Name: Imaging super-risoluzione per studiare la co-localizzazione di proteine e marcatori sinaptici nei neuroni primari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Impara a utilizzare la microscopia SIM per studiare la co-localizzazione di proteine nei neuroni primari di ippocampo di topo. Questo protocollo dettagliato permette di raggiungere una risoluzione di circa 100 nanometri.

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Gli autori ringraziano Edoardo Micotti per la critica costruttiva del manoscritto. Lo studio è stato sostenuto da BrightFocus A2019296F, di Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), di Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) e della Rete di Formazione Innovativa Marie skadorwska-Curie (JK).

1. Culture primarie
<ol><li>Coltura mouse ippocampo primario neuroni in coperture camerate (come Ibidi μ-Slide 8 Well o Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) che corrispondono al requisito obiettivo per #1.5 (0.17 mm) coprelo spessore.</li>
	<li>Coperture con rivestimento camerato con 100 lL di poli-L-lysine (100 g/mL).</li>
	<li>Il giorno successivo, lavare due volte i coperture con camera con salina sterile tamponata al fosfato (PBS).</li>
	<li>Per ottenere i neuroni primari del topo, isolare gli ippocampi da P1-P4cuccioli 23.</li>
	<li>Posizionare l'ippocampo sezionato in 10 mL di Dissection Media (Tabella 1) e lasciarli depositare nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta sterile, rimuovere con attenzione il Dissection Media, lasciando l'ippocampo indisturbato nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di Media 1 (Tabella 1) all'ippocampo e incubare per 30 minuti a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta sterile, rimuovere con attenzione Media 1, lasciando l'ippocampo indisturbato nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di media 2 (Tabella 1) e lasciare il tubo centrifuga (coperto) sotto il cofano orizzontalmente per 45 minuti.</li>
	<li>Lasciare che il tubo di centrifuga sia in piedi verticalmente per consentire al tessuto di depositarsi nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta sterile, rimuovere con attenzione Media 2, lasciando l'ippocampo indisturbato nella parte inferiore del tubo di centrifuga.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di supporto 3 (Tabella 1).</li>
	<li>Utilizzando una pipetta p1000 con una punta filtrata, dissociare meccanicamente le cellule dal tessuto.</li>
	<li>Trasferire il supernatant, in cui si trovano i neuroni isolati, in un tubo di centrifuga di 15 mL.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione delle celle per 2 min a 300 x g a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, le cellule si trovano nella parte inferiore del tubo di centrifuga. Utilizzando una pipetta sterile scartare il supernante.</li>
	<li>Riespose le celle in 1 mL di Media 4.</li>
	<li>Utilizzare un filtro di 70 m per eliminare le celle non dissociate.</li>
	<li>Contare le cellule vitali in una camera di Bàrker aggiungendo 1 soluzione blu Trypan da 0,4 % a 19 L della sospensione cellulare.</li>
	<li>Cellule piacche a 70.000 cellule/pozzo in un volume di 200 L per pozzo.</li>
	<li>Lasciare che le cellule si alleghino per 2 h in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi e al 5% di CO2.</li>
	<li>Togliere le coperture camerate dall'incubatrice e sostituire con cura il mezzo con 200 L di Culture Media.</li>
	<li>Lasciare le coperture camerate in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi e al 5% di CO2.</li>
	<li>Sostituire un terzo del mezzo con supporti di coltura freschi ogni 5-7 giorni.</li>
	<li>Attendere fino a quando i neuroni primari ippocampo sono completamente maturati (12-14 giorni dopo la placcatura) per eseguire studi di co-localizzazione.</li>
</ol>2. Colorazione dell'immunofluorescenza
<ol><li>Prendi le coperte camerate dall'incubatrice.</li>
	<li>Rimuovere il supporto.</li>
	<li>Lavare rapidamente i pozzetti con 200 L di PBS.</li>
	<li>Aggiungere il 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS (200 L/well) ai neuroni per fissarli rapidamente.</li>
	<li>Incubare le cellule per 15 min a RT.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione PFA.</li>
	<li>Permeare le cellule aggiungendo PBS con 0,2% Tritone X-100 (200 l/pozzo).</li>
	<li>Incubare per 1 min a RT.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione e incubare i campioni con 1% di albumina di siero bovino (BSA) in PBS (200 l/pozzo) per 1 h a RT per coprire passivamente tutte le superfici di legame libero della piastra con una proteina irrilevante per l'analisi. Un buffer di blocco basato su BSA senza Triton X-100 riduce lo sfondo dell'anticorpo in modo più efficiente rispetto allo stesso buffer con 0,2% Triton X-100.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione.</li>
	<li>Aggiungere l'anticorpo primario di scelta diluito in una soluzione PBS contenente 1% BSA e 0,2% Triton X-100 (120-200 L/well, a seconda della diluizione e della disponibilità dell'anticorpo). Incubare i campioni per 2 h.<ol>
<li>Come controllo negativo, non aggiungere alcun anticorpo primario a uno dei pozzi. Contemporaneamente possono essere utilizzati più anticorpi di specie diverse contro obiettivi diversi. Usa un anticorpo contro MAP2 (un marcatore neuronale) allevato nel pollo, un anticorpo contro PSD95 o sinotofisi allevati nel topo e un anticorpo contro una proteina bersaglio allevata nel coniglio. Ciò consente analisi SIM a tre colori.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare rapidamente i pozzetti tre volte con PBS (200 L/pozzo).</li>
	<li>Aggiungere anticorpi secondari (gli anticorpi secondari dyLight e Alexa possono essere entrambi utilizzati) diluiti in una soluzione PBS contenente 1% BSA e 0,2% Triton X-100 (200 l/well). Incubare i campioni per 1 h a RT.</li>
	<li>Lavare rapidamente i pozzetti tre volte con PBS (200 L/pozzo).</li>
	<li>Aggiungere il colorante Hoechst ad una concentrazione di 1 g/mL diluito in PBS (200 L/well) ai nuclei di macchia. Incubare i campioni per 10 minuti a RT.</li>
