Name: In Vivo Registrazione intracellulare di Motoneuroni Spinali Ratti Identificati dal Tipo durante la stimolazione a corrente diretta trans-spinale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Impara la registrazione intracellulare in vivo di motoneuroni spinali nel ratto durante la stimolazione a corrente diretta trans-spinale. Questo metodo consente di analizzare le proprietà di membrana e i pattern di attività neuronale.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione del National Science Center n. 2017/25/B/N/7/00373. Gli autori vorrebbero riconoscere il lavoro di Hanna Drzymaa-Celichowska e W'odzimierz Mr'cwczy'ski, che hanno entrambi contribuito alla raccolta e all'analisi dei risultati presentati in questo documento.

Tutte le procedure connesse al presente protocollo sono state accettate dalle autorità competenti (ad esempio, comitato etico locale) e seguono le norme nazionali e internazionali in materia di benessere e gestione degli animali.
NOTA: Ogni partecipante coinvolto nella procedura deve essere adeguatamente addestrato nelle procedure chirurgiche di base e deve avere una licenza valida per l'esecuzione di esperimenti sugli animali.
1. Anestesia e premedicazione
<ol><li>Anestesizzare un ratto con iniezioni intraperitoneali di pentobarbital di sodio (una dose iniziale di 60mg-kg -1 per i ratti Wistar maschi di 6 mesi del peso di 400-u2012550g). NOTA: Questo protocollo non è limitato al ceppo indicato, al sesso o all'età dei ratti. Inoltre, l'anestesia alternativa come il mix di ketamina-xylazina, l'alfa-cloalosa o il fentanil-midazolam-medetomidina può essere utilizzata se più adatta a diversi obiettivi di ricerca o quando richiesto dal comitato etico.</li>
	<li>Dopo circa 5 minuti, controllare la profondità dell'anestesia pizzicando il dito dell'arto posteriore del ratto con pince smussate. Procedere con i passaggi successivi del protocollo solo quando non viene osservata alcuna azione riflessiva.</li>
	<li>Iniettare 0,05 mL di atropina sottocutaneamente al fine di ridurre la produzione di muco dopo l'intubazione.</li>
	<li>Iniettare sottocutaneamente 5 mL di tampone fosfato contenente 4% soluzione di glucosio, NaHCO3 (1 %) e gelatina (14%). Questo buffer sarà assorbito dai vasi cutanei durante un esperimento e contribuirà a mantenere l'equilibrio dei fluidi.</li>
	<li>Durante l'intervento, controllare periodicamente l'animale per le azioni di riflesso e integrare l'anestesia, se necessario (10mg-kg -1-1 -1di pentobarbital di sodio).</li>
</ol>2. Chirurgia
<ol><li>Preparare l'animale per il trattamento chirurgico radendo la pelliccia sulla parte dorsale dell'hindlimb sinistro, dalla caviglia all'anca, dalla parte posteriore, dalla coda ai segmenti toracci alti, il lato sinistro del torace e il lato ventrale della zona del collo sopra lo sterno</li>
	<li>Posizionamento della linea endovenosa<ol>
<li>Posizionare il ratto sulla schiena su un tampone riscaldante ad anello chiuso (e fissarlo con fissazioni degli arti).</li>
		<li>Utilizzando una lama 21, fare un taglio longitudinale attraverso la pelle da uno sterno a un mento.</li>
		<li>Tenere la pelle con le finte e separarla dal tessuto sottostante.</li>
		<li>Utilizzando tecniche di dissezione smussate espongono la vena giugulare destra. Sezionare attentamente la vena dai tessuti circostanti.</li>
		<li>Individuare la parte della vena senza punti di diramazione, scivolare due legature 4-0 sotto di esso.</li>
		<li>Fare un nodo sciolto sull'estremità prossimale del segmento non ramificante precedentemente identificato della vena e un nodo sciolto sull'estremità distale di questo segmento della vena. Bloccare la vena prossimale al cuore, e poi liga la parte distale della vena.</li>
		<li>Utilizzando le forbici dell'iride, fare un'incisione tra il morsetto e la legatura distante. Tenere un lembo della vena e introdurre un catetere pre-riempito fino al punto in cui è bloccato dal morsetto.</li>
		<li>Tenendo la vena e il catetere insieme con le forcetti, rimuovere il morsetto e spingere il catetere diversi millimetri nella vena. Fissare entrambe le estremità del catetere alla vena e aggiungere un ulteriore punto di fissazione alla pelle.</li>
	</ol></li>
	<li>Introduzione del tubo tracheale<ol>
<li>Utilizzando le forcezze smussate separano le due ghiandole mandibolari che coprono i muscoli sternohyoidi. Separare i muscoli sternoid alla linea mediana per esporre la trachea.</li>
		<li>Scivolare tre legature 4-0 sotto la trachea, quindi fare due nodi sotto il punto di inserimento del tubo tracheale e un nodo sopra.</li>
		<li>Individuare la cartilagine cricoide della la renace e fare un'incisione sotto la terza cartilagine tracheale.</li>
		<li>Inserire un tubo tracheale lungo la trachea e fissare il tubo in posizione con legature pre-preparate, quindi aggiungere un'ulteriore legatura alla pelle.</li>
		<li>Posizionare un piccolo pezzo di cotone sopra i muscoli separati e suturare la pelle sopra l'area azionata.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissezione dei nervi degli arti posteriori<ol>
<li>Utilizzando 21 lama, fare un taglio longitudinale sul lato posteriore dell'arto posteriore sinistro, dal tendine d'Achille all'anca.</li>
		<li>Afferrare la pelle con le finzioni, e utilizzando tecniche di dissezione smussata separare la pelle dai muscoli sottostanti su entrambi i lati dell'incisione.</li>
		<li>Individuare la fossa popliteale nella parte posteriore dell'articolazione del ginocchio, che è coperto dal muscolo femoris bicipite, e utilizzando le forbici fare un taglio tra la parte anteriore e posteriore di questo muscolo.</li>
		<li>Muovendosi verso l'alto tagliare due teste del bicipite femoris tutta la strada fino all'anca per esporre il nervo sciatico. Cauterizzare come necessario per prevenire il sanguinamento.</li>
		<li>Identificare i rami surali, tibiali e comuni peroneali del nervo sciatico.</li>
		<li>Utilizzando le forbici, separare la testa laterale dalla testa mediale del muscolo gastrocnemio per esporre il nervo tibiale e i suoi rami.</li>
		<li>Utilizzando 55 forceps afferrare l'estremità distale del nervo surale, tagliarlo distaamente e sezionare il più possibile.</li>
		<li>Ripetere la procedura con il nervo peroneale comune.</li>
		<li>Utilizzando un'asta di vetro smussata separare il nervo tibiale dai tessuti circostanti, facendo attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni, e tagliarlo distally.</li>
		<li>Identificare il gastrocnemius mediale (MG) e i nervi a gastrocnemius e soleus (LGS) laterale.</li>
