Name: Quantificazione del virus della rabbia in varie strutture cerebrali bovine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Impara a quantificare il virus della rabbia nelle strutture cerebrali bovine usando qRT-PCR e trascrizione in vitro. Questo metodo fornisce un protocollo affidabile per la ricerca e la diagnostica veterinaria.

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Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto nazionale di ricerca agricola, forestale e zootecnica (INIFAP). Ringraziamo Jerzayn Fraustro Esquivel per la sua collaborazione nello sviluppo del video associato a questo documento.

Questo studio è stato approvato e condotto in stretta conformità con le raccomandazioni per l'uso di animali fornite dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) del Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA).
1. Campioni
<ol><li>Utilizzare diverse aree del cervello sezionate da 6 diversi cervelli bovini positivi alla rabbia per l'analisi RT-PCR.</li>
</ol>2. Anticorpi fluorescenti diretti (DLA) per confermare la rabbia
NOTA: Il rilevamento dell'antigene della rabbia da parte del DFA è un metodo qualitativo per determinare la presenza della nucleoproteina della rabbia utilizzando anticorpi etichettati con fluoresceina. Il test è stato eseguito utilizzando il protocollo fornito daDean et al.
<ol><li>Fai due impressioni da ogni tessuto sezionato da diverse strutture cerebrali su uno scivolo sterile di circa 15 mm di diametro. Utilizzare un applicatore di legno per spalmare una porzione di circa 3 mm3 del tessuto sullo scivolo sterile. Per creare lo striscio, premere delicatamente l'applicatore di legno contro lo scivolo manualmente.</li>
	<li>Fissare le diapositive di striscio campione sommergindo le diapositive in acetone al 100% per 1 h a -20 °C. Dopo l'incubazione, asciugare gli scivoli su un panno asciutto a 21 °C per 30 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 50 μL dell'anticorpo anti-nucleoproteina etichettato con fluoresceina a ogni striscio cerebrale con una diluizione 1:10 erogando attraverso una siringa.</li>
	<li>Incubare gli scivoli con il coniugato in una camera umida a 37 °C per 1 h.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, lavare gli scivoli due volte con acqua e con PBS per eliminare l'eccesso coniugato. Lasciare asciugare i vetrini a 21 °C. Pulire con cura per rimuovere il liquido in eccesso e quindi asciugare brevemente all'aria prima del montaggio.</li>
	<li>Aggiungere una goccia di glicerina fosfato al 50% per coprire la superficie della sezione, quindi coprire con un copripasci. Osservare le sezioni al microscopio a epifluorescenza con ingrandimento 40x.<ol>
<li>Elaborare e osservare i controlli positivi e negativi (controllo positivo: cervelli di topo inoculati con RABV; controlli negativi: cervello bovino rabv-negativo) allo stesso modo dei campioni.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Generazione di un controllo positivo per RT-PCR
<ol><li>Ottenere cellule BHK-21 dalla banca del germoplasma. Utilizzare cellule fino al70° passaggio per replicare il ceppo RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) utilizzando il passaggio 2.</li>
	<li>Mantenere e propagare le cellule BHK-21 in bottiglie contenenti mezzo essenziale minimo (MEM) integrato con siero fetale al polpaccio al 10% (FCS) a 37 °C in presenza di CO2 (5%) e in condizioni umide. Far crescere le cellule in contenitori di coltura25 cm 2 fino a raggiungere l'80% di confluenza e quindi sottocultura.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo di coltura dalle cellule e lavare la bottiglia con soluzione salina tamponata dal fosfato (PBS). Inoculare la coltura con 105 TCID/mL di ceppo RABV ERA. Incubare l'inoculo virale per 2 ore sotto costante scuotimento a 37 °C in presenza di CO2 (5%) e in condizioni umide.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo di infezione e aggiungere mem integrato con 5% (siero fetale bovino) SFB. Incubare per 72 ore a 37 °C in presenza di CO2 (5%) in condizioni di umidità.</li>
	<li>Raccogliere RABV 3 giorni dopo l'inoculazione quando le cellule mostrano effetti citopatici. Congelare le cellule infette e poi scongelarle a 4 °C per liscire le cellule. Raccogliere il mezzo dalla bottiglia, quindi posizionare le cellule in un tubo di centrifugazione per la centrifugazione a 1.050 x g per 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Conservare i supernatanti di RABV a -80 °C e preparare le aliquote di lavoro per lo stoccaggio a -70 °C.</li>
