Metodo UPLC-UV migliorato per la quantificazione della vitamina C nelle varietà di lattuga(Lactuca sativa L.) e nei parenti selvatici delle colture(Lactuca spp.)

La vitamina C è un indicatore del valore nutrizionale di frutta e verdura. Abbiamo bisogno di un metodo semplice e affidabile per quantificarlo, specialmente nella lattuga, la verdura a foglia più consumata al mondo. Questo metodo previene la degradazione della vitamina C e fornisce un'estrazione migliorata e una quantificazione rapida e affidabile degli acidi ascorbico e deidroascorbico, grazie alla sua accuratezza e sensibilità.

Questo metodo può essere utilizzato nella tecnologia alimentare per creare etichette di fatti nutrizionali, in medicina per studiare gli effetti alimentari sulla salute e nell'allevamento delle piante, per aumentare il contenuto di vitamina C in diverse specie. A dimostrare la procedura con Ines Medina Lozano, ci saranno Jose Angel Aranjuelo e Arantzazu Castellanos, due analisti del mio laboratorio. Per preparare i campioni vegetali, raccogliere almeno una foglia esterna e una interna per pianta e congelare immediatamente le foglie in azoto liquido, prima di metterle in meno 80 gradi Celsius.

Per liofilizzare i campioni vegetali congelati, posizionare i tubi campione non conciati sui vassoi all'interno della camera di liofilizzazione del liofilizzatore e programmare il liofilizzatore come indicato. Mantenere la temperatura del condensatore a meno 80,2 gradi Celsius e la costante di vuoto a 112 Quando il materiale è completamente asciutto, aggiungere sfere di acciaio inossidabile di 10 millimetri di diametro ai campioni lyophilizzati, in tubi in polipropilene da 20 millilitri. E utilizzare un vortice multitubo, al momento e nell'intensità appropriati, per macinare i campioni in polvere fine.

Per preparare soluzioni standard di stock di acido ascorbico e diluizione, pesare esattamente 10 milligrammi di standard di acido ascorbico su un bilancino di precisione. E a 90 millilitri di fase mobile al campione. Utilizzare un agitatore magnetico per sciogliere il campione e utilizzare un pallone volumetrico per misurare con precisione 100 millilitri della soluzione risultante.

Aggiunta di acqua ultrapura aggiuntiva, acidificata a pH due con acido formico, se necessario. Quindi preparare cinque diluizioni dal materiale, per ottenere una curva di calibrazione. Lavorando a bassa intensità luminosa, aggiungere un campione macinato lyophilizzato da 50 milligrammi e cinque millilitri di solvente da estrazione, a un tubo di centrifuga in polipropilene da 15 millilitri e vortice la soluzione per cinque secondi.

Dopo aver agitato il campione per 10 minuti su uno shaker orbitale a 2000 giri al minuto, trasferire il tubo in un bagno ad ultrasuoni per 10 minuti, a temperatura ambiente e raccogliere il campione per centrifugazione. Quindi filtrare il supernatante attraverso un filtro di cellulosa rigenerata da 0,22 micron, in una fiala ambrata da cinque millilitri, per estrarre sia gli acidi ascorbico che deidroascorbico nell'estratto uno. Per preparare la diluizione per determinare la concentrazione di acido ascorbico nei campioni fogliari, aggiungere 200 microlitri di estratto uno e 800 microlitri di acqua ultrapura in una fiala liquido liquido a due millilitri e chiudere il flaconcino con un tappo PTFE/silicone.

Per l'estrazione totale dell'acido ascorbico, trasferire 200 microlitri dell'estratto uno, in una fiala cromatografica liquida ambrata a due millilitri e aggiungere 200 microlitri di soluzione riducente al flaconcino. Chiudere il flaconcino con una spina e vortice la soluzione per cinque secondi. Dopo un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente, protetta dalla luce, utilizzare 200 microlitri di acido solforico molare 0,4, per fermare la reazione e stabilizzare l'acido ascorbico, in un pH acido.

Per preparare la diluizione per determinare la concentrazione totale di acido ascorbico nei campioni, aggiungere 400 microlitri di acqua ultrapura, all'estratto totale di acido ascorbico due. Chiudere il flaconcino con una spina. Almeno un'ora prima di iniziare l'esperimento, confermare che tutte le soluzioni di lavoro sono state caricate nel sistema UPLC e accendere i tre moduli UPLC.