		<li>Utilizzando 55 forcelle, sezionare attentamente i nervi MG e LGS, scollegandoli dai tessuti circostanti, ma mantenendo la loro connessione ai rispettivi muscoli.</li>
		<li>Mettere un pezzo di cotone imbevuto di salina sotto i nervi esposti.</li>
		<li>Chiudere la pelle sopra l'area azionata.</li>
	</ol></li>
	<li>Laminectomy<ol>
<li>Utilizzando 21 lama fare un'incisione longitudinale dal sacro fino alle vertebre toracica.</li>
		<li>Separare la pelle dai muscoli sottostanti.</li>
		<li>Tagliare il muscolo longissimus su entrambi i lati dei processi toracica e lombare spinosa.</li>
		<li>Utilizzando bisturi dai bordi smussati ritraggono i muscoli dalla colonna vertebrale per esporre i processi trasversali di ogni vertebra.</li>
		<li>Utilizzando forbici punta smussata tagliare i tendini dei muscoli collegati ai processi trasversali lungo la colonna vertebrale esposta. Se necessario, applicare agenti emostatici.</li>
		<li>Identificare la vertebra Th13 come il segmento toracico più basso con inserimento delle costole e utilizzando rongeurs fini rimuovere i processi spinosi e laminae da Th13 a L2 vertebre per esporre segmenti lombari del midollo spinale. Ricordarsi di non danneggiare il processo spinoso L3 che verrà utilizzato come punto di fissazione per la stabilizzazione della colonna vertebrale.</li>
		<li>Rimuovere il processo spinoso Th12 e lisciare la superficie dorsale vertebra il più possibile.</li>
		<li>Utilizzando tecniche di dissezione smussate separano i muscoli dalla vertebra Th11 per creare punti di inserimento del supporto.</li>
		<li>Posizionare il sottile batuffolo di cotone saline sopra i segmenti del midollo spinale esposti.</li>
		<li>Spostare il ratto sul telaio metallico su misura con due barre parallele e due bracci regolabili con morsetti per sostenere e stabilizzare la colonna vertebrale.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparazione per la registrazione e la stimolazione
<ol><li>Fissazione della colonna vertebrale e disposizione del nervo<ol>
<li>Posizionare il ratto nel telaio su misura su una pastiglie riscaldante, collegato al sistema di riscaldamento a circuito chiuso per mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37 x 1oC.</li>
		<li>Inserire elettrodi ECG sotto la pelle e collegarsi a un amplificatore per il monitoraggio della frequenza cardiaca.</li>
		<li>Utilizzando i lembi della pelle, formare una piscina profonda sul midollo spinale esposto.</li>
		<li>Utilizzando morsetti metallici, fissare la colonna vertebrale mettendo morsetti sotto i processi trasversali Th12 e al processo spinoso L3.</li>
		<li>Assicurarsi che la colonna vertebrale sia fissata e disposta orizzontalmente, quindi applicare la pressione dorso-ventrale su entrambi i lati della colonna per ritrarre i muscoli.</li>
		<li>Riempire la piscina con olio minerale caldo (37 gradi centigradi) e mantenerla a questa temperatura.</li>
		<li>Infilare una legatura 4-0 attraverso il tendine d'Achille, sollevare e allungare l'arto posteriore sinistro operato in modo che la caviglia sia livellata con l'anca.</li>
		<li>Utilizzando i lembi della pelle fare una piscina profonda sopra il tibial esposto, mg e nervi LGS.</li>
		<li>Riempire la piscina con olio minerale caldo (37 gradi centigradi).</li>
		<li>Posizionare i nervi MG e LGS su elettrodi stimolanti bipolari filo d'argento e collegarli a uno stimolatore a impulsi quadrati. Utilizzare canali di stimolazione separati per ogni nervo.</li>
	</ol></li>
	<li>Posizionamento degli elettrodi superficiali<ol>
<li>Posizionare un elettrodo a sfera d'argento sul lato caudal sinistro del midollo spinale esposto, con un elettrodo di riferimento inserito nei muscoli della schiena, e collegare entrambi gli elettrodi all'amplificatore MDD differenziale. L'elettrodo della sfera di superficie sarà utilizzato per registrare raffiche afferenti dai nervi.</li>
		<li>Utilizzando uno stimolatore a corrente costante, stimolare i nervi MG e LGS con impulsi quadrati di durata di 0,1 ms, ripetuti a una frequenza di 3 Hz, e osservare raffiche afferenti.</li>
		<li>Determinare la soglia (T) per l'attivazione del nervo, stimolare ogni nervo a circa 3 Intensità T, e registrare l'ampiezza di afferente volley per ogni nervo.</li>
		<li>Spostare l'elettrodo superficiale rostrale e ripetere la procedura per identificare i segmenti spinali in cui le ampiezze delle raffiche sono le più alte per ogni nervo. Dopo aver determinato la posizione massima della raffica, spostare l'elettrodo di superficie a una distanza di sicurezza dal midollo spinale.</li>
	</ol></li>
	<li>Paralisi muscolare e formazione di uno pneumotorace al fine di ridurre i movimenti respiratori<ol>
<li>Paralizzare il ratto per via endovenosa con un bloccante neuromuscolare e collegare il tubo tracheale ad un ventilatore esterno in linea con un capnometro compatibile con i roditori (bromuro di pancuronio, ad una dose iniziale di 0,4mg-kg -1, integrato ogni 30 min in dosi di 0,2mg-kg -1)</li>
		<li>Monitorare la concentrazione di CO2 di marea finale e mantenerla a circa il 3-u20124% regolando i parametri di ventilazione (frequenza, pressione dell'aria e volumi di flusso).</li>
		<li>Fare un'incisione longitudinale nella pelle tra la 5a e la 6a costola su un lato della registrazione.</li>
		<li>Utilizzando forbici a punta smussata tagliare i muscoli sovrasto per visualizzare lo spazio intercostale tra le costole.</li>
		<li>Utilizzando piccole forbici affilate, fare una piccola incisione nei muscoli intercostali e nella pleura, quindi inserire una punta di un bordo smussato forza nell'apertura, facendo attenzione a non premere sui polmoni.</li>
		<li>Consentire alle forcep di espandersi o inserire un piccolo tubo per mantenere lo pneumotorace aperto per tutta l'esperimento.</li>
		<li>Dopo il blocco neuromuscolare, monitorare la profondità dell'anestesia controllando la frequenza ECG e integrare l'agente anestetico se la frequenza cardiaca supera i 400 bpm. Paralisi muscolare e formazione di uno pneumotorace al fine di ridurre i movimenti respiratori, che migliorerà la stabilità di registrazione</li>
	</ol></li>
	<li>Apertura della dura e pia mater<ol>
<li>Utilizzando #55, sollevare delicatamente la dura mater, e tagliarla caudally dal segmento L5, rostralmente fino al segmento L4.</li>
		<li>Utilizzando un paio di forceppa 5SF ultra-sottili fare un piccolo cerotto nella pia che copre la colonna dorsale, tra i vasi sanguigni, esattamente al livello della massima afferente volley dal mg o il nervo LGS.</li>
		<li>Utilizzare piccoli pezzi di schiuma di gel salina imbevuta e secca per bloccare il sanguinamento, se necessario.</li>
	</ol></li>
	<li>Posizionamento degli elettrodi tsDCS<ol>