	<li>Intracerebrally inoculare il virus ottenuto nella fase precedente in topi CD1 femmina di 21 giorni. Utilizzare una siringa da 1 ml per inoculare 50 μL di soluzioni contenenti 106 MICLD50 (dose letale di coltura infettiva del topo 50%) dosi neitopi 22.</li>
</ol>4. Estrazione dell'RNA
NOTA: L'RNA totale è stato estratto direttamente dal cervello dei bovini utilizzando un metodo di estrazione organico secondo il seguente protocollo.
<ol><li>Utilizzare 100 mg di tessuto cerebrale da ogni struttura anatomica per estrarre l'RNA totale utilizzando un reagente disponibile in commercio contenente isotiocianato di guanidio.</li>
	<li>Omogeneizzare manualmente un totale di 100 mg di tessuto da ogni struttura in 1 mL del reagente isotiocianato di guanidio con vortice utilizzando un omogeneizzatore Dounce con un piccolo pestello all'interno del microtubo per 15 s alla massima velocità.</li>
	<li>Incubare i campioni sul ghiaccio per 5 minuti, quindi aggiungere 200 μL di cloroformio. Mescolare vigorosamente i campioni per 15 s, incubare sul ghiaccio per 2-3 minuti, quindi centrifugare a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Trasferire la fase acquosa in un tubo pulito e aggiungere 500 μL di alcol isopropile. Incubare i campioni per 15 minuti a 21 °C.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 10 min a 4 °C. Aspirare il supernatante acquoso pipettando. L'RNA isolato sarà presente come pellet nel tubo.</li>
	<li>Successivamente, lavare il pellet di RNA con 1 mL di 75% di etanolo mediante pipettazione e centrifugare a 7500 x g per 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Decantare il supernatante e asciugare all'aria il pellet di RNA a temperatura ambiente (21 °C). Successivamente, diluire il pellet in 50 μL di acqua priva di nucleasi.</li>
	<li>Determinare la concentrazione e la qualità dell'RNA a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro. Conservare l'RNA a -80 °C fino all'uso.</li>
	<li>Rimuovere il DNA dai campioni di RNA mediante digestione con la DNasi I. Aggiungere 2 U di DNasi I per 1 μg di RNA estratto nella fase precedente. Quindi, aggiungere 5 μL di tampone di reazione 10x e quindi incubare a 37 °C per 30 min. Inattivare la DNasi I aggiungendo 1 μL di EDTA alla miscela seguita da incubazione per 10 min a 65 °C.</li>
</ol>5. sintesi cDNA e PCR
<ol><li>Sintetizzare cDNA primo filamento usando oligo dT e transcriptasi inversa. Per ogni 1 μg di RNA, aggiungere 1 μL di oligo DT (500 μg/mL), 1 μL di miscela dNTP da 10 mM e acqua distillata priva di nucleasi ad un volume finale di 12 μL. Incubare la miscela a 65 °C per 5 min.</li>
	<li>Raffreddare la miscela di reazione a 4 °C. Centrifugare il tubo per 30 s a 1.050 x g, quindi aggiungere 4 μL di tampone di reazione, 2 μL 0,1 M DTT e 1 μL di inibitore della ribonucleasi (40 U/μL).</li>
	<li>Incubare la miscela di reazione a 37 °C per 2 minuti, quindi aggiungere 1 μL di transcriptasi inversa (200 U). Successivamente, incubare la miscela di reazione per 50 min a 37 °C, quindi inattivare la reazione a 70 °C per 15 minuti.</li>
	<li>Conservare il cDNA a -20 °C prima dell'uso. NOTA: Per verificare la qualità del cDNA sintetizzato, eseguire l'amplificazione di un frammento da 761 bp del gene RABV N prima di eseguire la sintesi in vitro. Utilizzare il protocollo descritto da Loza-Rubio etal.</li>
	<li>Eseguire la PCR utilizzando la DNA polimerasi Taq nelle seguenti condizioni. Eseguire la reazione impostata come segue: tampone Taq 10x contenente 20 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 1 U Taq polimerasi, 10 μM di ogni primer (SuEli+: 5′ cgtrgaycaatatgagtaca 3′ e SuEli-: 5′ caggctcraacatttctta 3′), 2,5 μL di cDNA e acqua ultrapura ad un volume finale di 50 μL.</li>
	<li>Eseguire l'amplificazione in un termociclo utilizzando le seguenti condizioni di ciclo: 95 ° C per 3 minuti; 35 cicli di 95 ° C per 30 s, 60 °C per 30 s e 72 °C per 1 min; un ciclo di 72 °C per 7 min.</li>
	<li>Valutare la presenza dei prodotti PCR da 761 bp utilizzando un gel di agarosio all'1%.</li>
</ol>6. Trascrizione in vitro
NOTA: La trascrizione in vitro genera mRNA di un gene bersaglio. Utilizzare una coppia di primer che amplifica il gene RABV N completo e uno che viene utilizzato come controllo positivo per il test qRT-PCR. Questi primer sono progettati per amplificare il gene RABV N completo e per aggiungere un promotore che riconosca la T7 polimerasi (TAATACGACTCACTATAG).
