Microscopia confocale e a forza atomica (Conpokal) quasi simultanea su cellule vive

Conpokal combina la microscopia confocale con la microscopia a forza atomica usando una sonda per colpire la superficie del campione. Sebbene entrambe le tecniche siano efficaci individualmente, Conpokal facilita la co-localizzazione della fluorescenza con la caratterizzazione meccanica. Il principale vantaggio della tecnica Conpokal, è la doppia microscopia quasi simultanea.

Confocal indaga i processi citoscheletrici e altri processi cellulari prima e dopo il sondaggio AFM, che fornisce proprietà meccaniche specifiche dell'area. Questa tecnica ha un impatto all'interno del campo della meccanobiologia in quanto, ad esempio, le cellule cerebrali possono essere sondate in condizioni fisiologiche per esaminare gli impulsi elettrici e la transazione della forza. Prima di iniziare l'analisi, selezionare un cantilever AFM appropriato per la raccolta dei dati desiderata e utilizzare guanti, lo stadio di montaggio del chip AFM, una pinzetta e un piccolo cacciavite per montare il chip nel blocco di vetro.

Posizionare con cura il chip AFM al centro del blocco di vetro. Il sbalzino più una porzione molto piccola del chip AFM dovrebbe essere nella porzione visibile e non opaca del blocco di vetro. Utilizzare il cacciavite per stringere la vite fino a quando il chip non è aderente al blocco di vetro e utilizzare un obiettivo per verificare che il chip sia orientato correttamente.

Quando il chip è stato correttamente orientato, posizionare il blocco di vetro nella testa AFM nell'orientamento corretto e bloccare il blocco di vetro in posizione. Dopo aver individuato la parte inferiore della piastra di calibrazione mediante microscopia a campo brillante, utilizzare il pannello di controllo del motore stepper Z del sistema AFM per spostare i micron a sbalzante AFM 2000 sopra il campione. Utilizzando l'illuminazione a campo luminoso e il pannello di controllo del motore del passo Z, abbassare lentamente il chip AFM sul fondo della piastra di vetro in passi da 100 a 200 micron per evitare di schiantare la punta AFM nella piastra di Petri.

Individuare i micrometri manuali che controllano X Y o in semplice movimento della testa AFM sulla piattaforma dello strumento. Man mano che l'ombra del sbalzino AFM diventa più scura e la forma diventa più nitida, utilizzare i micrometri manuali per correggere la testa AFM e regolare la posizione della sbalziera AFM all'interno del campo visivo. Al momento, potrebbe essere necessario regolare le tabelle di ricerca.

Guarda un'ombra da visualizzare nella visualizzazione software del microscopio, che indica che la punta AFM si sta avvicinando alla parte inferiore del piatto. Continuare a usare piccoli gradini per abbassare la punta AFM fino a quando la punta è principalmente a fuoco. Quando il laser è in posizione, utilizzare i quadranti di allineamento laser per posizionare il laser sul retro del punto in cui si trova la punta AFM sul sbalzino.

Il pannello di allineamento laser dovrebbe visualizzare un segnale di somma maggiore di zero volt. Spostare il laser, una piccola distanza in tutte le direzioni sul cantilever AFM, fino a raggiungere il segnale di somma massima rimanendo alla punta AFM. Una volta impostata la posizione laser, utilizzare i quadranti di deflessione controllati manualmente per azzerare la deflessione verticale e laterale.

Utilizzare le manopole di deflessione verticali e laterali per allineare il rilevatore in modo che il bersaglio sia centrato e non vi sia alcuna deflessione verticale o laterale osservata nel pannello di allineamento laser. Aprire la finestra Calibrazione e immettere tutte le informazioni specifiche degli esperimenti. Sostituire il filtro della luce laser.

Prima di calibrare, spegnere la sorgente luminosa del microscopio confocale e chiudere l'involucro AFM per smorzare qualsiasi potenziale rumore proveniente dalla luce o dalle vibrazioni della stanza. Premere il pulsante Calibrazione per consentire automaticamente al sistema di calibrare la punta. Al termine della calibrazione, la rigidità del sbalzino e la sua sensibilità verranno visualizzate nel pannello Calibrazione.

Quindi usa il pulsante Comando approccio automatico per abbassare la punta nella parte inferiore del piatto campione e impostare le dimensioni dell'area della pelle, la risoluzione, il set point, la lunghezza Z e il tempo pixel, prima di premere il pulsante di riproduzione per iniziare la scansione. Per l'imaging al microscopio confocale nel software del microscopio, abilitare le capacità confocali e selezionare le linee laser appropriate per i coloranti utilizzati per macchiare i campioni. Selezionare una o più linee laser per eccitare e imageare tali feature nel campione e impostare il guadagno su un valore che ottimizza la fluorescenza del campione ma limita la quantità di rumore.