<li>Fare una piccola incisione nella pelle sul lato ventrale di un addome del ratto a livello rostro-caudal corrispondente alla posizione dei segmenti spinali L4-L5.</li>
		<li>Afferra il lembo di pelle esposto con una clip metallica che servirà come elettrodo di riferimento.</li>
		<li>Posizionare una spugna imbevuta di salina sul lato dorsale della vertebra Th12. Assicurarsi che la dimensione della spugna sia uguale a quella di un elettrodo tsDCS attivo (piastra in acciaio inossidabile a forma di cerchio di 5 mm di diametro).</li>
		<li>Utilizzando un manipolatore fine, premere la spugna con un elettrodo tsDCS attivo all'osso e assicurarsi che l'intera superficie dell'elettrodo sia premuta allo stesso modo.</li>
		<li>Collegare sia gli elettrodi tsDCS di riferimento che attivi a un'unità stimolatore a corrente costante, in grado di fornire un flusso continuo di corrente diretta.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione delle micropipette<ol>
<li>Utilizzando un puller microelettrodo, preparare un microelettrode. NOTA: Sia gli elettrodi filamentali che gli elettrodi non filamentali possono essere utilizzati, tuttavia, ricordate che il gambo dell'elettrodo deve essere abbastanza lungo da raggiungere il corno ventrale pur essendo abbastanza sottile da non comprimere il midollo spinale durante la discesa.<ol>
<li>Regolare l'impostazione dell'e tiratore in modo che il gambo che entra nel midollo spinale sia lungo circa 3 mm, mentre la punta dell'elettrodo non è superiore a 1,20122 m di diametro e la resistenza ai microelettrodi è compresa tra 10 e 20 MΩ.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Riempire i microelettrodi con 2M elettrolita di citrato di potassio.</li>
		<li>Montare il microelettrode preparato sul micromanipatore, consentendo il movimento di stepping di 1,20122 m e la calibrazione stereotassica.</li>
		<li>Collegare il microelettrodo all'amplificatore intracellulare con l'elettrodo di riferimento posto nei muscoli della schiena.</li>
	</ol></li>
	<li>Dopo il blocco neuromuscolare, monitorare la profondità dell'anestesia controllando la frequenza ECG e integrare l'agente anestetico in modo che la frequenza cardiaca del ratto non superi i 400 bpm.</li>
</ol>4. Tracciamento e penetrazione Motoneuron
<ol><li>Posizionare l'elettrodo di registrazione della raffica afferente sulla superficie dorsale del midollo spinale, caudally alla posizione del sito di registrazione, al livello del segmento L6.</li>
	<li>Stimolare i nervi MG e LGS con impulsi elettrici di 0,1 ms ad una frequenza di 3 Hz e intensità 3T, per attivare tutti gli assoni di alfa-motoneuroni all'interno di un nervo selezionato.</li>
	<li>Guidare la micropipetta in una patch selezionata nel pia con un angolo medio-laterale di 15-u201220 (con una punta diretta lateralmente).</li>
	<li>Dopo essere sceso sotto la superficie, calibrare il microelettrode e compensare la sua capacità e l'offset di tensione, e continuare la penetrazione del midollo spinale quando tutti i parametri sono stabili. Un potenziale di campo antidromico della piscina motoneurone sarà visibile alla traccia di tensione microelettrode mentre si avvicina un nucleo motore dedicato durante la stimolazione del rispettivo nervo.</li>
	<li>Procedere alla penetrazione con il microelettrode a 1,20122 gradini di m e utilizzare periodicamente la funzione di ronzio dell'amplificatore intracellulare per eliminare la punta dell'elettrodo da qualsiasi residuo.</li>
	<li>Osservare la penetrazione del motoneurone che sarà caratterizzata da un'improvvisa iperpolarizzazione della traccia di tensione registrata e dalla comparsa di un potenziale di picco antidromatico.</li>
</ol>5. Registrazione della membrana del motoneurone e delle proprietà di cottura
<ol><li>In una modalità ponte dell'amplificatore intracellulare, identificare il motoneurone sulla base dell'aspetto "tutto o niente" del potenziale di azione antidromica stimolando i rispettivi rami nervosi. Registrare 20 tracce successive per una media successiva.</li>
	<li>implementare un rigoroso criterio di inclusione per garantire dati di alta qualità: potenziale di membrana a riposo di almeno -50 mV in ampiezza; l'ampiezza potenziale dell'azione superiore a 50 mV, con un superamento positivo; potenziale di membrana stabile per almeno 5 minuti prima della registrazione.</li>
	<li>In una modalità discontinua di corrente (modalità di commutazione corrente 4-8 kHz) dell'amplificatore intracellulare, evoca un potenziale di azione ortodromica in un motoneurone utilizzando impulsi di corrente depolarizzazione intracellulare di 0,5 ms. Ripetere almeno 20 volte per la media offline.</li>
	<li>Stimolare un motoneurone con 40 impulsi brevi (100 ms) di corrente iperpolare (1 nA) al fine di calcolare la resistenza all'ingresso cellulare.</li>
	<li>Stimolare un motoneurone con impulsi di onde quadrate di 50 ms a quantità crescenti per determinare il valore di reobase come l'ampiezza minima della corrente di depolarizzazione necessaria per suscitare un singolo picco.</li>
	<li>Iniettare 500 ms impulsi ad onda quadra di corrente depolarizzazione, ad amplificazione crescente in gradini di 0,1–2 nA per evocare scariche ritmiche di motoneuroni.</li>
</ol>6. Stimolazione a corrente diretta trans spinale (tsDCS)
<ol><li>Pur mantenendo una penetrazione stabile del motoneurone, avviare la procedura di polarizzazione mediante l'applicazione trans-spinale della corrente diretta. Regolare l'intensità corrente e il tempo di applicazione al progetto dell'esperimento (ad esempio, 0,1 mA per 15 min).</li>
	<li>Subito dopo l'accensione del DC, osservare il potenziale della membrana del motoneurone. La polarizzazione anodale (l'elettrodo attivo come anodo) dovrebbe portare alla depolarizzazione del potenziale della membrana, mentre la polarizzazione cathodale (l'elettrodo attivo come un catodo) dovrebbe evocare un effetto opposto. Osservare se un cambiamento nel potenziale di membrana a riposo in risposta alla stimolazione DC è costante, il che assicura che l'intensità del campo elettrico non sia influenzata.</li>
	<li>Durante l'applicazione a corrente continua, ripetere i passaggi 5.3-u20125.6 in intervalli di 5 minuti.</li>
	<li>Spegnere il controller di dominio e continuare a ripetere i passaggi 5.3-u20125.6 in intervalli di 5 minuti fino a quando le registrazioni diventano instabili o i criteri di inclusione vengono compromessi.</li>
	<li>Terminare l'esperimento ed eutanasializzare l'animale utilizzando la somministrazione endovenosa di una dose letale di sodio pentobarbitale (180mg-kg -1).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da divulgare.