<ol><li>Per amplificare l'intero gene N RABV, utilizzare i primer Trans-Nrab avanti (5ʹ gatgagtcactcgaatatgtctt 3ʹ) e inverso (5ʹ caataatacgactcactatagggatggatgccgacaagatt 3ʹ) e un kit PCR ad alta fedeltà.<ol>
<li>Per ogni reazione, preparare un mix master PCR aggiungendo a un tampone di reazione del tubo PCR pulito 10x, 2 mM DMSO, 25 mM MgCl2, 10 mM dNTPs, 10 μM di ogni primer, 0,5 U di polimerasi ad alta fedeltà, 1,5 μL di cDNA (preparato nella fase 5) e acqua ultrapura ad un volume finale di 50 μL.</li>
		<li>Utilizzare un termociclo impostato sulle seguenti condizioni per l'amplificazione: 94 °C per 1 min; 4 cicli di 94 °C per 1 min, 40 °C per 1 min e 72 °C per 2 min; 35 cicli di 94 °C per 1 min, 60 °C per 1 min e 72 °C per 2 min; estensione finale di 72 °C per 2 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per utilizzare il prodotto PCR come modello per la sintesi in vitro e rimuovere i componenti della reazione enzimatica dal passaggio 6.1.2, purificare il prodotto PCR utilizzando un kit concentratore a colonna secondo le istruzioni del produttore, quindi quantificare utilizzando uno spettrofotometro.</li>
	<li>Per la sintesi dell'RNA, utilizzare un kit di trascrizione in vitro con la seguente miscela di reazione: 5 μL T7 Trascrizione 5x buffer, 1,9 μL di ogni nucleotide trifosfato, 10 μg di DNA VP2 RABV N purificato e 2,5 μL della miscela enzimatica. Successivamente, incubare la miscela a 37 °C per 4 ore. Quindi, aggiungere 1 μL di 1 DNA privo di RNasi U/μg alla miscela di reazione e incubare per 15 min a 37 °C per eliminare la contaminazione da DNA.</li>
	<li>Purificare l'RNA trascritto in vitro e quindi concentrarlo usando fenolo:cloroformio:alcol isoammil (25:24:1).</li>
	<li>Resopendare il pellet di RNA purificato in 70 μL di TE buffer, quindi conservare a -80 °C fino all'uso.</li>
	<li>Ripetere il protocollo PCR dal passaggio 6.1 fino a ottenere circa 5 μg di prodotto PCR. Dopo la purificazione e la concentrazione, l'mRNA genico N trascritto in vitro sarà presente ad una concentrazione di 4,711 μg/μL.</li>
	<li>Verificare che l'mRNA trascritto in vitro corrisponda al gene N dopo il passaggio 5 di questo protocollo e utilizzarlo come controllo positivo per la reazione a catena della polimerasi di trascrizione in tempo reale in tempo reale (qRT-PCR).</li>
</ol>7. Reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa in tempo reale (qRT-PCR)
<ol><li>Per qRT-PCR, utilizzare una trascrizione di mRNA in vitro che codifica per il gene N completo come controllo positivo insieme a un kit qRT-PCR commerciale in un passaggio utilizzando sonde di ibridazione secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare la sonda e i primer descritti da Carneiro et al. BRDesrot-Fwd: 5′ cgtactgatgtggaagggaattg 3′, e BRDesrot-Probe: 5′-FAM-acaagggaccctactgtttcagagcatgc-3′-BHQ).</li>
	<li>Utilizzare le seguenti condizioni di ciclo termico: 1 ciclo di 50 °C per 10 min e 95 °C per 2 min; 40 cicli di 95 °C per 15 s e 50 °C per 30 s.</li>
</ol>8. Curva di calibrazione o curva standard
<ol><li>Eseguire diluizioni seriali dell'mRNA trascritto in vitro mediante pipettazione seriale di 1 μg/μL di mRNA in tubi fino a ottenere sei diluizioni di decuple. Preparare tubi con un volume di 100 μL in triplice copia per l'uso nella creazione della curva standard. Eseguire qRT-PCR come descritto nel passaggio 7.</li>
	<li>Eseguire qRT-PCR in un termociclo con rotore elaborando i vari campioni cerebrali contemporaneamente alle reazioni di corsa per creare la curva standard e utilizzando controlli positivi, controlli negativi e supernanti isolati dalla coltura cellulare.</li>
	<li>Per valutare il limite di rilevamento, efficacia del test e sensibilità del test, utilizzare una curva standard in triplice copia nelle stesse condizioni.</li>
</ol>9. qRT-PCR di campioni biologici
<ol><li>Per il rilevamento del gene RABV N, utilizzare l'RNA da campioni di campo, controlli positivi, controlli negativi e supernanti di coltura cellulare per eseguire qRT-PCR utilizzando il kit PCR descritto nel passaggio 7.</li>
	<li>Per determinare il numero di copie del genoma RABV presenti nei campioni cerebrali bovini, ottenere i dati Ct dalla curva standard e dai campioni biologici e da quelli interpolati dall'equazione della curva di taratura.</li>
</ol>