	<li>Lavare rapidamente i pozzi due volte con PBS.</li>
	<li>Montare le celle utilizzando un montante compatibile con la SIM. Utilizzare 10 L/pozzo di ProLong Glass Antifade Mountant.</li>
	<li>Coprire e proteggere le cellule con un vetro di copertura (ad esempio, un sottovecchiale rotondo con un diametro di 8 mm). Possono essere utilizzati anche quelli quadrati.</li>
	<li>Conservare le copertine a camera a RT e attendere almeno 48 h prima di acquisire le immagini. Diamond Glass richiede almeno due giorni di stagionatura prima delle acquisizioni di super-risoluzione.</li>
</ol>3. Controllo della specificità dell'anticorpo
NOTA: utilizzare due strategie per assicurare la specificità degli anticorpi. La prima strategia consiste nell'utilizzare almeno due anticorpi diversi che prendono di mira lo stesso substrato. La seconda strategia è la neutralizzazione degli anticorpi mediante incubazione con il bersaglio proteico purificato o l'epitopo utilizzato per sollevare l'anticorpo.
<ol><li>Incubare l'anticorpo di scelta con cinque volte superiore del bersaglio ricombinante o epitopo per 1 h a RT in 1% BSA in PBS.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, utilizzare l'anticorpo neutralizzato alla concentrazione abituale per la colorazione come descritto sopra a partire da 2.11.</li>
</ol>4. Calibrazione al microscopio
NOTA: Usiamo abitualmente un sistema microscopo N-SIM Super-Resolution prodotto da Nikon per gli studi di super-risoluzione. Tuttavia, molte altre aziende offrono anche microscopi super-risoluzione nei loro cataloghi. Anche se sono descritte indicazioni specifiche per il sistema N-SIM di Nikon, le istruzioni che seguono possono essere generalizzate ad altri sistemi. Prima dell'acquisizione di immagini SIM, il sistema richiede una corretta calibrazione con specifiche perline fluorescenti di dimensioni sub-risoluzione. Un esempio sono le microsfere TetraSpeck. Queste perle sono macchiate con diversi coloranti fluorescenti per consentire la calibrazione di diversi laser con un campione.
<ol><li>In un bagno d'acqua si sorrendono circa 1,8 x10 8 microsfere fluorescenti per 10 minuti. Il sistema N-SIM di Nikon richiede un campione di perline multicolore scarsamente popolate per la calibrazione. Questo potrebbe essere diverso per altri sistemi che richiedono un singolo strato denso di perline fluorescenti di dimensioni sub-risoluzione. Regolare il numero di particelle fluorescenti di conseguenza.</li>
	<li>Diluire le microsfere fluorescenti 1:500 in acqua doppia distillata.</li>
	<li>Sonicare una seconda volta per altri 10 minuti.</li>
	<li>Pipetto 15 L delle perline diluite in un pozzo di un coperture camerate.</li>
	<li>Lasciare asciugare la soluzione per 5 minuti a RT.</li>
	<li>Aggiungete 10 L della soluzione di montaggio e posizionate sopra un coperture da 8 mm.</li>
	<li>Attendere almeno 48 ore per consentire una corretta cura.</li>
	<li>Accendere il microscopio e i laser.</li>
	<li>Lasciare che il sistema si smori per raggiungere l'equilibrio termico di tutti i componenti del microscopio. N-SIM Super-Resolution Microscope System richiede almeno 3 ore.</li>
	<li>Selezionare l'obiettivo 100x.</li>
	<li>Avviare la calibrazione allineando i laser al centro del blocco di griglia di diffrazione. Nel sistema N-SIM, una manopola micrometrica e una telecamera dedicata consentono la centramento dei fasci di luce verso il bersaglio.</li>
	<li>Inserire il coperture camerate nel microscopio per la visualizzazione. Impostare il sistema sul coperture cameratesori del foglio regolando il collare di correzione obiettivo. Il software NIS, il software proprietario fornito con i sistemi N-SIM Super-Resolution Microscope, ha una funzione automatica per regolare i collari di correzione.</li>
	<li>Regolare la messa a fuoco del blocco di grata per ogni canale per garantire l'illuminazione del modello strutturato focalizzato sul campione. Il software NIS fornisce una funzione automatica per questa attività.</li>
	<li>Successivamente, acquisire immagini raw 3D-SIM delle microsfere multicolore. Ricostruire le immagini grezze per ottenere un'immagine super-risolta utilizzando il software al microscopio o la piattaforma software open-source per l'analisi delle immagini biologiche ImageJ24 e il plugin fairSIM25.</li>
	<li>Calcolare, per ogni lunghezza d'onda separata, la trasformazione di Fourier dell'immagine super-risolta ottenuta in 4.14. Se l'immagine trasformata non riesce a ottenere un modello simile a un fiore corretto, riavviare la calibrazione dalla 4.11 poiché la super-risoluzione non è stata raggiunta.</li>
	<li>Nell'immagine super-risolta, selezionare una singola microsfera e calcolarne il profilo di intensità per ogni canale per misurare la risoluzione raggiunta. Ora dovrebbe essere vicino a 100 nm lateralmente.</li>
	<li>Successivamente, eseguire la registrazione del canale sovrapponendo un'acquisizione multicanale delle microsfere. L'obiettivo è quello di collimate tutti i segnali di canale lateralmente e assia. Ciò eliminerà le aberrazioni cromatiche a causa del disallineamento dei diversi canali e aiuterà l'analisi di co-localizzazione.</li>
	<li>Confermare la qualità della calibrazione utilizzando le funzioni "Illumination Phase Steps" e "Illumination Pattern Focus" di SIMcheck26, una suite di plugin per l'applicazione open source ImageJ. A questo scopo, preparare un coperture camerate per ottenere un singolo strato denso di microsfere TetraSpeck e acquisire un'immagine 3D-SIM del campione. Analizzare l'immagine in ImageJ e, se vengono rilevate aberrazioni, riavviare la calibrazione del microscopio dal passaggio 4.11.</li>
</ol>5. Acquisizione
<ol><li>Iniziare ad analizzare il campione utilizzando un obiettivo 40x in modalità confocale o widefield. Ciò consente la navigazione all'esempio, mantenendo buoni dettagli e un ampio campo di visualizzazione.</li>
	<li>Utilizzare il segnale anticorpale MAP2 per identificare un'area che rappresenta i processi neuronali.</li>
	<li>Acquisire immagini del campione in modalità confocale per determinare la qualità della colorazione. Una scarsa qualità confocale si rifletterà nella scarsa qualità della SIM, richiedendo quindi lo scarto dei campioni.</li>
