Name: Ottenere Microglia Umana da Tessuto Cerebrale Umano Adulto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Impara a isolare microglia primarie da tessuto cerebrale umano adulto con questo protocollo robusto ed economico. La tecnica garantisce un'elevata resa cellulare per studi di neuroscienza e biologia cellulare.

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Il laboratorio di SJ è stato istituito con sovvenzioni istituzionali dell'IITJ ed è finanziato da sovvenzioni del Dipartimento di Biotecnologie (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) e del Ministero dell'Elettronica e della Tecnologia dell'Informazione dell'India (n. 4(16)/2019-ITEA). Le sezioni del tessuto cerebrale umano sono state ottenute dall'All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur dopo l'autorizzazione del comitato etico istituzionale. Ringraziamo Mayank Rathor, membro B.Tech Student della Design and Arts Society IIT Jodhpur, per il supporto alla videografia.

Tutti i tessuti sono stati acquisiti dopo l'autorizzazione etica dai comitati etici dell'Indian Institute of Technology Jodhpur e dell'All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur.
1.Acquisizione ed elaborazione dei tessuti (giorno 0)
<ol><li>Raccogliere il tessuto in un tubo da 50 mL contenente 10 mL di liquido cerebrospinale artificiale freddo di ghiaccio (aCSF) (2 mM CaCl2∙2H2O, 10 mM glucosio, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2∙6H2O, 202 mM saccarosio)20. Assicurarsi che il tubo sia conservato sul ghiaccio se il tessuto deve essere trasferito in una posizione diversa. NOTA: Preparare l'ACSF in acqua distillata autoclave. Filtrare con il filtro della siringa da 0,22 m nella cappa laminare. Questo può essere conservato per 1 mese a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Pulire attentamente il tubo di raccolta con il 70% di alcol e trasferirlo in una camera a flusso d'aria laminare attico.</li>
	<li>Scartare aCSF con attenzione e pesare il tessuto in una condizione asetica. Il peso del tessuto è essenziale per calcolare il volume di trypsin-EDTA necessario per i passaggi successivi.</li>
	<li>Mantenere il tessuto in aCSF fresco caldo a 37 gradi centigradi per 5 minuti. Questo passaggio è fondamentale per evitare la morte delle cellule.</li>
	<li>Scartare l'aCSF e lavare il tessuto una volta con 1x PBS (salina tamponata di fosfato) a 37 gradi centigradi. Assicurarsi che tutto il sangue sia lavato via con ripetuti lavaggi PBS (se necessario).</li>
	<li>Incubare il tessuto in PBS caldo, a 37 gradi centigradi, per 5 min.</li>
	<li>Scartare pbS con attenzione e trasferire il tessuto in un piatto Petri sterilizzato. PBS può essere rimosso con una pipetta. Questo impedirà qualsiasi perdita di tessuto.</li>
	<li>Tagliare a dadini il tessuto in piccoli (almeno 1 mm3) pezzi utilizzando un bisturi sterile. Il tessuto tagliato finemente fornisce una superficie tissunte più elevata per la dissociazione dei tessuti mediante la trypsina-EDTA garantendo una resa più elevata.</li>
	<li>Trasferire il tessuto tagliato a dadini in un tubo da 50 mL contenente un tessuto a 10 mL/g di 0,25% di trypsin-EDTA e mescolare mediante pipetta da 10 mL. Aggiungere 2 mL di trypsin/EDTA a un piatto Petri e lavare accuratamente il piatto con l'aiuto di pipetta. Aggiungere questa trypsin di nuovo al tubo di falco. Questo riduce al minimo la perdita di tessuto e cellule durante la morte.</li>