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<li>Bingham, J., Van Der, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+rabies+antigen+in+infected+brain+material%3A+determining+the+reliability+of+different+regions+of+the+brain+for+the+rabies+fluorescent+antibody+test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test.</a> Journal Virological Methods. 101 (1-2), 85-94 (2002).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Studi precedenti hanno dimostrato che il DFA può rilevare rabv solo entro sette giorni dalla conservazione del campione a temperatura ambiente (21 °C)14. Al contrario, questo lavoro ha dimostrato che la sensibilità di RT-PCR inizia a diminuire dopo che i campioni sono stati esposti alla temperatura ambiente per 12 giorni. Pertanto, il genoma RABV può essere rilevato da qRT-PCR in campioni esposti a temperatura ambiente per un massimo di 23 giorni. Ciò dimostra che la sensibilità di qRT-PCR è relat...

La rabbia può essere confermata ante mortem e post mortem con varie tecniche che consentono il rilevamento di acidi nucleici virali nel cervello, nella pelle, nelle urine o nella saliva1. L'individuazione del gene della nucleoproteina del virus della rabbia(N)viene utilizzata principalmente per la diagnosi della rabbia mediante test molecolari. Questo gene è anche usato per il genotipizzazione virale. La rabbia può essere diagnosticata negli animali utilizzando qualsiasi porzione del cervello interessato; tuttavia, per escludere la possibilità di rabbia, i tessuti provenienti da almeno due regioni del cervello devono essere testati2. Esistono diversi metodi diagnostici per l'individuazione della rabbia negli animali; tuttavia, il test di immunofluorescenza diretta rimane la tecnica di riferimento standard3. Altri test includono test biologici che incorporano l'inoculazione del topo, l'infezione nella coltura tissutale e la reazione a catena della polimerasi (PCR)4. Tutte queste tecniche sono raccomandate dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) e dall'Organizzazione Mondiale della Sanità Animale (OIE) per la diagnosi di rabbia nell'uomo e negli animali,rispettivamente 5.
Le tecniche di rilevazione e amplificazione degli acidi nucleici hanno rivoluzionato la diagnosi di rabbia negliultimi anni 6 e queste tecniche svolgono un ruolo importante nella diagnosi ante mortem della rabbia umana. Diversi test basati su PCR sono stati valutati per integrare i test convenzionali per diagnosi di rabbia ante mortem e post mortem 7,8,9,10. La maggior parte dei saggi ha come obiettivo il gene della nucleoproteina virale della rabbia per l'amplificazione, che è la regione più conservata nel genomavirale 1,11. Negli ultimi 20 anni, vari saggi molecolari sono stati sviluppati per diagnosticare rabv, e alcuni di questi test sono stati utilizzati per la caratterizzazione del virus. La maggior parte degli studi ha mirato a rilevare geni conservati all'interno del genoma virale, più comunemente utilizzando test convenzionali o quantitativi di reazione a catena della polimerasi in tempo reale (qRT-PCR)12,13.
La PCR è una tecnica diagnostica altamente sensibile in grado di rilevare il genoma di un dato agente patogeno all'interno dei tessuti, anche quando questi tessuti sono decomposti. Utilizzando approcci basati su PCR, quantità minime di un agente infettivo possono essere rilevate in un campione clinico attraverso l'amplificazione selettiva e ripetitiva di una sequenza nucleotidica del DNA14. qRT-PCR che incorpora sonde fluorescenti (ad esempio, TaqMan) o coloranti leganti il DNA (ad esempio, SYBR Green) è stato utilizzato in studi per diagnosticare RABV sia ante- che post- mortem ad alta sensibilità; tuttavia, tale approccio richiede attrezzature specializzate. Per superare questa limitazione, è stata suggerita l'amplificazione isotermica mediata dal ciclo di trascrizione inversa (RT-LAMP), basata sul suo basso costo, semplicità e caratteristiche desiderabili per il rilevamento di RABV. Questo saggio è particolarmente importante in quanto può essere utilizzato nei paesi in via disviluppo 15.
qRT-PCR si basa sul rilevamento e la quantificazione di una molecola, dove gli aumenti del segnale fluorescente sono in proporzione diretta alla quantità di prodotto PCR in una singola reazione. Con l'aumentare del numero di copie del bersaglio dell'acido nucleico, aumenta anche la fluorescenza. Coloranti intercalanti non specifici come il colorante SYBR Green per legare il DNA o sonde oligonucleotidi specifiche della sequenza che trasportano un fluoroforo e un quencher sono comunemente usati per fornire la lettura fluorescente in qRT-PCR. Questo test offre vantaggi rispetto all'RT-PCR convenzionale che include un tempo di test più breve (2-4 ore), un rischio ridotto di contaminazione a causa del sistema a tubo chiuso (mancanza di manipolazione post-PCR di prodotti amplificati) e la capacità di rilevare diversi obiettivicontemporaneamente 16. qRT-PCR può essere utilizzato per diagnosticare la rabbia ante mortem dalla saliva e da altri campioni. Questo saggio può anche essere utilizzato come test universale in tempo reale per il rilevamento di diverse specie di Lyssavirus o lignaggi di RABV15. In questo approccio combo RT-PCR, vengono utilizzate due reazioni. Il primo rileva diversi linaggi genetici della RABV, e il secondo rileva le specie di Lyssavirus. Entrambi i passaggi coinvolgono test qRT-PCR, in cui il primo utilizza sonde di ibridazione e il secondo utilizza coloranti15. A causa del gran numero di test che hanno dimostrato il successo del rilevamento molecolare del RABV utilizzando questa tecnica, l'attuale manuale terrestre OIE (2018) raccomanda l'uso della PCR per il rilevamento molecolare di RABV17.
Il Messico è un paese con un notevole potenziale zootecnico. Gli stati con la più alta produzione di bestiame contengono sia regioni tropicali umide che regioni secche che sono a rischio di epidemie di rabbia a causa della presenza del pipistrello vampiro Desmodus rotundus, il principale trasmettitore della rabbia. Pertanto, è essenziale sviluppare più strumenti per la prevenzione e il controllo della rabbia paralitica bovina (BPR) in Messico. Sulla base di ciò, lo scopo di questo studio era quello di utilizzare qRT-PCR quantitativo per determinare il numero di particelle virali in diverse strutture anatomiche del cervello bovino dopo la morte a causa di un'infezione da rabbia.
Sei cervelli ottenuti da bovini positivi alla RABV sono stati donati da un laboratorio esterno per l'uso nello sviluppo del protocollo qRT-PCR descritto di seguito. I campioni della struttura cerebrale bovina sono stati trasportati a catena fredda presso l'impianto INIFAP CENID-MA laboratorio BSL-2 e conservati a -80 °C fino all'uso. I cervelli erano ottenuti da animali provenienti dagli stati di Campeche, Yucatán e Querétaro. Prima della ricezione, varie strutture venivano sezionate dal cervello. Queste strutture includevano il corno di Ammon, il cervelletto, la corteccia, il midollo, i pons e il talamo18,19. Il materiale genetico è stato estratto come descritto di seguito. La diagnosi di RABV è stata confermata utilizzando anticorpi fluorescenti diretti (DFA)20. Come controllo positivo, sono stati utilizzati cervelli di topo inoculati con RABV21. Inoltre, quattro cervelli bovini negativi alla RABV (come determinato dal DFA) sono stati utilizzati come controlli negativi.