	<li>Se l'area e la qualità delle immagini sono soddisfacenti, impostare l'obiettivo su 100x.</li>
	<li>Applicare l'olio sull'obiettivo 100x.</li>
	<li>Acquisire un'immagine widefield o confocal che verrà utilizzata in seguito per valutare la qualità dell'immagine super-risolta (Figura 1A,B).</li>
	<li>Passare alla modalità 3D-SIM.</li>
	<li>Utilizzando le finestre di dialogo per impostare i parametri per l'acquisizione, selezionare l'impostazione di profondità di bit più alta disponibile per ottimizzare le informazioni sul colore. In genere, 16 bit è la scelta standard. Inoltre, per migliorare il rapporto segnale-rumore, selezionare un valore di bassa frequenza per l'acquisizione, ad esempio 1 MHz.</li>
	<li>Utilizzando finestre istogramma, impostare la potenza laser per ottenere una risposta lineare del segnale. Per evitare la perdita di informazioni, limitare i pixel saturi nelle immagini. Il sistema N-SIM utilizza una fotocamera Andor iXon3. Quando si lavora a 16 bit, scegliere un'intensità di destinazione di 16.000 per garantire la risposta lineare della fotocamera. In alternativa, scegli un intervallo compreso tra 30.000 e 45.000 per massimizzare la gamma dinamica dell'acquisizione.</li>
	<li>Impostare la potenza laser tra lo 0,1% e il 50% quando si imagingno i campioni e i tempi di esposizione tra 50 ms e 2 s. Le potenze laser superiori al 50% possono causare una rapida fotomarcazione dei fluorofori in uso.</li>
	<li>Avviare l'acquisizione delle immagini in modalità 3D-SIM.</li>
	<li>Utilizzare SIMcheck, una suite di plugin gratuiti per ImageJ, per valutare la qualità di acquisizione delle immagini raw.</li>
	<li>Se SIMCheck non rileva artefatti o problemi di qualità, acquisire un minimo di 10 immagini da 4 repliche tecniche per consentire l'analisi statistica.</li>
</ol>6. Post-produzione: ricostruzione dell'immagine
NOTA: le immagini acquisite in 3D-SIM sono immagini raw che devono essere elaborate per ottenere immagini super-risolte ricostruite. Una ricostruzione non corretta delle immagini non elaborati può portare a artefatti che potrebbero influire sull'analisi dei campioni. Si dovrebbe quindi prestare grande attenzione alla scelta corretta dei parametri di ricostruzione.
<ol><li>Elaborare le immagini raw utilizzando il software di analisi della ricostruzione al microscopio per ottenere un'immagine super-risolta (Figura 1C). In alternativa, utilizzare il plug-in <a0> ImageJ </a0> per ricostruire le immagini raw.</li>
	<li>Calcolare la trasformazione di Fourier delle immagini super-risolte utilizzando il software di ricostruzione al microscopio o ImageJ plugin SIMCheck. Una buona immagine ricostruita dovrebbe restituire, per ogni canale, un'immagine floreale. Se le immagini ricostruite non riescono a ricreare una forma floreale, riavviare dalle immagini raw e ricostruirle modificando i parametri di ricostruzione come il filtraggio Wiener, l'apodizzazione e la soppressione in ordine zero27. Nel software NIS, utilizzando l'anteprima per monitorare come la modifica dei parametri influisce sull'immagine risolta finale, modificare i parametri i) Contrasto di modulazione illuminazione, ii) Soppressione del rumore ad alta risoluzione e iii) Soppressione fuori fuoco.</li>
	<li>Successivamente, analizzare l'immagine ricostruita per rilevare in modo imparziale gli artefatti utilizzando NanoJ-SQUIRREL28, un plugin basato su ImageJ per valutare la qualità delle immagini super-risolte.</li>
	<li>Se NanoJ-SQUIRREL rileva gli artefatti, riavviali dalle immagini raw e ricostruiscili modificando i parametri di ricostruzione come il filtraggio Wiener, l'apodizzazione e la soppressione dell'ordine zero. Nel software NIS, utilizzando l'anteprima per monitorare il modo in cui la modifica dei parametri influisce sull'immagine risolta finale, modificare i parametri Contrasto modulazione illuminazione, Soppressione rumore ad alta risoluzione e Soppressione fuori fuoco.</li>
	<li>Utilizzare le immagini super-risolte per calcolare il profilo di co-localizzazione e/o i coefficienti di Pearson e Mander.</li>
</ol>7. Co-localizzazione con analisi del profilo
NOTA: Come primo passo per studiare la co-localizzazione tra marcatori sinaptici e una proteina di interesse, prendere un'immagine super-risolta e analizzare un singolo locus per determinare la sovrapposizione del segnale.
<ol><li>Identificare un singolo locus sull'immagine super-risolta.</li>
	<li>Ottenere i profili di intensità dei segnali fluorescenti del luogo di interesse.</li>
	<li>Esportare i dati.</li>
	<li>Utilizzare GraphPad Prism, o un software di analisi simile, per normalizzare tutti i picchi di segnale e ottenere intensità di segnale comparabili per ogni canale con l'obiettivo finale di determinare la co-localizzazione specifica del locus.</li>
</ol>8. Quantificazione dei coefficienti di Pearson e Mander
NOTA: Se l'analisi del profilo ha suggerito la co-localizzazione di singoli locus, un'analisi più generale dell'intera immagine può essere effettuata calcolando i coefficienti di Pearson e Mander29,30.
<ol><li>Utilizzare JACoP31, un plug-in ImageJ , per determinare i due parametri di co-localizzazione: Pearson's e Mander's.</li>
</ol>9. Analisi statistica
<ol><li>Utilizzare GraphPad Prism, o un software di analisi e grafica simile, per elaborare i dati raccolti con JACoP.</li>
	<li>Utilizzare almeno 40 immagini SIM per ogni condizione analizzata per ottenere grafici e per la pertinenza statistica.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Chiarire la struttura e la composizione della sinapsi è fondamentale per comprendere i processi fisiologici e patologici che regolano la memoria e la cognizione. Mentre nello stato normale, le sinapsi sono gli elementi costitutivi della memoria, sono anche alla base di disturbi neurologici complessi come il morbo di Alzheimer32. Il protocollo qui descritto serve a studiare la co-localizzazione delle proteine neuronali con una tecnica di microscopia super-risoluzione chiamata SIM. Utilizzando un pa...