	<li>Incubare il tubo su uno shaker per 30 minuti a 37 gradi centigradi a 250 giri/min. Questo passaggio aumenta la dissociazione delle cellule dal tessuto.</li>
	<li>Alla fine dell'incubazione, aggiungere 10 mL di mezzo neutralizzante (50% DMEM/50% F12 con glutammina, 1% penicillina-streptomicina, 10% FBS) per neutralizzare la metapsina. Mescolare con una pipetta sierologica da 10 mL. La quantità di supporti di neutralizzazione aggiunti deve essere uguale alla quantità di trypsin utilizzata.</li>
	<li>Centrifugare il tubo a 2.000 x g a 4 gradi centigradi per 10 minuti.</li>
	<li>Scartare il supernatante e ri-sospendere il pellet in 1 mL di media coltura (50% DMEM/50% F12 con glutammina, 1% penicillina-streptomicina, 20% L929 supernante, 10% FBS). NOTA: le cellule L929 sono coltura in DMEM (DMEM con glutammina, 1% penicillina-streptomicina, 10% FBS). Il metodo di coltura consigliato da ATCC deve essere seguito per le impostazioni cultura delle celle. Supernatant deve essere raccolto dal fiaschetta di coltura che è almeno 75% confluente. Può essere raccolto alla rinfusa e conservato a -80 gradi centigradi per prevenire il degrado dei fattori di crescita. Si consiglia di aggiungere L929 supernatant separatamente in flaconi invece di aggiungere al supporto di coltura stock.</li>
	<li>Placcare le cellule in un pallone T-25, adatto per le cellule aderenti, e aggiungere 4 mL di mezzo di coltura aggiuntivo. Incubare il pallone a 37 gradi centigradi con 5% CO2. Agitare con cura il flacone per disperdere omogeneamente il tessuto. Evitare di portare il supporto al collo del flacone, mentre agitare, in quanto questo può aumentare le probabilità di contaminazione.</li>
</ol>2.Coltura cellulare (Giorno 2)
<ol><li>Raccogliere i supporti dal flacone di coltura T-25 preparato il giorno 0 in tre tubi centrifuga da 1,5 mL raccogliendo lo stesso volume di supporti in ogni tubo. Lavare il pallone una volta con 1 x PBS. Agitare delicatamente il pallone per rimuovere eventuali frammenti di tessuto residuo rimasti. Evitare di agitare duramente il pallone in quanto eventuali frammenti residui non influenzeranno negativamente la coltura. Aggiungere supporti di 5 mL di coltura fresca al pallone.</li>
	<li>Centrifugare i supporti raccolti a 1.466 x g (4000 rpm) a 4 gradi centigradi per 4 minuti.</li>
	<li>Scartare il supernatant da ogni tubo e aggiungere 1 mL di mezzo di coltura a uno dei tubi. Mescolare accuratamente con pipetta. Aggiungere in serie il supporto misto con le cellule ad altri tubi. Mescolare accuratamente con pipetta e mettere in comune le celle in un tubo.</li>
	<li>Piastrare le cellule in un pallone T-25 separato, adatto per le cellule aderenti. Aggiungere 4 mL di mezzo di coltura e incubare il pallone a 37 gradi centigradi con 5% CO2.</li>
</ol>3.Coltura cellulare (Giorno 4)
<ol><li>Scartare il supporto da entrambi i flaconi e aggiungere nuovi 5 mL di supporti di coltura al flacone.</li>
	<li>Incubare il pallone a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 2 giorni.</li>
</ol>4. Cultura cellulare (Giorno 6)
<ol><li>Le cellule saranno pronte per ulteriori esperimenti.</li>
</ol>