<table><tbody><tr><td>Cloroformio</td><td>SIGMA</td><td>C7559</td><td>Facilita il recupero della fase acquosa delle PCR che sono state ricoperte di olio minerale.</td></tr><tr><td>DNA pulito & Concentratore-500</td><td>Zimo</td><td>D4031</td><td>Il DNA Pulito & Concentrator-500 (DCC-500) è progettato per la purificazione e la concentrazione rapida e di grande formato fino a 500 &5; g di DNA di alta qualità da campioni, comprese le digestioni di endonucleasi di restrizione su larga scala e preparazioni di DNA impuro.</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Amresco</td><td>193-500</td><td>Purificazione degli acidi nucleici</td></tr><tr><td>Kit del sistema PCR ad alta fedeltà FastStart, dNTPack</td><td>Roche</td><td>3553400001</td><td>Enzima ad alta fedeltà per l'amplificazione dei prodotti PCR evitando cambiamenti casuali di basi</td></tr><tr><td>GelDoc XR</td><td>BioRad</td><td>XR+</td><td>Analizza le proteine più grandi e i gel di DNA</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Una nuova generazione di coloranti in gel di acido nucleico, possiedono nuove caratteristiche chimiche progettate per ridurre al minimo la possibilità per i coloranti di interagire con gli acidi nucleici nelle cellule viventi.</td></tr><tr><td>iCycler Thermal Cycler Gradient</td><td>BioRad</td><td>582BR</td><td>La temperatura può essere monitorata e controllata dall'algoritmo dello strumento, dalla sonda all'interno del campione o dalle modalità di blocco del campione</td></tr><tr><td>iTaq Universal Probes Kit One-Step BioRad</td><td></td><td>1725141</td><td>Miscela di reazione per eseguire reazioni PCR in tempo reale utilizzando sonde di ibridazione di tipo TaqMan</td></tr><tr><td>Alcool isopropilico</td><td>Amresco</td><td>0918-500</td><td>Precipitazione degli acidi nucleici</td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel QIAquick</td><td>I kit QIAquick Qiagen</td><td>28706</td><td>contengono un gruppo di membrana di silice per il legame del DNA in tampone ad alto contenuto di sale e l'eluizione con tampone a basso contenuto di sale o acqua. La procedura di purificazione rimuove primer, nucleotidi, enzimi, olio minerale, sali, agarosio, bromuro di etidio e altre impurità dai campioni di DNA</td></tr><tr><td>Trascrittasi inversa M-MLV</td><td>Invitrogen</td><td>28025-021</td><td>La trascrittasi inversa del virus della leucemia murina Moloney (M-MLV RT) utilizza RNA o DNA a filamento singolo in presenza di un primer per sintetizzare un filamento di DNA complementare .</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo-Scientific</td><td>ND2000</td><td>Spettrofotometro per microvolumi</td></tr><tr><td>Primer oligo(dT)18</td><td>Invitrogen</td><td>SO132</td><td>Il primer oligo (dT)18 è un oligonucleotide sintetico a filamento singolo 18-mer con estremità 5' e 3'-ossidrile.</td></tr><tr><td>Kit per sistemi di produzione di RNA su larga scala RiboMAX SP6 e T7</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td>Le reazioni di trascrizione in vitro vengono utilizzate per sintetizzare quantità di microgrammi di sonde di RNA da modelli di DNA ricombinante. La maggior parte delle reazioni di trascrizione progettate per generare sonde di RNA sono ottimizzate per massimizzare l'incorporazione di ribonucleotidi radiomarcati piuttosto che per produrre grandi quantità di RNA</td></tr><tr><td>Taq DNA polimerasi</td><td>Invitrogen</td><td>#EP0402</td><td>Taq DNA polimerasi è una DNA polimerasi altamente termostabile del batterio termofilo Thermus aquaticus. L'enzima catalizza il 5' e 3' sintesi di DNA &nbsp;</td></tr><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>Il reagente TRIzol è un reagente completo, pronto all'uso, progettato per l'isolamento di RNA totale di alta qualità o per l'isolamento simultaneo di RNA, DNA e proteine da una varietà di campioni biologici.</td></tr></tbody></table>

quantificazione del virus della rabbia in varie strutture cerebrali bovine

Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures

La rabbia paralitica bovina (BPR) è una forma di encefalite virale di notevole importanza economica in tutta l'America Latina, dove presenta un grave rischio zoonotico. Qui, il nostro obiettivo era quello di utilizzare un protocollo di laboratorio per determinare il numero relativo di copie del genoma del virus della rabbia (RABV) in diverse strutture anatomiche del cervello bovino utilizzando la reazione quantitativa a catena della polimerasi a trascrizione inversa in tempo reale (qRT-PCR). qRT-PCR quantifica il numero specifico di copie geniche presenti in un campione basato sulla fluorescenza emessa dopo l'amplificazione che è direttamente proporzionale alla quantità di acido nucleico bersaglio presente nel campione. Questo metodo è vantaggioso per la sua breve durata, il ridotto rischio di contaminazione e il potenziale di rilevare gli acidi nucleici virali in campioni diversi più facilmente rispetto ad altre tecniche. Il cervello di sei animali rabbiosi era diviso in sei strutture anatomiche, vale a dire il corno di Ammon, il cervelletto, la corteccia, il midollo, il pons e il talamo. Tutti i cervelli sono stati identificati come positivi per gli antigeni RABV sulla base di un test di immunofluorescenza diretta. Sono state valutate anche le stesse strutture anatomiche provenienti dal cervello di quattro bovini rabv-negativi. L'RNA è stato estratto da ogni struttura e utilizzato per qRT-PCR. È stato eseguito un test per determinare il numero di copie dei geni RABV utilizzando un gene nucleoproteina trascritto in vitro. La curva standard utilizzata per quantificare l'RNA virale presentava un'efficienza del 100% e una linearità dello 0,99. L'analisi ha rivelato che la corteccia, il midollo e il talamo erano le porzioni ideali del SNC da utilizzare nel rilevamento RABV, in base all'osservazione che queste strutture possedevano i più alti livelli di RABV. La specificità del test era del 100%. Tutti i campioni erano positivi, non sono stati rilevati falsi positivi. Questo metodo può essere utilizzato per rilevare rabv in campioni che contengono bassi livelli di RABV durante la diagnosi di BPR.