La comprensione e la visione della sinapsi è cambiata enormemente dalla sua prima descrizione da Foster e Sherrington nel 18971. Da allora, la nostra conoscenza della comunicazione neuronale e dei processi molecolari alla base è cresciuta esponenzialmente2. È diventato chiaro che le sinapsi possono essere pensate come un sistema a due compartimenti: un compartimento pre-sinaptico contenente vesciche per il rilascio di neurotrasmettitori e un compartimento post-sinaptico con recettori3. Questa visione semplicistica, negli ultimi vent'anni, si è evoluta in una complessa rete di proteine necessarie per trasdurre il legame trasmettitore nella segnalazione4.
I vantaggi nella comprensione sono in parte dovuti a tecniche di super-risoluzione che hanno superato il limite di diffrazione della microscopia leggera convenzionale per soddisfare la dimensione delle sinapsimeglio 5,6,7,8,9,10. A causa del limite di diffrazione, un microscopio ottico non può raggiungere una risoluzione superiore a 200 nmlateralmente11,12. Per aggirare questo limite, sono state create tecniche di super-risoluzione, utilizzando approcci diversi e raggiungendo diverse risoluzioni limite di sub-diffrazione: SIM, STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) e STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM raddoppia la risoluzione spaziale dei sistemi di microscopia a campo largo basati su laser inserendo una griglia di diffrazione nel percorso del fascio di eccitazione15. La grata mobile diffracts i raggi laser per creare un modello di illuminazione noto, di solito strisce. Questo modello di luce appositamente strutturato è sovrapposto alla distribuzione spaziale sconosciuta del colorante fluorescente (del campione). Le frange di interferenza formate dai due modelli codificano per dettagli fini altrimenti indistinguibili con la normale microscopia a campo largo. L'immagine finale super-risolta si ottiene combinando e decodificando con metodi matematici diverse immagini grezze dello stesso campione ottenute dalle traduzioni e rotazioni della grata di diffrazione. La risoluzione delle immagini super-risolte raggiunge i 100 nm nei 500 nm nelle direzioni assiali per 2D-SIM15 o 100 nm nei lateral e 250 nm nelle direzioni assiali per 3D-SIM16.
La nuova comprensione della sinapsi è ancora più importante alla luce dei molti disturbi neurologici in cui la disfunzione sinaptica svolge un ruolo importante nell'insorgenza e nella progressione17,18. Morbo di Alzheimer, Sindrome di Down, Morbo di Parkinson, malattie prioni, epilessia, disturbi dello spettro autistico e sindrome X fragile tra gli altri sono stati collegati ad anomalie nella composizione sinaptica, morfologia e funzione19,20,21,22.
Recentemente, utilizzando una serie di anticorpi specifici suMO, abbiamo usato la SIM per mostrare la co-localizzazione nei neuroni ippocampali primari delle proteine SUMO con i marcatori pre e post-sinaptici synaptophysin e PSD95 al livello disuper-risoluzione 23. Questo ci ha permesso di confermare la prova di microscopia biochimica e confocale della localizzazione SUMO nei neuroni.
Qui, descriviamo un protocollo per studiare la localizzazione delle proteine nei neuroni primari dell'ippocampo dei topi. Allo stesso tempo, questo protocollo può essere adattato a diversi tipi di colture neuronali primarie.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di blu di tripano allo 0,4%&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>70 &micro; m filtro&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>Alexa</td><td>Thermo Fisher Anticorpo scientifico</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Anticorpo SENP1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-271360</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>B27 Integratore</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Chimica Albumina sierica bovina&nbsp;</td><td>Merck</td><td>5470</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck Life Science</td><td>21115</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Chambered Coverslips</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>DyLight</td><td>Thermo Fisher</td><td></td> <td>Scientific-Antibody</td></tr><tr><td>FBS (Hyclone)</td><td>GIBCO</td><td>SH3007002 (CHA1111L)</td><td>Serum</td></tr><tr><td>FluoSpheres microsfere modificate con carbossilato, 0,1 &mu; m, giallo&ndash; fluorescente verde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F8803</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>Glucosio Merck</td><td>Life Science</td><td>G8769</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050061</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck Life Science</td><td>H3537</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>L-Cisteina</td><td>Merck Scienze della Vita&nbsp;</td><td>C6852-25G</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>Merck</td><td>AB15452</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>MEM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>21575022</td><td></td></tr><tr><td>Medium MgCl</td><td>Merck Life Science</td><td>M8266</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>VWR International</td><td>1.091.371.000</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Life Technologies</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>Medium N-SIM Super Resolution Microscope</td><td>Nikon-Instrument</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Papain</td><td>Merck Life Science& nbsp;</td><td>P-3125</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td> chimica<td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Penna chimica</td></tr><tr><td>/Strep 10x</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>Soluzione</td></tr><tr><td>salina tamponata con fosfato chimico&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Poly-L lisina</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Glass Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36970</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>PSD95&nbsp;</td><td>NeuroMab</td><td>K28/43</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>Rotondo coprivetro</td><td>Thermo</td><td>12052712</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>SUMO1</td><td>Abcam</td><td>ab32058</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>Sinaptofisina&nbsp;</td><td>Merck</td><td>S5768&nbsp;</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td>Inibitore chimico</td></tr><tr><td>della tripsina&nbsp;</td><td>Merck Scienze della Vita&nbsp;</td><td>T9003-500MG</td><td>Chimico</td></tr></tbody></table>