Se eseguita correttamente, la parte chirurgica del protocollo descritto deve essere completata entro circa tre ore. Si dovrebbe fare particolare attenzione nel mantenere condizioni fisiologiche stabili di un animale durante l'intervento chirurgico, in particolare la temperatura corporea e la profondità dell'anestesia. A parte ovvie considerazioni etiche, la mancanza di un'anestesia adeguata può provocare eccessivi movimenti degli arti durante la dissezione nervosa o la laminectomia e portare a danni alla preparazione o a...

La stimolazione a corrente diretta trans spinale (tsDCS) sta guadagnando riconoscimento come metodo potente per modificare l'eccitabilità del circuito spinale in salute emalattia 1,2,3. In questa tecnica, una corrente costante viene passata tra un elettrodo attivo situato sopra i segmenti spinali selezionati, con un elettrodo di riferimento situato sia ventralemente che più rostralmente4. Diversi studi hanno già confermato che il tsDCS può essere utilizzato nella gestione di determinate condizioni patologiche, come il doloreneuropatico 5, la spasticità6, la lesione del midollospinale 7 o per facilitare la riabilitazione8. I ricercatori suggeriscono che il tsDCS evoca alterazioni nella distribuzione degli ioni tra lo spazio intracellulare e lo spazio extracellulare attraverso la membrana cellulare, e questo può facilitare o inibire l'attività neuronale a secondadell'orientamento corrente 9,10,11. Tuttavia, fino a poco tempo fa, mancava una conferma diretta di questa influenza sui motoneuroni.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per condurre in vivo la registrazione intracellulare dei potenziali elettrici dai motoneuroni lombari spinali nel ratto anethetizzato con applicazione simultanea di tsDCS, al fine di osservare i cambiamenti nella membrana motoneurone e le proprietà di cottura in risposta alla polarizzazione anodale o cathodale della rete neuronale spinale. Le registrazioni intracellulari aprono diverse aree di indagine delle proprietà dei neuroni, non disponibili per le tecniche extracellulari utilizzate inprecedenza 9,12. Ad esempio, è possibile misurare con precisione la risposta di tensione della membrana del motoneurone al flusso di corrente diretta indotto da tsDCS, indicare la soglia di tensione per la generazione di picchi o analizzare i potenziali parametri di azione. Inoltre, questa tecnica ci permette di determinare le proprietà della membrana passiva del motoneurone, come la resistenza all'ingresso, e di osservare la relazione tra la corrente di stimolazione intracellulare e la frequenza di cottura ritmica dei motoneuroni. L'identificazione antidromica del motoneurone registrato, basata sulla stimolazione dei nervi identificati dal punto di vista funzionale (cioè i nervi che forniscono efferenti ai flessori o agli estensori) ci permette di identificare inoltre i tipi di unità motorie innervate (veloce o lento), il che offre l'opportunità di verificare se la polarizzazione influenza in modo diverso i singoli elementi del sistema neuronale spinale maturo. A causa di un'estesa chirurgia che precede la registrazione e di elevati requisiti di stabilità e affidabilità delle registrazioni, questa tecnica è altamente impegnativa ma consente una valutazione diretta e a lungo termine delle caratteristiche elettrofisiologiche di un motoneurone: prima, durante e dopo l'applicazione di tsDCS, che è fondamentale per determinare sia le sue azioni acute che gli effetti persistenti13. Come un motoneuron attiva direttamente le fibre muscolari extrafuso14 e prende parte al controllo di feedback di una contrazione muscolare e sviluppato forza15,16 qualsiasi influenza osservata di tsDCS sull'unità motoria o le proprietà contraili muscolari possono essere collegati a modulazioni di motoneurone eccitabilità o caratteristiche di cottura.