I risultati del DFA hanno mostrato rispettivamente 100%, 100%, 83,3%, 66% e positività del 50% per rabv nella corteccia, talamo, midollo, pons e corno. Questi risultati hanno confermato i risultati precedenti, e almeno tre delle strutture sezionate da ogni cervello erano positive per rabv. Una colorazione DAF positiva rappresentativa è mostrata nella figura 1.
La figura 2 mostra l'amplificazione di un frammento del gene RABV N (fase 5...

Questo protocollo presenta un approccio basato su qRT-PCR per determinare il numero di copia genica della nucleoproteina del virus della rabbia (N) all'interno di varie strutture anatomiche cerebrali bovine utilizzando la trascrizione in vitro.

Quantificazione del virus della rabbia in varie strutture cerebrali bovine

Bovine paralytic rabies (BPR) is a form of viral encephalitis that is of substantial economic importance throughout Latin America, where it poses a major ...

Quantificazione del virus della rabbia in varie strutture cerebrali bovine. Il Messico è un paese con un notevole potenziale zootecnico. Gli stati con la più alta produzione di bestiame contengono sia regioni tropicali umide che regioni secche che sono a rischio di focolai di rabbia a causa della presenza del pipistrello vampiro, Desmodus rotundus, il principale trasmettitore della rabbia.Il rilevamento del gene nucleoproteina N del virus della rabbia viene utilizzato principalmente per la diagnosi della rabbia mediante test molecolari. Utilizzando approcci basati su PCR, quantità minime di un agente infettivo possono essere rilevate in un campione clinico attraverso l'amplificazione selettiva e ripetitiva di una sequenza nucleotidica del DNA. qRT-PCR si basa sul rilevamento e la quantificazione di una molecola in cui gli aumenti del segnale di fluorescenza sono in proporzione diretta alla quantità di prodotto PCR in una singola reazione.Con l'aumentare del numero di copie del bersaglio dell'acido nucleico, aumenta anche la fluorescenza. Sulla base di ciò, lo scopo dello studio era quello di utilizzare qRT-PCR quantitativo per determinare il numero di particelle virali in diverse strutture anatomiche del cervello bovino, dopo la morte, a causa dell'infezione da rabbia. L'RNA totale è stato estratto direttamente dal cervello dei bovini utilizzando un metodo di estrazione organica secondo il seguente protocollo.Utilizzare 100 milligrammi di tessuto cerebrale da ogni struttura anatomica per estrarre l'RNA totale utilizzando un reagente disponibile in commercio contenente isotiocianato di guanidinio. Omogeneizzare manualmente un totale di 100 milligrammi di tessuto da ogni struttura in un millilitro del reagente isotiocianato di guanidinium vortice utilizzando un omogeneizzatore Dounce con un piccolo pestello all'interno del microtubo per 15 secondi alla massima velocità. Incubare i campioni sul ghiaccio per cinque minuti, quindi aggiungere 200 microlitri di cloroformio.Mescolare vigorosamente i campioni per 15 secondi. Incubare sul ghiaccio per due o tre minuti, quindi centrifugare a 12.000 x g per 15 minuti a quattro gradi centigradi. Trasferire la fase acquosa in un tubo pulito e aggiungere 500 microlitri di alcol isopropile.Incubare i campioni per 15 minuti a 21 gradi centigradi. Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 10 minuti a quattro gradi centigradi. Aspirare il supernatante acquoso pipettando.L'RNA isolato sarà presente come pellet nel tubo. Quindi, lavare il pellet di RNA con un millilitro di 75% di etanolo pipettando e centrifugando a 7,500 x g per cinque minuti a quattro gradi centigradi. Decantare il supernatante e asciugare all'aria il pellet di RNA a temperatura ambiente, 21 gradi centigradi.Successivamente, diluire il pellet in 50 microlitri di acqua priva di nucleasi. Determinare la concentrazione e la qualità dell'RNA a 260 nanometri utilizzando uno spettrofotometro. La trascrizione in vitro genera mRNA di un gene bersaglio.Utilizzare una coppia di primer che amplifica il gene RABV N completo e una che viene utilizzata come controllo positivo per il test qRT-PCR. Questi primer sono progettati per amplificare il gene RABV N completo e per aggiungere un promotore che riconosca la T7 polimerasi. Per amplificare l'intero gene N RABV, utilizzare i primer trans e RAB avanti e indietro e un kit PCR ad alta fedeltà.Per ogni reazione, preparare un mix master PCR aggiungendo a un tampone di reazione del tubo PCR pulito con 10 micromolari di ogni primer e 0,5 unità di polimerasi ad alta fedeltà. Per utilizzare il prodotto PCR come modello per la sintesi in vitro e per rimuovere i componenti della reazione enzimatica, purificare il prodotto PCR utilizzando un kit concentratore a colonna, secondo le istruzioni del produttore. E poi quantificare usando uno spettrofotometro.Per la sintesi dell'RNA, utilizzare un kit di trascrizione in vitro con la seguente miscela di reazione:cinque microlitri T7 trascrizione 5X buffer, 1,9 microlitri di ogni nucleotide trifosfato, 10 microgrammi di DNA RABV N purificato e 2,5 microlitri della miscela enzimatica. Successivamente, incubare la miscela a 37 gradi centigradi per quattro ore. Quindi, aggiungere un microliter di un'unità per microgrammo di DNA privo di Rnasi alla miscela di reazione e incubare per 15 minuti a 37 gradi centigradi per eliminare la contaminazione da DNA.Purificare l'RNA trascritto in vitro e quindi concentrarlo usando fenolo:cloroformio:alcol isoamile ad un rapporto di 25:24:1. Resostipendare il pellet di RNA purificato in 70 microlitri di te buffer, quindi conservarlo a 80 gradi centigradi fino all'uso. Ripetere il protocollo PCR fino a ottenere circa cinque