<ol><li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+-+more+than+just+brain+glue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li>
<li>Lenz, K. M., Nelson, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+Beyond%3A+Innate+Immune+Cells+As+Regulators+of+Brain+Development+and+Behavioral+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function.</a> Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).</li>
<li>Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+heterogeneity+in+tissues%3A+phenotypic+diversity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions.</a> Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).</li>
<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li>
<li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Alzheimer%27s+disease%3A+A+microglial+conundrum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).</li>
<li>Tremblay, M. -E., Cookson, M. R., Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+phagocytic+clearance+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16(2019).</li>
<li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Functions+of+Microglia+in+Ischemic+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).</li>
<li>Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Central+Nervous+System+Inflammation+and+Multiple+Sclerosis+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology.</a> Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).</li>
<li>Loane, D. J., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+TBI+brain%3A+The+good%2C+the+bad%2C+and+the+dysregulated%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated.</a> Experimental Neurology. 275 (03), Pt 3 316-327 (2016).</li>
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<li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li>
<li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li>
<li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inflammasome+Sensor%2C+NLRP3%2C+Regulates+CNS+Inflammation+and+Demyelination+via+Caspase-1+and+Interleukin-18%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811(2010).</li>
<li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li>
<li>Plant, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+beta+receptor+%28Lt+betaR%29%3A+dual+roles+in+demyelination+and+remyelination+and+successful+therapeutic+intervention+using+Lt+betaR-Ig+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).</li>
<li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Protective+Role+of+Nitric+Oxide+in+a+Neurotoxicant-+Induced+Demyelinating+Model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model.</a> The Journal of Immunology. 168 (1), 427(2002).</li>
<li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF%CE%B1+promotes+proliferation+of+oligodendrocyte+progenitors+and+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).</li>
<li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+macrophage+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived macrophage production.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50966(2013).</li>
<li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Rat+Bone+Marrow+Cells+Into+Macrophages+Under+the+Influence+of+Mouse+L929+Cell+Supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li>
<li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Microglia garantire l'omeostasi nel cervello normale e svolgere ruoli centrali nella fisiopatologia di varie malattie neurologiche4. I microglia sono centrali per il neurosviluppo e la formazione di sinapsi2. Gli studi microgliali si sono dimostrati fondamentali nella comprensione dello sviluppo e della progressione di diverse malattieneurologiche 4. La microglia roditore è il modello prevalente di scelta per gli studi primari sui microgliali, anche ...

Il sistema nervoso centrale (SNC) è costruito da una complessa rete di neuroni e cellule gliali1. Tra le cellule gliali, la microglia funziona come le cellule immunitarie innate del CNS2,3. Microglia sono responsabili del mantenimento dell'omeostasi nel sano CNS4. Microglia svolgono anche un ruolo importante nel neurosviluppo, potando le sinapsi2. Le microglia sono centrali nella fisiofisiologia di diverse malattie neurologiche, tra cui, ma non limitate; Morbo di Alzheimer5, Morbo di Parkinson6,ictus 7, sclerosi multipla8, lesione cerebrale traumatica9, dolore neuropatico10, lesione del midollo spinale11 e tumori cerebrali come gliomas12.
Gli studi relativi all'omeostasi e alle malattie del SNC utilizzano la microglia dei roditori a causa di una carenza di protocolli di isolamento primario di microglia umano13 efficientiin termini di costi ed efficienti in termini di tempo. I microglia roditori assomigliano alla microglia umana primaria nell'espressione di geni come Iba-1, PU.1, DAP12 e M-CSF recettori e sono stati efficaci nella comprensione del cervello normale emalore 13. È interessante notare che l'espressione di diversi geni immuni correlati come TLR4, MHC II, Siglec-11 e Siglec-3 varia tra microglia umana e roditore13. L'espressione di diversi geni varia anche nell'espressione temporale e nelle malattie neurodegenerative in entrambe lespecie 14,15. Queste differenze significative rendono la microglia umana un modello essenziale per studiare la funzione della microglia nell'omeostasi e nella malattia. La microglia umana primaria può anche essere uno strumento efficace per lo screening preclinico dei potenziali candidati ai farmaci16. Le ragioni di cui sopra sottolineano la crescente necessità di protocolli convenienti per l'isolamento della microglia umana primaria.
Abbiamo sviluppato un protocollo per l'isolamento della microglia umana primaria dal tessuto cerebrale umano adulto raccolto a seguito di una finestra chirurgica creata per le resezioni tumorali o altre resezioni chirurgiche. Il metodo in questo caso è notevolmente diverso dai metodi esistenti. Siamo stati in grado di isolare e coltura microglia dopo un tempo di transito di circa 75 minuti dal sito di raccolta dei tessuti per avviare il protocollo di isolamento in laboratorio. Abbiamo usato il supernatant di cellule fibroblasti L929 per promuovere la crescita di microglia isolata. Questo metodo si concentra specificamente sulla cultura e lo sviluppo di solo microglia primaria. La coltura risultante è di circa l'80% di microglia. Mentre altri protocolli forniscono una coltura arricchita di microglia per centrifugazione gradiente di densità, citometria di flusso e perline magnetiche, il protocollo è un modo rapido, semplice, robusto ed economico per coltura primaria microgliaumana 17,18,19,20. La capacità di utilizzare il tessuto cerebrale adulto vivo rimosso chirurgicamente invece di tessuti cerebrali fissi dai cadaveri dimostra un ulteriore vantaggio di questo metodo in contrasto con le procedureesistenti 18,21.

