo lo screening ad alto rendimento di composti che bloccano la trasmissione. Questo articolo descrive in dettaglio i metodi per lo screening utilizzando Ookluc.

Ookluc: una linea di Plasmodium berghei per l'identificazione di composti che bloccano la trasmissione

Impara a coltivare gametociti infettivi di Plasmodium falciparum e a infettare le zanzare mediante alimentazione artificiale della membrana. Questo metodo facilita lo studio della biologia della trasmissione della malaria.

Plasmodium falciparum Coltura di gametociti e infezione da zanzare attraverso l'alimentazione artificiale della membrana

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