<table><tbody><tr><td><forte>Durgs e soluzioni</forte></td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Atropinum sulfuricum</td><td>Polfa Warszawa</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Merck</td> <td>346351-NaHCO3</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>106329-Pancuronium Jelfa</td><td>PharmaSwiss/</td><td></td><td>Valeant-Bloccante</td></tr><tr><td>neuromuscolare Pentobarbital sodico</td><td>Biowet Pu?awy Sp. z o.o-Agente</td><td></td> <td>anestetico principale</td></tr><tr><td>Citrato di Pottasio</td><td>Chempur</td><td>6100-05-06-Tetraspan</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Braun-HES</td><td></td> <td>soluzione</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Attrezzature chirurgiche</forte></td><td>-</td><td></td><td>--</td></tr><tr><td>21 Lama</td><td>FST</td><td>10021-00</td><td>Lama</td></tr> <tr><td>per bisturiCauterizzatore</td><td>FST</td><td>18010-00-Tubi</td><td></td></tr> <tr><td>toracici</td><td>Mila</td><td>CT1215-Dumont</td><td></td></tr> <tr><td>#4 Pinze</td><td>FST</td><td>11241-30</td><td>Pinze</td></tr><tr><td>muscolari Dumont #5 Pinze</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>Pinze Dumont</td></tr><tr><td>#5F Pinze</td><td>FST</td><td>11255-20</td><td>Pinze nervose</td></tr><tr><td>Dumont #5SF Pia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>FST</td><td>11008-13</td><td>Pinze smussate</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>FST</td><td>11053-10</td><td>Pinze cutanee</td></tr><tr><td>Emostatico</td><td>FST</td><td>13013-14-Rongeur</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>FST</td><td>16021-14</td><td>Per laminectomia</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td>Forbici venose</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>FST</td><td>15002-08</td><td>Forbici Dura</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>FST</td><td>14184-09</td><td>Per taglio tracheale</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>FST</td><td>104075-11</td><td>Forbici muscolari</td></tr><tr><td></td><td>Forbici FST</td><td>14002-13</td><td>Forbici per la pelle</td></tr><tr><td>Tubo tracheale</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Catetere venoso</td> su misura <td>Vygon</td><td>1261.201</td> <td>-</td></tr> <tr><td>Pinza per incannulamento dei vasi</td><td>FST</td><td>18403-11</td><td>- </td></tr><tr><td>Morsetto per vasi</td><td>FST</td><td>18320-11</td><td>Per il bloccaggio delle vene</td></tr><tr><td>Sonda dilatatrice per vasi</td><td>FST</td><td>10160-13</td><td>Per la dissezione</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> delle vene<tr><td><forte>Materiali surgici</forte></td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-Schiuma gel</td><td>Pfizer</td><td>GTIN 00300090315085</td><td>Agente emostatico</td></tr><tr><td>Sutura di seta 4.0</td><td>FST</td><td>18020-40-Sutura</td><td></td></tr> <tr><td>di seta 6.0</td><td>FST</td><td>18020-60</td><td>-</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Axoclamp 2B</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>fuori produzione</td><td>Amplificatore intracellulare/ nuovo modello Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>CapStar-100 Monitor di CO2 di fine espirazione</td><td>CWE</td><td>11-10000</td><td>Gas analizzatore</td></tr><tr><td>Grass S-88</td><td>A-M Systems</td><td>fuori produzione</td><td>Stimolatore a corrente costante</td></tr><tr><td>Sistemi di coperte omeotermiche con sonda flessibile</td><td>Apparato Harvard</td><td>507222F</td><td>Sistema di riscaldamento</td></tr><tr><td>ISO-DAM8A</td><td>WPI</td><td>74020</td><td>Amplificatore extracellulare</td></tr><tr><td>Microdrive</td><td>-</td><td>-</td><td>Microelettrodo IVM/Scientifica</td></tr><tr><td>P-1000 su misura / di ricambio estrattore</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td>Estrattore per microelettrodi</td></tr><tr><td>SAR-830/AP Ventilatore per piccoli animali</td><td>CWE</td><td>12-02100</td> Telaio di supporto <td>per respiratore</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td>-</td><td>Base standard da laboratorio su misura/di ricambio 51601/Morsetti spinali per sostegni-</td></tr><tr><td></td><td></td><td>-</td><td>Adattatore spinale per ratto su misura/di ricambio 51695/Stoelting</td></tr><tr><td>TP-1 Stimolatore CC</td><td>WiNUE</td><td>-</td><td>tsDCS stimolatore</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Varie</forte></td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-1B150-4 capillari in vetro</td><td>WPI</td><td>1B150-4</td><td>Per la produzione di microelettrodi</td></tr><tr><td>Cotone idrofilo</td><td>-</td><td>-</td><td>-tubo</td></tr> <tr><td>flessibile</td><td>-</td><td>-</td><td>Per il collegamento</td></tr> <tr><td>del respiratore e dell'analizzatore di CO2MicroFil</td><td>WPI</td><td>MF28G67-5</td><td>Per il riempimento di micropipette Filo d'argento</td></tr> <tr><td></td><td>-</td><td></td> <td>Per elettrodi nervosi</td></tr></tbody></table>

in vivo registrazione intracellulare di motoneuroni spinali ratti identificati dal tipo durante la stimolazione a corrente diretta trans-spinale