imaging super-risoluzione per studiare la co-localizzazione di proteine e marcatori sinaptici nei neuroni primari

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Le sinapsi sono gli elementi funzionali dei neuroni e i loro difetti o perdite sono alla base di diversi disturbi neurodegenerativi e neurologici. Gli studi di imaging sono ampiamente utilizzati per studiare la loro funzione e plasticità in condizioni fisiologiche e patologiche. A causa delle loro dimensioni e struttura, gli studi di localizzazione delle proteine richiedono tecniche di imaging ad alta risoluzione. In questo protocollo, descriviamo una procedura per studiare nei neuroni primari la co-localizzazione delle proteine bersaglio con marcatori sinaptici a un livello di super-risoluzione utilizzando la microscopia ad illuminazione strutturata (SIM). La SIM è una tecnica di illuminazione a luce modellata che raddoppia la risoluzione spaziale della microscopia a campo largo, raggiungendo un dettaglio di circa 100 nm. Il protocollo indica i controlli e le impostazioni necessari per robusti studi di co-localizzazione e una panoramica dei metodi statistici per analizzare correttamente i dati di imaging.

Vi presentiamo qui il flusso di lavoro standard per studiare la co-localizzazione delle proteine neuronali. Abbiamo prima calibrato il microscopio e successivamente abbiamo eseguito l'analisi SIM dei campioni. Per calibrare il sistema, abbiamo usato microsfere fluorescenti di diametro di 0,1 m. Dopo aver ottenuto immagini 3D-SIM super-risolte delle perline, i dati dell'immagine sottostanti vengono trasformati da Fourier per convertirli nuovamente in una rappresentazione di frequenza spaziale. Nella F...

Questo protocollo mostra come impiegare la microscopia super-risoluzione per studiare la co-localizzazione delle proteine nelle colture neuronali primarie.

Imaging super-risoluzione per studiare la co-localizzazione di proteine e marcatori sinaptici nei neuroni primari