Al termine del processo di calibrazione interno, aprire il software e caricare il programma strumentale. Una volta caricato il software, fare clic su Quaternary Solvent Manager e fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare Avvia console, per accedere alla console di gestione UPLC. Fare clic su Sistema, Controllo e Avvio, per procedere alla preparazione e stabilizzazione dello strumento UPLC, e fare clic su Prime Solvents, QSM, controllare A, B, C, D, Seal Wash e Duration of Prime, maggiore di cinque minuti, per eliminare tutte le linee UPLC, per almeno cinque minuti.

Fare clic su SM, controllare Lavare solvente superiore a 45 secondi. Controllare il solvente di spurgo e 35 cicli per eliminare e pulire l'iniettore. Per equilibrare l'UPLC in base alle condizioni del metodo, controllare Equilibrate su Method e QSM e impostare il flusso su 0,3 millilitri al minuto.

Solvente da A al 2%solvente B a 0%solvente C 98% e solvente D a 0%Ancora in equilibrato su Metodo e SM e impostare il campione a 5 gradi Celsius, e la colonna a 30 gradi Celsius. Sempre in Equilibrare su Metodo e altro, selezionare Luce su e fare clic su Avvia. Lasciare stabilizzare l'apparecchiatura per almeno un'ora.

Per verificare la stabilità, fate clic su Avvia sistema console (Launch Console System) e QSM e selezionate Pressione sistema QSM (QSM System Pressure), solo per controllare la pressione nella colonna. Se non ci sono tendenze identificabili nelle variazioni di pressione e il valore delta è inferiore a 10 libbre per pollice quadrato di pressione, nella schermata di avvio rapido, riempire la matrice con i nomi degli standard e dei campioni da analizzare. Per determinare la concentrazione di acido ascorbico negli standard, iniettare cinque microlitri di ciascuna diluizione nello strumento UPLC ed effettuare la cromatografia, a partire dalla più diluita, alla soluzione più concentrata come indicato nella tabella.

Per determinare l'acido ascorbico e la concentrazione totale di acido ascorbico nei campioni fogliari, iniettare cinque microlitri dell'estratto diluito uno ed estrarne due rispettivamente nello strumento UPLC per l'analisi cromatografica. Per calcolare le concentrazioni di acido ascorbico e acido ascorbico totale, nel software fare clic su Quickstart, Sfoglia progetto, Canali, il nome dello standard o del campione e del canale PDA uno, 245 nanometri a 1,2 nanometri. Per aprire i cromatogrammi standard e campione, fare clic sul punto iniziale del cromatogramma e trascinarlo nel punto finale, per integrare il picco corrispondente negli standard e nei campioni.

Utilizzare quindi i dati delle diluizioni standard dell'acido ascorbico, per costruire una curva di calibrazione, per rappresentare i valori di assorbanza determinati cromatograficamente e interpolare i valori di assorbanza del campione, per ottenere l'acido ascorbico e la concentrazione totale di acido ascorbico, secondo la formula. La quantificazione della vitamina C nelle matrici di Lactuca, richiede lo sviluppo di un approccio cromatografico in grado di garantire risultati affidabili. Qui, si può osservare un cromatogramma risultante da un protocollo non ottimizzato che presenta e un picco di acido ascorbico, insieme a un non identificato alla spalla del minatore.

Tuttavia, dopo aver migliorato le condizioni di estrazione e cromatografiche, è possibile ottenere un picco di acido ascorbico risolto senza interferenze di composti sconosciuti. Inoltre, l'uso di apparecchiature ultraviolette UPLC, invece dell'ultravioletto HPLC, riduce i tempi di ritenzione e di corsa. Le interferenze nei picchi di acido ascorbico, si traducono costantemente in una sottovalutazione del contenuto di vitamina C, a causa di una separazione insufficiente durante il processo cromatografico.

Poiché le aree di picco sovrapposte sono integrate da una caduta verticale nel punto più profondo tra di esse. Inoltre, l'utilizzo di un protocollo non ottimizzato impedisce l'estrazione di qualsiasi conclusione utile, dai risultati. Poiché tutti i campioni sembrano avere un contenuto simile di vitamina C, in una qualsiasi delle sue forme.

Al contrario, l'utilizzo del protocollo ottimizzato consente il rilevamento di differenze statisticamente significative tra i diversi tipi di campioni. Assicurarsi di raccogliere più campioni, di conservare correttamente i campioni, di ridurre al minimo l'esposizione del campione ad agenti ossidanti e di quantificare entrambe le forme di vitamina C.Il contenuto totale di vitamina C può essere quantificato non solo in qualsiasi specie vegetale ma anche, in qualsiasi frutto in qualsiasi frutta e verdura, o anche negli alimenti trasformati con poche modifiche tecniche.