In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation

La registrazione intracellulare dei motoneuroni spinali in vivo fornisce uno "standard d'oro" per determinare le caratteristiche elettrofisiologiche delle cellule nella rete spinale intatta e contiene vantaggi significativi rispetto alle tecniche classiche di registrazione in vitro o extracellulare. Un vantaggio delle registrazioni intracellulari in vivo è che questo metodo può essere eseguito su animali adulti con un sistema nervoso completamente maturo, e quindi molti meccanismi fisiologici osservati possono essere tradotti in applicazioni pratiche. In questo documento metodologico, descriviamo questa procedura combinata con la stimolazione a corrente costante applicata esternamente, che imita i processi di polarizzazione che si verificano all'interno delle reti neuronali spinali. La stimolazione trans-spinale a corrente diretta (tsDCS) è un metodo innovativo sempre più utilizzato come intervento neuromodulatore nella riabilitazione dopo varie lesioni neurologiche e nello sport. L'influenza di tsDCS sul sistema nervoso rimane poco compresa e i meccanismi fisiologici dietro le sue azioni sono in gran parte sconosciuti. L'applicazione del tsDCS contemporaneamente alle registrazioni intracellulari ci permette di osservare direttamente i cambiamenti delle proprietà della membrana del motoneurone e le caratteristiche della cottura ritmica in risposta alla polarizzazione della rete neuronale spinale, che è fondamentale per la comprensione delle azioni tsDCS. Inoltre, quando il protocollo presentato include l'identificazione del motoneurone rispetto a un muscolo innervato e la sua funzione (flessore contro estensore) così come il tipo fisiologico (veloce contro lento) offre l'opportunità di indagare selettivamente l'influenza del tsDCS sui componenti identificati dei circuiti spinali, che sembrano essere influenzati in modo diverso dalla polarizzazione. La procedura presentata si concentra sulla preparazione chirurgica per le registrazioni intracellulari e la stimolazione con un'enfasi sui passi necessari per ottenere la stabilità di preparazione e la riproducibilità dei risultati. I dettagli della metodologia dell'applicazione tsDCS anodale o catodale sono discussi prestando attenzione alle questioni pratiche e di sicurezza.

I parametri dei potenziali di azione e diverse proprietà della membrana possono essere calcolati sulla base di registrazioni intracellulari quando sono garantite condizioni stabili di penetrazione cellulare. La figura 1A presenta un tipico potenziale di azione ortodromica evocato dalla stimolazione intracellulare, che soddisfa tutti i criteri per l'inclusione dei dati (il potenziale di membrana a riposo di almeno -50 mV e un'ampiezza di picco superiore a 50 mV, con un superamento positivo). ...

Questo protocollo descrive la registrazione intracellulare in vivo dei motoneuroni lombari con stimolazione simultanea della corrente diretta trans-spinale. Il metodo ci permette di misurare le proprietà della membrana e di registrare la cottura ritmica dei motoneuroni prima, durante e dopo la polarizzazione anodale o tadale del midollo spinale.

In Vivo Registrazione intracellulare di Motoneuroni Spinali Ratti Identificati dal Tipo durante la stimolazione a corrente diretta trans-spinale

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological ...