microgrammi di prodotto PCR.Dopo la purificazione e la concentrazione, l'mRNA genico N trascritto in vitro sarà presente ad una concentrazione di 4.711 microgrammi per microlitro. Confermare che l'mRNA trascritto in vitro corrisponde al gene N dopo il quinto passo di questo protocollo, e utilizzarlo come controllo positivo per la reazione a catena della polimerasi di trascrizione in tempo reale, qRT-PCR. Per la reazione a catena della polimerasi di trascrizione in tempo reale in tempo reale, utilizzare una trascrizione in vitro dell'mRNA nella codifica del gene N completo come controllo positivo.Insieme a un kit qRT-PCR commerciale in un solo passaggio, utilizzando sonde di ibridazione secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare la sonda nei primer descritti da Coronado e dal collega 2010 per rilevare una regione conservata del RABV utilizzando le seguenti condizioni di ciclo termico. Eseguire diluizioni seriali dell'mRNA trascritto in vitro pipettando serialmente un microgrammo per microlitro di mRNA in tubi fino a ottenere sei diluizioni disaccoppiate.Preparare tubi a un volume di 100 microliter in triplice copia per l'uso nella creazione della curva standard. Eseguire qRT-PCR come descritto in precedenza. Eseguire qRT-PCR in un ciclore termico con un rotore elaborando i vari campioni cerebrali contemporaneamente alle reazioni di corsa per creare una curva standard e utilizzando controlli positivi, controlli negativi e supernanti isolati dalla coltura cellulare.Per valutare il limite di rilevamento, efficacia del test e sensibilità del test, utilizzare una curva standard in triplice copia nelle stesse condizioni. Per il rilevamento del gene RABV N, utilizzare l'RNA da campioni di campo, controlli positivi, controlli negativi e supernanti di coltura cellulare per eseguire qRT-PCR utilizzando il kit PCR descritto in precedenza. Per determinare il numero di copie del genoma RABV presenti nei campioni cerebrali bovini, ottenere dati TC dalla curva standard e campioni biologici e da quelli interpolati dall'equazione della curva di taratura Questa cifra mostra i tessuti cerebrali bovini che mostrano una colorazione positiva secondo l'immunofluorescenza diretta.I risultati mostrano rispettivamente positività al 100%100%83,3%66% e al 50% per RABV in corteccia, talamo, midollo, pons e corno. Questi risultati confermano i risultati precedenti, e almeno tre delle strutture sezionate da ogni cervello erano positive per rabv. D'altra parte, l'equazione della curva standard mostra la relazione tra la quantità di contenuto genetico RABV nel campione e la dimensione del frammento amplificato PCR.La quantità di contenuto genetico RABV nei nanogrammi è stata dedotta dall'interpolazione dei valori TC nella curva di calibrazione utilizzando l'equazione presentata in questa figura. Usando questa equazione, il limite di rilevamento di uno per 10 al quinto microgrammo per microlitro di RNA virale è stato trovato corrispondere a 36 copie del genoma RABV. Questi risultati dimostrano che il saggio è sensibile e può essere utilizzato per rilevare il virus in campioni che contengono un basso numero di copie del gene RABV N.L'efficienza del saggio è stata calcolata utilizzando la pendenza della curva standard, che era 3.28. I campioni utilizzati per qRT-PCR hanno mostrato l'amplificazione del gene RABV N. Per determinare il numero di copie virali presenti, i valori CT per ciascun campione sono stati interpolati utilizzando l'equazione della curva di calibrazione.I risultati ottenuti in nanogrammi sono stati sostituiti nella formula qui descritta. Questa tabella mostra i risultati comparativi tra qRT-PCR e DFA. I risultati dei test qRT-PCR sono stati coerenti con quelli ottenuti utilizzando DFA.Secondo i risultati ottenuti nel test qRT-PCR nei casi C e D, il talamo è la struttura che possiede il maggior numero di copie del gene RABV N. Ciò suggerisce che l'infezione precoce dei neuroni ipotalamici e talamici è importante nello sviluppo della malattia, dato che questi neuroni controllano le funzioni vegetative di un animale. I numeri di copia del gene RABV N rilevati in ogni struttura di ogni campione sono: la sensibilità e la specificità del test qRT-PCR siamo entrambi al 100% poiché tutti i campioni erano positivi.Questo risultato è coerente con le diagnosi iniziali dei campioni. qRT-PCR è una tecnica altamente sensibile. Alcuni dei passaggi sono fondamentali per ottenere i migliori risultati.Uno di questi è la corretta gestione dei campioni per l'estrazione dell'RNA. Questo passaggio è cruciale in quanto l'RNA è facilmente degradabile e i risultati potrebbero quindi essere influenzati. Prendere in considerazione la possibilità di mantenere il campione in condizioni di freddo, circa quattro gradi centigradi durante il processo.Inoltre, si consideri che diversi cicli di applicazione PCR vengono eseguiti come menzionato nella trascrizione in vitro. Il saggio qRT-PCR condotto in questo studio potrebbe rilevare fino a 36,3 copie del gene RABV N per milligrammo di tessuto. Le strutture cerebrali più adatte per qRT-PCR includevano la corteccia e il talamo.Ciò si basa sulle osservazioni secondo cui concentrazioni più elevate del gene RABV N sono state rilevate in queste strutture e che sono state anche trovate positive utilizzando il test di riferimento RABV. Il test è stato in grado di rilevare concentrazioni molto basse, 0,00023 per 10 alla nona copia del virus in vari campioni. Oltre a quantificare le particelle virali nel campione, il test sembra fornire un buon strumento diagnostico e di ricerca alternativo per l'individuazione del RABV qui presentato.