<table><tbody><tr><td>Soluzione antibiotico-antimicotica</td><td>Himedia</td><td>A002</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga (4 gradi C)</td><td>Sigma</td><td>146532</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga</td><td>Abdos</td><td>P10203</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubatore</td><td>New Brunswik</td><td>Galaxy 170 S</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Himedia</td><td>GRM077</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium con glutammina</td><td>Himedia</td><td>AL007S</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Himedia</td><td>RM9955</td><td></td></tr><tr><td>Tubo per flaconi (50 ml)</td><td>Thermo Fsiher Scientific&nbsp;</td><td>50CD1058</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina Ricinus communis agglutinina-1</td><td>Vettore</td><td>FL-1081</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Leica</td><td>DM2000LED</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield con DAPI</td><td>Sigma</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>GFAP anticorpo</td><td>GA5</td><td>3670S</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore per incubatore</td><td>New Brunswik Scientific</td><td>Innova 42</td><td></td></tr><tr><td>L929 linea cellulare</td><td>ATCC</td><td>NCTC clone 929 [cellula L, L-929, derivato del ceppo L] (ATCC&nbsp; CCL-1)</td><td></td></tr><tr><td>Flusso d'aria laminare</td><td>Thermo Fsiher Scientific&nbsp;</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Himedia</td><td>MB040</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monosodico</td><td>Merck</td><td>567545</td><td></td></tr><tr><td>Miscela di nutrienti F-12 Prosciutto Medio</td><td>Himedia</td><td>Al106S</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Duran Gruppo</td><td>237554805</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Himedia</td><td>ML023</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro</td> <td>di potassioHimedia</td><td>MB043</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica</td><td>Labware</td><td>LW-SP1010</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Himedia</td><td>MB045</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Himedia</td><td>MB025</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa (0,2&mu;, diametro 25 mm)</td><td></td><td></td>Fiasche per coltura tissutale Axiva SFPV25R <td></td></tr><tr><td>T-25 adatte per colture cellulari aderenti.</td><td>Himedia</td><td>TCG4-20X10NO</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>Codice 25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

ottenere microglia umana da tessuto cerebrale umano adulto

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Le microglia sono cellule immunitarie innate residenti del sistema nervoso centrale (SNC). Microglia svolgono un ruolo fondamentale durante lo sviluppo, nel mantenimento dell'omeostasi e durante l'infezione o lesioni. Diversi gruppi di ricerca indipendenti hanno evidenziato il ruolo centrale che la microglia svolgono nelle malattie autoimmuni, nelle sindromi autoinfiammatori e nei tumori. L'attivazione della microglia in alcune malattie neurologiche può partecipare direttamente a processi patogeni. La microglia primaria è un potente strumento per comprendere le risposte immunitarie nel cervello, le interazioni tra cellule cellulari e i fenotipi di microglia disregolati nella malattia. Le microglia primarie imitano le proprietà microgliali in vivo meglio delle linee cellulari microgliali immortalate. La microglia adulta umana presenta proprietà distinte rispetto alla microglia fetale e roditore umana. Questo protocollo fornisce un metodo efficiente per l'isolamento della microglia primaria dal cervello umano adulto. Lo studio di questi microglia può fornire informazioni critiche sulle interazioni tra microglia e altre popolazioni cellulari residenti nel SNC, tra cui oligodendrociti, neuroni e astrociti. Inoltre, microglia da diversi cervelli umani possono essere colturati per caratterizzazione di risposte immunitarie uniche per la medicina personalizzata e una miriade di applicazioni terapeutiche.