Questo protocollo utilizza registrazioni intracellulari di motoneuroni spinali, per indagare direttamente l'influenza della stimolazione della corrente continua trans-spinale sulla funzione delle reti spinali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di eseguire registrazioni intracellulari su un sistema nervoso completamente maturo. Facilitare la traduzione delle osservazioni sperimentali in applicazioni pratiche.Dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale, un ratto Wistar maschio anestetizzato di sei mesi, usa un microscopio sezionante e una lama numero 21, per fare un'incisione longitudinale della pelle dallo sterno al mento. E usa la dissezione smussata per esporre la vena giugulare destra. Posizionare due legature 4-0 sotto la sezione della vena senza punti ramificati.E fare un nodo sciolto sull'estremità prossimale del segmento delle vene. E un nodo sciolto sull'estremità distale del segmento. Fissare la vena prossimale al cuore e ligarare l'estremità distale della vena.Utilizzare le forbici dell'iride per fare un'incisione tra il morsetto e la legatura distale. E, tenendo un lembo della vena, introdurre un catetere pre-riempito nel punto in cui la vena è bloccata dal morsetto. Quindi rimuovere il morsetto e spingere il catetere di diversi millimetri nella vena.Per un posizionamento del tubo tracheale, utilizzare forcep smussate per separare le due ghiandole mandibolari che coprono i muscoli sternoioidi. E separare i muscoli sternoioidi alla linea mediana, per esporre la trachea. Posizionare tre legature 4-0 sotto la trachea e fare due nodi sotto il punto di inserimento del tubo tracheale e un nodo sopra.Quindi inserire un tubo tracheale nella trachea sotto la terza cartilagine tracheale. E fissare il tubo in posizione con le legature pre-preparate. Per sezionare i nervi degli arti posteriori, utilizzare una lama numero 21 per fare un taglio longitudinale sul lato posteriore dell'arto posteriore sinistro, dal tendine d'Achille all'anca.E usa le forbici per fare un taglio tra le regioni anteriore e posteriore della fossa poplitea, nella parte posteriore dell'articolazione del ginocchio. Tagliare due teste del bicipite femoris, per esporre il nervo sciatico. E separare la testa laterale dalla testa mediale del muscolo gastrocnemio, per esporre il nervo tibiale e i suoi rami.Quindi utilizzare le forcep numero 55, per sezionare attentamente il gastrocnemio mediale e i nervi gastrocnemio laterale e soleo. Disconnettendoli dai tessuti circostanti mantenendo la loro connessione con i rispettivi muscoli. Per eseguire la laminectomia, utilizzare una lama numero 21 per fare un'incisione longitudinale dall'osso sacro fino alle vertebre toraciche.E identificare la vertebra Th13, come un segmento toracico più basso con un inserimento toracico. Quindi utilizzare rongeurs fini per rimuovere i processi spinosi e le laminae dal Th13 alle vertebre L2, per esporre i segmenti lombari del midollo spinale. Per fissare la colonna vertebrale, posizionare il topo in un telaio su misura su una pastiglia riscaldante a 37 gradi Celsius, collegata a un sistema di riscaldamento a circuito chiuso.E usare i lembi della pelle per formare una piscina profonda sul midollo spinale esposto. Posizionare i morsetti metallici al di sotto dei processi trasversali Th12 e ai processi spinosi L3 e riempire la piscina con olio minerale di 37 gradi Celsius. Utilizzare i lembi della pelle per creare una profonda pozza di olio minerale sui nervi tibiali, mediali e gastrocnemio laterale e soleus esposti.E posizionare i nervi sugli elettrodi stimolanti bipolari del filo d'argento. Quindi collegare gli elettrodi a uno stimolatore a impulsi quadrati utilizzando canali di stimolazione separati per ogni nervo. Per il posizionamento di un elettrodo di superficie, al microscopio sezionato, posizionare un elettrodo a sfera d'argento sul lato caudale sinistro del midollo spinale esposto.Con un elettrodo di riferimento inserito nei muscoli della schiena. E collegare entrambi gli elettrodi all'amplificatore CC differenziale. Usa uno stimolatore di corrente costante per stimolare il gastrocnemio mediale e i nervi gastrocnemio laterale e soleo, con impulsi quadrati della durata di 0,1 millisecondi ripetuti con una frequenza di tre hertz e osservare le raffiche afferenti.Alla fine della simulazione, spostare l'elettrodo di superficie rostralmente e ripetere la stimolazione per identificare i segmenti spinali in cui le ampiezze delle raffiche sono le più alte per ogni nervo. Dopo aver determinato la posizione della massima raffica, fornire un bloccante neuromuscolare per via endovenosa per paralizzare il topo. Mentre un assistente collega il tubo tracheale a un ventilatore esterno in linea con un cap nominatore compatibile con i roditori.Per aprire la dura e la pia mater, utilizzare le forcelle numero 55 per sollevare delicatamente la dura mater e tagliare il tessuto caudally dal segmento L5, rostralmente fino al segmento L4. Quindi usa un paio di forcep 5SF ultra sottili, per fare un piccolo cerotto nella pia, coprendo la colonna dorsale tra i vasi sanguigni. Esattamente al livello della massima raffica afferente dal gastrocnomio mediale e dal gastrocnomio laterale e dal nervo soleo.Per posizionare gli elettrodi di stimolazione a corrente continua trans-spinale, posizionare una spugna salina imbevuta sul lato dorsale delle vertebre Th12. E utilizzare una manipolazione fine per premere la spugna con un elettrodo di stimolazione a corrente continua trans-spinale attivo. Quindi montare un microelettrodo in pool personalizzato, sul micro manipolatore, consentendo un movimento di passo da uno a due micron e calibrazione stereotassica.E guidare una punta di micropipetta in un cerotto selezionato nella pia, con un angolo laterale mediale da 15 a 20 gradi. Per registrare la membrana motoneurone e le proprietà di cottura, nella modalità ponte dell'amplificatore intracellulare, stimolare i rispettivi rami nervosi a identificare il motoneurone sulla base dell'aspetto tutto o nulla, del potenziale di azione antidromica. Nella modalità di bloccaggio di corrente discontinua dell'amplificatore intracellulare con una modalità di commutazione di corrente da quattro a otto kilohertz, utilizzare un impulso di corrente depolarizzante intracellulare di 0,5 millisecondi, per evocare un potenziale di azione ortodontica, nel motoneurone.Per calcolare la resistenza all'input cellulare, stimolare un motoneurone, con 40 brevi impulsi di 100 millisecondi di corrente iperpolarizzante di un nanogrammo. Per determinare il valore di base reale come ampiezza minima della corrente depolarizzante necessaria per ottenere un singolo picco, stimolare un motoneurone con impulsi d'onda quadrati di 50 millisecondi ad ampiezze crescenti. Quindi iniettare impulsi d'onda quadrati di 500 millisecondi di corrente depolarizzante, ad ampiezze crescenti.In 0,1 a due nano ampere, per evocare scariche ritmiche di motoneuroni. Per una stimolazione della corrente continua trans-spinale, avviare le procedure di polarizzazione mediante applicazione trans-spinale della corrente continua, pur mantenendo una penetrazione stabile del motoneurone. Qui viene mostrato un tipico potenziale di azione ortotropica, evocato dalla stimolazione intracellulare che soddisfa tutti i criteri per l'inclusione dei dati.In questa analisi, una risposta cellulare ad un impulso di corrente iperpolarizzante di 100 millisecondi di un nanogrammo. Da cui si può osservare sia la resistenza di ingresso del picco che dell'altopiano di un motoneurone, può essere determinata dalla deflessione della tensione. Questa traccia di tensione espansa di un vero picco di base, mostra una soglia di tensione chiaramente marcata del picco.Indicando il livello di depolarizzazione della membrana a cui vengono attivati i canali del sodio gated di tensione per avviare il potenziale d'azione. Questi grafici forniscono esempi di tracce di tensione intracellulare. Da due motoneuroni, stimolati intracellularmente con impulsi quadrati di 500 millisecondi di corrente depolarizzante.Prima, durante e dopo un'applicazione di stimolazione della corrente continua trans-spinale. Si è scoperto che la stimolazione della corrente continua trans-spinale anodale agisce verso una maggiore eccitabilità del motoneurone e frequenze più elevate di cottura ritmica. Mentre la stimolazione della corrente continua trans-spinale catodale, ha agito verso l'inibizione del fuoco.Inoltre, gli effetti di entrambi i tipi di stimolazione della corrente continua trans-spinale, hanno superato il periodo di polarizzazione. I dati imprecisi possono essere acquisiti, se i criteri di inclusione dei dati sono compromessi a causa della penetrazione imperfetta delle cellule. Un fallimento nel compensare la resistenza e la capacità del microelettrodo o l'instabilità del midollo spinale.È imperativo che non si danneggi il midollo spinale durante la dissezione in quanto la lesione può causare shock spinale, rendendo impossibili ulteriori registrazioni. È possibile raccogliere campioni di tessuto per ulteriori analisi istologiche o immuno citochimicologiche. Ad esempio, la misurazione dell'espressione c-fos può essere usata come proxy dell'attività neuronale.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Questo nuovo metodo permette la registrazione simultanea intracellulare di una motoneuron singolo topo adulto e la misura della forza prodotta dalle sue fibre muscolari. L'indagine combinato delle proprietà elettriche e meccaniche delle unità motorie negli animali normali e geneticamente modificato è una svolta per lo studio del sistema neuromuscolare.