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Immunologia e Infezioni

Il virus infetta i neuroni piramidali nella corteccia cerebrale e le proteine virali espresse si localizzano all'interno di strutture granulari intracitoplasmatiche note come corpi di inclusione.

Rilevamento di proteine virali nel tessuto cerebrale di topo infetto da virus della rabbia

Questo video dimostra la colorazione immunoistochimica per il rilevamento dell'antigene del virus della rabbia nel tessuto cerebrale di topo infetto. Il processo include la deparaffinazione e il trattamento con alcol, seguiti da un trattamento proteolitico per migliorare l'accessibilità dell'antigene. La colorazione immunoistochimica rivela precipitati rossi, confermando la presenza di antigeni della rabbia nella sezione tissutale.

Una colorazione immunoistochimica per la rilevazione degli antigeni del virus della rabbia

Fonte: Zaeck, L., et al. Imaging 3D ad alta risoluzione dell'infezione da virus della rabbia in tessuto cerebrale eliminato con solvente. J. Vis. Exp. (2019).  Questo video mostra il processo di preparazione e imaging del tessuto cerebrale di topo infettato dal virus della rabbia (RABV) per valutare la progressione dell'infezione. Descrive i passaggi chiave, tra cui la colorazione dei tessuti con marcatori fluorescenti, la disidratazione, la pulizia e il montaggio per la microscopia a scansione...

Visualizzazione tridimensionale di un'infezione da virus della rabbia nel tessuto cerebrale del topo

Nuove tecniche di sgombero dei tessuti immunostaining come l'ultima imaging 3D di organi autorizzati dai solventi consentono la visualizzazione 3D dell'infezione cerebrale da virus del virus della rabbia e del suo complesso ambiente cellulare. Le fette spesse di tessuto cerebrale etichettate con anticorpi sono rese otticamente trasparenti per aumentare la profondità di imaging e consentire l'analisi 3D mediante microscopia a scansione laser confocale.

Imaging 3D ad alta risoluzione dell'infezione da virus della rabbia nel tessuto cerebrale con la rimozione del solvente

Il test immunohistochimico rapido diretto (DRIT) offre un'Organizzazione Mondiale per la Salute Animale e l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OIE/OMS) riconosciuta alternativa al test di anticorpo fluorescente diretto (DFA) per la diagnosi della rabbia. Questo test consente di applicazioni sul campo che possono essere eseguite in circa 1 h su impronte cerebrali utilizzando la microscopia leggera.

Sorveglianza della rabbia migliorata utilizzando un test immunoistochimico rapido diretto

L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare tecniche di necroscopia sicure in animali piccoli e grandi per ottenere campioni di tessuto soddisfacenti per i test sulla rabbia.

Tecniche di necropsia della rabbia negli animali grandi e piccoli

Presentiamo un protocollo completo per la diagnosi post-mortem della rabbia animale in condizioni di campo utilizzando un rapido test diagnostico immunocromatico (RIDT), dal campionamento della biopsia cerebrale all'interpretazione finale. Descriviamo anche ulteriori applicazioni utilizzando il dispositivo per l'analisi molecolare e la genotipizzazione virale.

Test diagnostico immunocromatico rapido sulla rabbia sul campo per impostazioni limitate alle risorse con ulteriori applicazioni molecolari

Qui, presentiamo un protocollo di test immunoistochimico per la rilevazione dell'antigene del virus della rabbia come test diagnostico alternativo per i tessuti fissati alla formalina.

Test immunoistochimico per il rilevamento dell'antigene del lyssavirus da tessuti fissati con formalina

Qui, presentiamo un flusso di lavoro rapido ed economico per la caratterizzazione dei genomi del virus della rabbia (RABV) utilizzando la tecnologia dei nanopori. Il flusso di lavoro ha lo scopo di supportare la sorveglianza basata sulla genomica a livello locale, fornendo informazioni sui lignaggi RABV circolanti e sul loro posizionamento all'interno delle filogenesi regionali per guidare le misure di controllo della rabbia.

Sequenziamento dell'intero genoma per una rapida caratterizzazione del virus della rabbia utilizzando la tecnologia Nanopore

Questo protocollo dimostra il test della reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) in tempo reale della trascrizione inversa del pan-lyssavirus LN34 dalla raccolta dei tessuti all'interpretazione dei risultati, compresi gli aggiornamenti alle sequenze e alle formulazioni dei primer per migliorare le prestazioni del test per alcuni lissavirus e lagomorfi non antirabbici. Dimostriamo anche la configurazione del saggio per un formato multiplex LN34 a pozzetto singolo (LN34M).

Diagnosi post-mortem della rabbia negli animali mediante il test di reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa in tempo reale LN34 aggiornato e multiplexato

Impara a quantificare il virus della rabbia nelle strutture cerebrali bovine usando qRT-PCR e trascrizione in vitro. Questo metodo fornisce un protocollo affidabile per la ricerca e la diagnostica veterinaria.

Quantificazione del virus della rabbia in varie strutture cerebrali bovine

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