Utilizzando il protocollo di cui sopra (Figura 1), siamo stati in grado di isolare microglia umana primaria da tessuti cerebrali in tempo reale chirurgicamente resected. Le cellule colturate sono state macchiate con Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) lectina per microglia (verde) e con proteina acida fibrillante gliale (GFAP) per gli astrociti(rosso) (Figura 2) come descritto inprecedenza 22<su...

Questo protocollo è un metodo efficiente, conveniente e robusto per isolare la microglia primaria dal tessuto cerebrale umano vivo, adulto. Microglia umana primaria isolata può servire come strumento per studiare i processi cellulari in omeostasi e malattia.

Ottenere Microglia Umana da Tessuto Cerebrale Umano Adulto

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

L'obiettivo generale del protocollo è quello di isolare le cellule primarie di microglia dai tessuti cerebrali umani adulti vivi. Nel nostro caso, questo è stato raccolto come finestra chirurgica durante l'intervento chirurgico. Questo si ottiene raccogliendo inizialmente i tessuti cerebrali in PBS ghiacciato, il tessuto viene poi tritato in piccoli pezzi di cubo da 1 mm, e l'ho appena fatto con l'aiuto della tripside EDTA.In seguito, le cellule vengono raccolte per centrifugazione e placcate in un pallone adatto per la coltura cellulare degli androgeni per 48 ore. Le cellule vengono raccolte ancora una volta dal pallone e coltivate fino a un ulteriore utilizzo. Le cellule primarie di microglia umana possono ora essere caratterizzate dall'uso dell'immunocitochimica e utilizzate per ulteriori esperimenti.Il vantaggio principale del nostro protocollo per isolare le cellule di microglia dai tessuti cerebrali umani adulti è che fornisce efficacemente cellule di microglia umane adulte primarie in modo molto conveniente. Il protocollo è robusto e riduce la perdita di celle riducendo il numero di passaggi utilizzati nei protocolli esistenti. Raccogliere il tessuto in un tubo Falcon da 50 ml contenente 10 ml di ghiaccio freddo aCSF.Pulire accuratamente il tubo di raccolta con il 70% di alcol e trasferirlo in una camera di flusso d'aria laminare aseptica. Scartare attentamente l'aCSF e pesare il tessuto nel tubo Falcon. Calcola il peso approssimativo del tessuto deducendo il peso del tubo falcon vuoto.Caldo fresco aCSF a 37 gradi centigradi. Tenere il tessuto in aCSF caldo per cinque minuti. Questo passaggio è fondamentale per evitare la morte cellulare.Scartare attentamente aCSF. E lavare il tessuto una volta con 1X PBS riscaldato a 37 gradi centigradi. Assicurarsi che tutto il sangue sia lavato via con ripetuti lavaggi PBS in base alle esigenze.Incubare il tessuto in PBS caldo per 5 minuti. Scartare con attenzione metà del PBS. Trasferire il tessuto insieme al PBS rimanente in una piastra di Petri sterilizzata.Rimuovere con cura il PBS rimanente con pipetta da 1 mL. Ciò impedirà la perdita di tessuto. Dadi che esentrano in almeno 1 mm cubo piccoli pezzi usando un bisturi sterile.Aggiungere 2 mL di 0,25% di tripside EDTA alla piastra di Petri e lavare accuratamente la piastra con l'aiuto di pipetta. Trasferire il tessuto a dadini in un tubo Falcon da 50 ml contenente 10 ml per grammo di tessuto dello 0,25% di tripside EDTA. Mescolare pipettando attraverso una pipetta sierologica da 10 mL.Incubare il tubo su uno shaker per 30 minuti a 37 gradi centigradi e la velocità di 250 giri/min. Aggiungere 10 mL di mezzo neutralizzante per neutralizzare la tripside. Mescolare accuratamente con una pipetta sierologica da 10 mL.Centrifugare il tubo a 2000G a 4 gradi centigradi per 10 minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 1 mL di mezzo di coltura. Posare le cellule in un pallone