Registrazione simultanea intracellulare di un motoneuroni lombare e la forza prodotta dal suo gruppo motore nel topo adulto<em&gt; In vivo</em

Questo video mostra la registrazione di segnali elettrici da singoli neuroni cerebrali utilizzando una micropipetta di vetro a punta fine e una configurazione specializzata. La micropipetta viene inserita con cura nel cervello del ratto e viene ronzata per penetrare nel neurone per registrare i segnali elettrici neuronali interni.

Registrazione in vivo di segnali intracellulari da un singolo neurone

Questo video descrive la registrazione intracellulare in vivo di motoneuroni di ratto sotto stimolazione transspinale a corrente continua. Il protocollo descrive come misurare le proprietà della membrana e registrare l'attivazione ritmica dei motoneuroni prima, durante e dopo la polarizzazione anodica o catodica del midollo spinale.

Stimolazione transspinale a corrente continua del motoneurone spinale di un ratto

Questo video mostra la procedura per registrare il potenziale d'azione muscolare composto (CMAP) nei ratti applicando stimoli elettrici al nervo ulnare, regolando gli elettrodi per un segnale ottimale e aumentando la stimolazione per valutare la funzionalità del nervo. Questo metodo consente lo studio in vivo delle funzioni dei nervi periferici nei disturbi neurologici.

Misurazione in vivo del potenziale d'azione muscolare composto in un ratto

Questo video mostra una registrazione a fibra singola della conduzione nervosa della fibra C nei ratti. Un ratto anestetizzato viene inciso per esporre il nervo sciatico, che fornisce l'apporto sensoriale e motorio agli arti inferiori. Le singole fibre C vengono quindi esposte. La stimolazione elettrica viene fornita utilizzando elettrodi di stimolo impiantati nel piede e una risposta viene registrata da una singola fibra nervosa.

Registrazione in vivo a fibra singola delle fibre C del nervo sciatico nei ratti

GABAergica inibizione presinaptica è un potente meccanismo inibitorio nel midollo spinale importante per il motore e l'integrazione del segnale sensoriale in reti midollo spinale. Sottostante afferenti primari depolarizzazione può essere misurata mediante registrazione dei potenziali radice dorsale (DRP). Qui mostriamo un metodo di registrazione in vivo di DRP nei topi.

Misurare spinale Presinaptiche inibizione nei topi radice dorsale Recording potenziale<em&gt; In Vivo</em

Mostriamo come preparare le fette oblique del midollo spinale nei topi giovani. Questa preparazione consente la stimolazione delle radici ventrali.

La preparazione di Oblique Spinal Cord Fette per ventrale Root Stimolazione

La registrazione a fibra singola è una tecnica elettrofisiologica efficace applicabile al sistema nervoso centrale e periferico. Insieme alla preparazione della DRG intatta con il nervo sciatico attaccato, viene esaminato il meccanismo di guasto della conduzione. Entrambi i protocolli migliorano la comprensione del rapporto del sistema nervoso periferico con il dolore.

Uso della registrazione in fibra singola in vivo e della radice dorsale intatta Ganglion con il nervo Sciatico attaccato per esaminare il meccanismo del fallimento della conduzione

Questo metodo consente la registrazione della forza di contrazioni e contrazioni tetaniche e potenziali d'azione in tre tipi di unità motorie nel muscolo gastrocnemio mediale del ratto. L'isolamento funzionale di una singola unità motoria è indotto dalla stimolazione elettrica dell'assone.

Isolamento funzionale di unità motorie singole del muscolo gastrocnomio mediale del ratto

Questo protocollo descrive un metodo che utilizza un patch-clamp per studiare le risposte elettriche dei motoneuroni alla stimolazione del midollo spinale (SCS) con un'elevata risoluzione spazio-temporale, che può aiutare i ricercatori a migliorare le loro capacità di separare il midollo spinale e mantenere contemporaneamente la vitalità cellulare.

La preparazione ex vivo di una fetta di midollo spinale per la registrazione del patch-clamp a cellula intera nei motoneuroni durante la stimolazione del midollo spinale

Descriviamo un protocollo per la registrazione extracellulare multicanale spinale insieme alla registrazione della funzione cardiaca e all'analisi dei neuroni del corno dorsale spinale bloccati nel cuore. Questo metodo offre un quadro temporalmente sincronizzato per lo studio dei meccanismi spinali alla base dei cambiamenti funzionali viscerali toracici indotti dall'agopuntura.

Studio dei profili codificanti della stimolazione somatica sulle risposte neuronali bloccate cardiache nel corno dorsale spinale del ratto

Impara la registrazione intracellulare in vivo di motoneuroni spinali nel ratto durante la stimolazione a corrente diretta trans-spinale. Questo metodo consente di analizzare le proprietà di membrana e i pattern di attività neuronale.

In Vivo Registrazione intracellulare di Motoneuroni Spinali Ratti Identificati dal Tipo durante la stimolazione a corrente diretta trans-spinale (Video) | JoVE Journal

In Vivo Registrazione intracellulare di Motoneuroni Spinali Ratti Identificati dal Tipo durante la stimolazione a corrente diretta trans-spinale

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