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Le sinapsi sono gli elementi funzionali dei neuroni e i loro difetti o perdite sono alla base di diversi disturbi neurodegenerativi e neurologici. Gli studi di imaging sono ampiamente utilizzati per indagare la loro funzione e plasticità in condizioni fisiologiche e patologiche. A causa delle loro dimensioni e struttura, gli studi di localizzazione delle proteine richiedono tecniche di imaging ad alta risoluzione.In questo protocollo, descriviamo una procedura per studiare nei neuroni primari la co-localizzazione delle proteine bersaglio con marcatori sinaptici a livello di super-risoluzione usando la microscopia ad illuminazione strutturata. La SIM è una tecnica di illuminazione della luce a motivi geometrici che raddoppia la risoluzione spaziale della microscopia a campo largo, raggiungendo un dettaglio di circa 100 nanometri. Il protocollo indica i controlli e le impostazioni necessari per robusti studi di co-localizzazione e una panoramica dei metodi statistici per analizzare correttamente i dati di imaging.La chiave per consentire l'analisi a livello di super-risoluzione sono, tuttavia, i reagenti utilizzati durante l'acquisizione, come le coverlip a camera e le soluzioni di montaggio compatibili con l'indice di diffrazione dell'obiettivo. Per ottenere un neurone primario ippocampale del topo, isolare gli ippocampi dai cuccioli P1 a P4. Celle a piastre a 70.000 cellule per pozzo in un volume di 200 microlitri per pozzo.Attendere fino a quando i neuroni primari ippocampali sono completamente maturi da 12 a 14 giorni dopo la placcatura per eseguire studi di co-localizzazione. Aggiungere il 4% di paraformaldeide, PFA, nei microlitri PBS 200 per pozzo ai neuroni per risolverli rapidamente. Rimuovere la soluzione e incubare i campioni con albumina siere bovina all'1%, BSA, in PBS a 200 microlitri per pozzo per un'ora a temperatura ambiente per coprire passivamente tutte le superfici free-binding della piastra con una proteina irrilevante per l'analisi.Un buffer di blocco basato su BSA senza Triton X-100 riduce lo sfondo dell'anticorpo in modo più efficiente rispetto allo stesso buffer con lo 0,2%Triton X-100. Aggiungere l'anticorpo primario. Come controllo negativo, non aggiungere anticorpi primari a uno dei pozzi.Montare celle utilizzando un montante compatibile con SIM, ad esempio ProLong Glass Antifade Mountant. Coprire e proteggere le celle con un coverglass, ad esempio un coverglass rotondo con un diametro di otto millimetri.Possono essere utilizzati anche quelli quadrati. Conservare le copertine a camera a temperatura ambiente e attendere almeno 48 ore prima di acquisire le immagini. Il vetro diamanto richiede almeno due giorni di polimerizzazione prima delle acquisizioni di super-risoluzione.Utilizzare due strategie per garantire la specificità degli anticorpi. Il primo è l'uso di almeno due anticorpi diversi che prendono di mira lo stesso substrato. La seconda strategia è la neutralizzazione degli anticorpi mediante incubazione con il bersaglio proteico purificato, o l'usato per sollevare l'anticorpo.Utilizziamo regolarmente un microscopio a super risoluzione N-SIM prodotto da Nikon per la nostra analisi. Le istruzioni che seguono devono essere destinate all'acquisizione di immagini SIM indipendentemente dal microscopio d'uso. È anche importante massimizzare le prestazioni del microscopio per eseguire una calibrazione accurata degli strumenti, tra cui anello di correzione, allineamento laser e messa a fuoco del blocco di griglia.Prima dell'acquisizione delle immagini SIM, il sistema richiede una calibrazione adeguata con specifiche perline fluorescenti di dimensioni sotto-risoluzione. Un esempio sono le microsfere di TetraSpeck. Queste perline sono macchiate con diversi coloranti fluorescenti per consentire la calibrazione di diversi laser con un campione.In un bagno d'acqua, sonicare circa 1,8 volte 10 fino all'8 ° microsfere fluorescenti per 10 minuti. Diluire le microsfere fluorescenti una su 500 in acqua distillata doppia. Sonicare una seconda volta per altri 10 minuti.Pipetta 15 microlitri delle perline diluite in un pozzo di un coperchio a camera. Lasciare asciugare la soluzione per cinque minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 10 microlitri della soluzione di montaggio, ad esempioProLong Glass e posizionare un coverslip di otto millimetri sopra. Attendere almeno 48 ore per consentire una corretta polimerizzazione. Accendi il microscopio e i laser.Lasciare riscaldare il sistema per raggiungere l'equilibrio termico di tutti i componenti del microscopio e il sistema di microscopio sim a super risoluzione richiede almeno tre ore. Selezionare l'obiettivo 100X. Avviare la calibrazione allineando i laser al centro del blocco di retiatura di diffrazione.Nel sistema N-SIM, una manopola del micrometro e una telecamera dedicata consentono di centrare i fasci di luce al bersaglio. Inserire la coverslip a camera del microscopio per la visualizzazione. Impostate il sistema allo spessore del coperchio camerato regolando il coperchio di correzione obiettivo.NIS Software, il software proprietario dotato di sistemi al microscopio a super risoluzione N-SIM, ha una funzione automatica per regolare la correzione dei colori. Regola la messa a fuoco del blocco di griglia per ogni canale per garantire un'illuminazione strutturata focalizzata del modello sul campione. Il software fornisce una funzione automatica per questa attività.Acquisisci immagini SIM 3D grezze delle microsfere multicolore. Calcola per ogni lunghezza d'onda separata la trasformata di Fourier dell'immagine super risolta. Se l'immagine trasformata non riesce a ottenere un modello corretto simile a un fiore, riavviare la calibrazione poiché la super-risoluzione non è stata raggiunta.Nell'immagine super-risolta, selezionare una singola microsfera e calcolarne il profilo di intensità per ogni canale per misurare la risoluzione raggiunta. Ora dovrebbe essere vicino a 100 nanometri lateralmente. Eseguire la registrazione del canale sovrapponendo un'acquisizione multicanale delle microsfere.L'obiettivo è quello di collimare tutti i segnali del canale lateralmente e assialmente. Ciò eliminerà le aberrazioni cromatiche dovute al disallineamento dei diversi canali e aiuterà l'analisi di co-localizzazione. Conferma la qualità