T25 adatto per le cellule androgene e aggiungere 4 ml di mezzo di coltura aggiuntivo.Il mezzo di coltura conterrà il 20%L929 supernatante e l'1%streptomicina. Si consiglia di aggiungere separatamente il supernatante L929 in fiasche invece di aggiungere al mezzo di coltura stock. Abbiamo finito con il pallone per smaltire in modo omogeneo il tessuto.Evitare di portare il supporto al collo del pallone mentre si trema in quanto ciò può aumentare le possibilità di contaminazione. Incubare il pallone a 37 gradi centigradi con il 5%CO2 per 48 ore. Raccogliere i supporti dal pallone da coltura T25 preparato il giorno 0 in tubi di centrifuga.Centrifuga i supporti raccolti a 1.466G a 4 gradi centigradi per 4 minuti. Mentre il supporto raccolto viene centrifugato, lavare il pallone giorno 0 una volta con 1X PBS. Agitare delicatamente il pallone per rimuovere eventuali frammenti di tessuto residuo rimasti.Evitare dure scosse del pallone in quanto eventuali frammenti remnant non influenzeranno negativamente la coltura. Aggiungere 5 ml di mezzi di coltura freschi al pallone. Scartare il supernatante dai tubi centrifugati.Aggiungere 1 ml di mezzo di coltura a uno dei tubi e mescolare accuratamente con pipetta. Aggiungere in serie il supporto misto con le celle ad altri tubi e mescolare accuratamente. Posare le cellule in un pallone T25 separato adatto per le cellule androgene.Aggiungere 4 ml di mezzi di coltura freschi al pallone. Incubare entrambi i contenitori a 37 gradi centigradi con 5%CO2 per 48 ore. Scartare i supporti da entrambi i contenitori e aggiungere nuovi supporti di coltura da 5 mL.Incubare i contenitori a 37 gradi centigradi al 5%CO2 per 48 ore. Il sesto giorno, le cellule saranno pronte per ulteriori esperimenti. Nelle immagini qui rappresentate.Primo pannello della sezione A astrociti macchiati di GFAP, di colore verde. Nel secondo pannello, della sezione A microglia macchia con RCA, di colore verde. Nella sezione B microglia macchiata di RCA, di colore verde, e gli astrociti sono macchiati di GFAP, di colore rosso.La sovrapposizione delle immagini mostra microglia e astrociti insieme. Dalle immagini è chiaro che la maggior parte delle cellule nella coltura preparata sono microglia. Le immagini sono state quantificate da un controllo accecato e il risultato è rappresentato nella sezione C.I risultati hanno mostrato che circa l'80% delle cellule nella coltura preparata sono cellule di microglia.Questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora e mezza. Seguendo questa procedura dovrebbe avere una buona comprensione di come faccio a selezionare le microglia di adescamento dai tessuti cerebrali umani adulti, che possono essere ulteriormente utilizzati per esperimenti a valle.

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Neuroscienze

Isolamento microglia primaria dalla eterogeneità cellulare del cervello è essenziale per studiare il loro ruolo sia in condizioni fisiologiche e patologiche. Questo protocollo descrive un isolamento meccanico e mista tecnica di coltura cellulare che fornisce alta resa ed elevata purezza, cellule vitali primarie per...

Isolamento primario Microglia misti da colture cellulari gliali del tessuto neonatale cervello di ratto

Il video dimostra una tecnica per isolare la microglia dalla corteccia del cervello di un topo adulto. In primo luogo, la corteccia subisce la segmentazione e l'omogeneizzazione per rimuovere i neuroni e altre cellule gliali, preservando la microglia. Successivamente, la sospensione cellulare viene esposta a microsfere magnetiche anti-mielina e a un campo magnetico, separando efficacemente le microglia e le cellule mieloidi dai detriti di mielina e dalle cellule contenenti mielina.