Regolare la potenza del laser per evitare pixel saturi massimizzando l'intervallo dinamico e impostare la dimensione del foro stenopeica su un'unità di area per massimizzare la risoluzione per il sezionamento ottico. Se necessario, regolare i valori in base alla luminosità del campione. Per impostare il tempo di rigonfiamento dei pixel, iniziare con circa due microsecondi di tempo di rigonfiamento e regolare per riflettere la luminosità del campione in base alle esigenze.

Per selezionare la dimensione dei pixel per l'obiettivo selezionato, lasciare che lo strumento calcoli la dimensione dei pixel tramite il pulsante di opzione Nyquist e il numero selezionato di pixel nell'immagine. Selezionare quindi l'opzione Digitalizza e iniziare la raccolta dei dati. Utilizzate la manopola di messa a fuoco per individuare il piano focale che rappresenta le feature dei campioni nella sua forma più chiara, il pulsante Digitalizza per iniziare la raccolta dei dati e il pulsante Cattura per acquisire un'immagine bidimensionale.

Utilizzando il pannello che controlla la dimensione dei pixel tramite l'opzione Nyquist, ridurre le dimensioni dell'area della scansione per avvolgere solo una singola cella. Attivare lo strumento di raccolta e utilizzare un'opzione dal basso verso l'alto, con solo la linea laser che illumina più chiaramente una feature nel campione, impostare i piani di inizio e fine per il volume da misurare utilizzando la spaziatura suggerita tra i piani. Assegnare un nome al file e salvarlo nella cartella associata.

In alternativa, se esiste la nostra conoscenza a priori dello spessore dei campioni, selezionare il piano medio più luminoso, più nitido regolando lo stato attivo per definire il volume e impostare la parte superiore in modo che abbia lo spessore del campione sopra il piano centrale e il fondo per avere lo spessore al di sotto del piano centrale, quindi selezionare la dimensione del passo appropriata. Eseguire l'acquisizione premendo il pulsante Esegui ora. Al termine dell'acquisizione, salvare il file nella cartella appropriata.

Alla fine dell'esperimento, indossare guanti mentre si rimuove il blocco di vetro e posizionarlo nella stazione di montaggio. Utilizzare pinzette con impugnature in gomma per rimuovere con cura il chip AFM e riposizionare la punta utilizzata nella posizione della scatola di stoccaggio orientata fuori dall'accesso per indicare che è stata utilizzata. Per riferimento futuro, si noti quale suggerimento è stato utilizzato nell'esperimento.

Qui viene mostrata una scansione AFM rappresentativa su una cellula HEK vivente. L'altezza di questa particolare cella HEK era di circa 10 micron, come dimostrato dalla scansione di linea. Qui, è possibile osservare un esempio di scansione scadente a causa di una scelta impropria della punta AFM.

In questa immagine, i pixel neri apparivano all'apice della cella indicando che la zona PA AFM era fuori portata a causa di una grande altezza della cella. Anche l'estremità del sbalzino AFM appare nell'immagine a causa dell'offset della punta combinato con un'altezza insufficiente della punta rispetto all'altezza della cella. Questi artefatti nell'immagine AFM indicano che una punta AFM diversa avrebbe dovuto essere scelta per l'immagine della cella.

È possibile eseguire tre immagini confocali a colori. Ad esempio, per visualizzare il nucleo cellulare, i micro tubuli e la membrana lipofila. L'analisi delle impronte della punta in combinazione con il modello nanomeccaccano, consente la generazione di una mappa del modulo della superficie.

Qui viene mostrata una corrispondente proiezione 3D della pila Z confocale laser. Le scansioni AFM e le mappe del modulo misurate possono anche essere acquisite per i microbi, come osservato in queste analisi rappresentative del batterio streptococcus mutans. Come dimostrato, una risoluzione migliore può essere raggiunta a questa scala con AFM, rispetto alla microscopia confocale tradizionale.

La mappatura della forza adesiva è una tecnica eseguita attraverso il conpokal per visualizzare le interazioni molecolari. Ad esempio, per studiare la modulazione delle molecole di superficie cellulare per osservare la cinetica legante. Conpokal inaugura un nuovo percorso per esplorare le relazioni delle funzioni della struttura nella microbiologia medica.

Ad esempio, gli eventi fisici e chimici e lo strato di peptidoglycan possono essere collegati alla resistenza agli antibiotici.