della calibrazione utilizzando il passo della fase di illuminazione delle funzioni e la messa a fuoco modellata dell'illuminazione di SIMcheck, una suite di plugin per l'applicazione open source ImageJ.Inizia ad analizzare il campione usando un obiettivo 40X in modalità confocale o widefield. Ciò consente la navigazione del campione, mantenendo buoni dettagli e un ampio campo visivo. Utilizzare il segnale anticorpale MAP2 per rilevare un'area che rappresenta i processi neuronali.Acquisire immagini del campione in modalità confocale per determinare la qualità della colorazione. Passare all'obiettivo 100X. Applicare l'olio all'obiettivo 100X.Acquisire un'immagine widefield o confocal che verrà utilizzata in seguito per valutare la qualità dell'immagine super risolta. Passare alla modalità SIM 3D. Utilizzando le finestre di dialogo per impostare i parametri per l'acquisizione, selezionare l'impostazione di profondità di bit più alta disponibile per massimizzare le informazioni sul colore.In genere, 16 bit è la scelta standard. Inoltre, per migliorare il rapporto segnale-rumore, selezionare un valore a bassa frequenza per l'acquisizione, ad esempio un megahertz. Utilizzando le finestre dell'istogramma, impostare la potenza laser per ottenere una risposta lineare del segnale per evitare la perdita di informazioni, limitare i pixel saturi nelle immagini.Il sistema N-SIM utilizza una telecamera Andor iXon3. Quando si lavora a 16 bit, scegliere un'intensità target di 16.000 per garantire la risposta lineare della fotocamera. In alternativa, scegli un intervallo compreso tra 30.000 e 45.000 per massimizzare la gamma dinamica delle acquisizioni.Impostare la potenza del laser tra lo 0,1% e il 50% durante l'imaging dei campioni e i tempi di esposizione tra 50 millisecondi e due secondi. Potenze laser superiori al 50% possono causare un rapido fotobleaching dei fluorofori in uso. Inizia ad acquisire le immagini in modalità SIM 3D.Utilizza SIMcheck, una suite di plugin gratuiti per ImageJ, per valutare la qualità delle acquisizioni delle immagini grezze. Se SIMcheck non rileva artefatti o problemi di qualità, acquisire almeno 10 immagini da repliche tecniche complete per consentire l'analisi statistica. Le immagini acquisite sono dati grezzi che devono essere elaborati per ottenere immagini SIM ricostruite che verranno utilizzate per ulteriori analisi.Nel protocollo, suggeriamo di utilizzare synaptophysin e PSD-95 come marcatori pre e post sinaptici. È tuttavia possibile utilizzare marcatori aggiuntivi. Un enorme corpus di letteratura supporta l'uso di altre proteine, come la drebrina e il fagotto come marcatori sinaptici.Le immagini acquisite dalla SIM 3D sono immagini grezze che devono essere elaborate per ottenere immagini super risolte ricostruite. Una ricostruzione errata delle immagini non elaborati può portare a artefatti che influenzerebbero l'analisi dei campioni. Occorre pertanto prestare grande attenzione alla corretta scelta dei parametri di ricostruzione.Elaborare le immagini non elaborati utilizzando il software di analisi della ricostruzione al microscopio per ottenere un'immagine super risolta. In alternativa, utilizza un fairSIM del plugin ImageJ liberamente disponibile per ricostruire le immagini grezze. Calcola la trasformata di Fourier delle immagini super risolte utilizzando il software di ricostruzione del microscopio o il plug-in ImageJ SIMcheck.Una buona immagine ricostruita dovrebbe restituire, per ogni canale, un'immagine simile a un fiore. Se le immagini ricostruite non riescono a ricreare una forma simile a un fiore, riavviare dalle immagini non elaborati e ricostruirle modificando i parametri di ricostruzione, ad esempio il filtraggio lineare, l'apodizzazione e la soppressione dell'ordine zero. Nel software NIS che utilizza l'anteprima per monitorare in che modo la modifica dei parametri influisce sull'immagine risolta finale, modificare il contrasto di modulazione dell'illuminazione del parametro, la soppressione del rumore ad alta risoluzione e la soppressione della messa a fuoco.Analizza l'immagine ricostruita per rilevare in modo imparziale gli artefatti utilizzando NanoJ-SQUIRREL, un plugin basato su ImageJ, per valutare la qualità delle immagini super risolte. Nella nostra analisi della co-localizzazione, abbiamo usato due approcci. Il primo è un approccio visivo basato sull'analisi del profilo che mostra singoli eventi di co-localizzazione e che identifica il contributo di ogni canale.Come primo passo per studiare la co-localizzazione tra marcatori sinaptici e una proteina di interesse, prendi un'immagine super risolta e analizza un singolo locus per determinare la sovrapposizione del segnale. Identifica un singolo locus sull'immagine super risolta. Ottenere i profili di intensità dei segnali fluorescenti al luogo di interesse.Se l'analisi del profilo ha suggerito la co-localizzazione del singolo locus, un'analisi più generale dell'intera immagine può essere effettuata calcolando i coefficienti di Pearson e Mander. Usa JACoP, un plugin ImageJ, per determinare due parametri di co-localizzazione, Pearson's e Mander's. Dopo aver calibrato il sistema e valutato la qualità delle immagini ricostruite, abbiamo iniziato ad analizzare le colture neuronali primarie macchiate con un anticorpo contro MAP2, un marcatore neuronale, PSD-95, un marcatore postinaptico e la nostra proteina bersaglio SUMO1.Per prima cosa abbiamo analizzato il campione eseguendo la microscopia confocale a quattro canali con un obiettivo 40X. Dopo aver selezionato un'area che rappresenta i processi neuronali, siamo passati a un obiettivo 100X. Abbiamo acquisito immagini sia confocali che SIM della stessa area per valutare la qualità della ricostruzione con NanoJ-SQUIRREL ed eseguire analisi di co-localizzazione.Chiarire la struttura e la composizione della sinapsi è fondamentale per la comprensione dei processi fisiologici e patologici che regolano la memoria e la cognizione. Mentre in stato normale le sinapsi sono gli elementi costitutivi della memoria, sono anche alla base di complessi disturbi neurologici, come una delle forme più comuni di demenza morbo di Alzheimer. Il protocollo qui descritto consente lo studio della composizione proteica delle sinapsi con una tecnica di microscopia a super risoluzione chiamata microscopia ad illuminazione strutturata.