Isolamento della microglia dalla corteccia di un cervello di topo adulto

Il video ha dimostrato il metodo di isolamento e coltura delle cellule dal cervello di un topo neonatale. Ha comportato la dissociazione enzimatica e meccanica del cervello, seguita dalla coltura in terreni di crescita privi di fattore di crescita neuronale per ottenere una popolazione gliale mista.

Ottenimento di una coltura di cellule gliali miste da un cervello di topo neonatale

Noi descriviamo i metodi per l'efficiente e rapido isolamento / cultura della microglia praticabile dalla corteccia cerebrale neonatale e midollo spinale adulto. La dissezione e la placcatura di microglia corticale può essere realizzato entro 90 minuti, con la conseguente raccolta microglia in atto ~ 10 giorni dopo la dissezione iniziale.

Coltura Microglia dal Sistema Nervoso Centrale neonatale e adulti

Una chiave per il successo indagini di biologia microglia è la conservazione dei immunofunction microglia ex vivo durante l'isolamento dal tessuto del sistema nervoso centrale. Isolare microglia via rotanti risultati si stringono in colture cellulari altamente puri e immunofunctional come valutato da immagini fluorescenti, immunocitochimica, ed ELISA dopo l'attivazione della microglia con il lipopolisaccaride stimoli pro-infiammatori (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento della corticale Microglia con Immunofenotipo conservato e funzionalità dal murini neonati

Forniamo un protocollo per l'isolamento della microglia da diverse regioni sezionate di un emisfero cerebrale adulto, seguito dalla preparazione della libreria semiautomatica per il sequenziamento profondo dell'RNA unicellulare di trascrittomi a lunghezza intera. Questo metodo aiuterà a chiarire l'eterogeneità funzionale della microglia in salute e malattia.

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

Il protocollo qui presentato consente il trapianto di microglia umana derivata da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSMG) nel cervello attraverso una via transnasale in topi immunocompetenti. Viene mostrato il metodo per la preparazione e il trapianto transnasale di cellule e la somministrazione di miscela di citochine per il mantenimento di iPSMG.

Trapianto di microglia derivata da cellule staminali pluripotenti indotte umane nel cervello di topi immunocompetenti tramite via transnasale non invasiva

Questo protocollo descrive il processo di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) in cellule simili alle microglia per la sperimentazione in vitro . Includiamo anche una procedura dettagliata per generare sinaptosomi umani da motoneuroni inferiori derivati da iPSC che possono essere utilizzati come substrato per saggi di fagocitosi in vitro utilizzando sistemi di imaging di cellule vive.

Cellule simili alla microglia umana: differenziazione da cellule staminali pluripotenti indotte e saggio di fagocitosi di cellule vive in vitro utilizzando sinaptosomi umani

Descriviamo un protocollo per isolare le cellule microgliali dall'ipotalamo del topo (o piccole strutture cerebrali equivalenti) utilizzando il cell sorting attivato magneticamente (MACS), in un tempo relativamente breve. La microglia ipotalamica selezionata con MACS può essere utilizzata per analisi ex vivo e può essere piastrata per eseguire saggi in vitro .

Isolamento della microglia ipotalamica dal cervello di topo adulto appena perfuso mediante smistamento cellulare attivato magneticamente  

Questo studio delinea un nuovo approccio per la creazione di cellule simili alla microglia (iMG) derivate da monociti umani che consentono la valutazione indiretta dell'infiammazione cerebrale. Questo presenta un modello cellulare che può essere utile per la ricerca incentrata sulla potenziale infiammazione del cervello e sui disturbi neuropsichiatrici associati.

Ingegnerizzazione di cellule simili alla microglia indotte dal sangue umano per la ricerca cerebrale traslazionale inversa

Impara a isolare microglia primarie da tessuto cerebrale umano adulto con questo protocollo robusto ed economico. La tecnica garantisce un'elevata resa cellulare per studi di neuroscienza e biologia cellulare.

Ottenere Microglia Umana da Tessuto Cerebrale Umano Adulto

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