super-resolution-imaging-to-study-co-localization-proteins-synaptic

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Neuroscience

Neuroscienze

Questo protocollo dettagli come quantificare il numero delle sinapsi sia dissociato cultura neuronale e nelle sezioni cerebrali con immunocitochimica. Utilizzando vano anticorpi specifici, abbiamo etichetta terminali presinaptici così come i luoghi di specializzazione post-sinaptici. Si definiscono sinapsi come punti di colocalizzazione tra i segnali generati da questi marcatori.

Sinapsi quantificare: un Immunocitochimica basato su analisi per quantificare Numero Synapse

Questa relazione dimostra una tecnica per isolamento meccanico di singoli neuroni vitali mantenendo attaccato boutons presinaptica. Vibrodissociated neuroni hanno il vantaggio di una produzione rapida, eccellente controllo farmacologico e migliorato lo spazio-clamp senza influenza dalle cellule vicine. Questo metodo può essere utilizzato per l'imaging di elementi sinaptica e di patch-clamp registrazione.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Un metodo è descritto per l'etichettatura di neuroni con coloranti fluorescenti in predeterminate funzionali micro-domini della neocorteccia. Primo, imaging segnale intrinseco ottico viene utilizzato per ottenere una mappa funzionale. Poi microscopia a due fotoni è usato per l'etichetta e neuroni di immagine all'interno di un micro-dominio della mappa.

Etichettatura mirata di neuroni in una specifica funzionale Micro-dominio della neocorteccia combinando segnale intrinseca e due fotoni Imaging

Questo articolo descrive un protocollo di lavoro di immagine spine dendritiche di neuroni dell'ippocampo in vitro utilizzando Structured Illumination Microscopy (SIM). Microscopia super-risoluzione usando SIM fornisce risoluzione di immagine notevolmente oltre il limite di diffrazione della luce in tutte le tre dimensioni spaziali, permettendo l'imaging di singole spine dendritiche con maggiore dettaglio.

Imaging spine dendritiche di Rat Primaria neuroni dell&#39;ippocampo utilizzando Structured Illumination Microscopy

Si descrive come implementare fotoattivati ​​microscopia localizzazione (PALM) a base di studi di vescicole in fissi, neuroni in coltura. I componenti chiave del nostro protocollo includono etichettatura vescicole con chimere fotoconvertibile, la raccolta di immagini crude scarsamente campionate con un sistema di microscopia super-risoluzione, e l'elaborazione delle immagini crude per produrre un'immagine super-risoluzione.

Super-Resolution Imaging di vescicole neuronali Dense-core

Questo video mostra la procedura di craniotomia che consente l'imaging cronico dei neuroni nella corteccia retrospleniale del topo utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo nella linea transgenica Thy1-GFP. Questo approccio è combinato con l'iniezione di virus adeno-associato che esprime mCherry nell'ippocampo dorsale. Queste tecniche consentono il monitoraggio a lungo termine della plasticità strutturale dipendente dall'esperienza in RSC.

Simultanea a due fotoni<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

Qui mostriamo come quantificare il numero e la distribuzione spaziale delle zone attive sinaptiche In Drosophila melanogaster fotorecettori, evidenziata con un marcatore molecolare geneticamente codificato, e la loro modulazione dopo una prolungata esposizione alla luce.

Analizzando Synaptic Modulazione di<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorecettori dopo l&#39;esposizione alla luce prolungata

Qui descriviamo una procedura per tessuto di compensazione, l'etichettatura fluorescente e su larga scala di formazione immagine del tessuto di cervello di topo che, quindi, permette la visualizzazione dell'organizzazione tridimensionale dei tipi delle cellule nella neocorteccia.

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

Qui, descriviamo un approccio quantitativo per determinare la distribuzione di una proteina sinaptica rispetto una proteina marker mediante immunofluorescenza, microscopia confocale e analisi computerizzata.

Quantificare la distribuzione eterogenea di una proteina sinaptica nel cervello del Mouse mediante immunofluorescenza

Qui, dimostriamo come combinare la trasfezione di neuroni primari di roditori ippocampali con l'imaging confocale su cellule vive per analizzare gli effetti patologici indotti dalle proteine sul trasporto assonale e identificare percorsi meccanicistici che mediano questi effetti.

Utilizzo dell'imaging su cellule vive per misurare gli effetti delle proteine patologiche sul trasporto assonale nei neuroni primari dell'ippocampo

Impara a utilizzare la microscopia SIM per studiare la co-localizzazione di proteine nei neuroni primari di ippocampo di topo. Questo protocollo dettagliato permette di raggiungere una risoluzione di circa 100 nanometri.

Imaging super-risoluzione per studiare la co-localizzazione di proteine e marcatori sinaptici nei neuroni primari

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