Name: Differenziazione e caratterizzazione di progenitori neurali e neuroni da cellule staminali embrionali di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Impara a differenziare cellule staminali embrionali di topo in neuroni con il metodo hanging drop. Questo protocollo include analisi fenotipica completa per studiare lo sviluppo neurale in vitro.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del NIH (1R35GM133496-01) a Z. Gao. Vorremmo ringraziare il Dr. Ryan Hobbs per l'assistenza nel sezionamento. Ringraziamo le strutture principali del Penn State College of Medicine, tra cui le scienze del genoma e la bioinformatica, l'Advanced Light Microscopy Imaging e la citometria a flusso. Ringraziamo anche il Dr. Yuka Imamura per l'assistenza nell'analisi RNA-seq.

1. Cultura mESC
<ol><li>Rivestire una piastra di 10 cm trattata con coltura tissutale con lo 0,1% di gelatina e lasciare riposare la gelatina per almeno 15-30 minuti prima di aspirarla.</li>
	<li>I fibroblasti embrionali di topo (MEF) irradiati γ un giorno prima di coltivare le mESC nel mezzo mESC preriscaldato (Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) with 15% fetale bovine serum (FBS), aminoacidi non essenziali, β-mercaptoetanolo, L-glutammina, penicillina/streptomicina, piruvato di sodio, LIF, PD0325901 (PD) e Chir99021 (CH)).</li>
	<li>Consentire ai MEF irradiati γ di depositarsi e attaccarsi alla superficie della piastra prima di coltivare le cellule E14.</li>
	<li>Scongelare gli ESC E14 a bagnomaria a 37 °C e trasferire rapidamente le celle in un tubo conico di 15 cm con mezzo caldo mESC. Pellet le celle a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Risospese le cellule in 10 mL di terreno mESC e placcare le cellule sulla piastra di coltura contenente i MEF irradiati γ seminati in precedenza. Incubare la coltura cellulare in un incubatore a 37 °C sotto il 5% di CO2.</li>
	<li>Per il passaggio in coltura, aspirare il mezzo e lavare la piastra con 1x PBS sterile. Aggiungere abbastanza 0,05% di tripsina per coprire la superficie della piastra e incubare a 37 °C per 3 minuti.</li>
	<li>Neutralizzare la tripsina con mezzo mESC e pipetta per generare sospensione monocellulare. Centrifugare le cellule a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Contare le cellule con un emocitometro o un contatore cellulare e seminare circa 5,0 x 105 cellule in una piastra di coltura di 10 cm.</li>
	<li>Risospese le cellule in 10 mL di mezzo mESC, placcare le cellule sulla piastra di coltura tissutale rivestita di gelatina e incubare le colture come descritto in precedenza. NOTA: Si raccomanda di passare le mESC ogni 2 giorni per evitare che le cellule si differenzino nelle loro colonie. Il rosso fenolo nel mezzo funziona esclusivamente come indicatore di pH e, a seconda della densità cellulare, può diventare giallastro (più acido), prima di 2 giorni. Quindi, potrebbe essere necessario cambiare il mezzo ogni giorno. I MEF irradiati γ alla fine moriranno dopo un paio di passaggi.</li>
</ol>2. Differenziazione di EB, NPC e neuroni
<ol><li>Eseguire il protocollo di passaggio di coltura menzionato in precedenza e contare le cellule (passaggi 1.7-1.10).</li>
	<li>Metodo di goccia sospesa (giorno 0)<ol>
<li>Per una piastra di coltura cellulare di 10 cm, contare circa 2,5 x 104 cellule in cui 5,0 x 102 cellule saranno sospese in un mezzo di differenziazione da 20 μL (DMEM con 15% FBS, aminoacidi non essenziali, β-mercaptoetanolo, L-glutammina, penicillina / streptomicina e piruvato di sodio). Circa cinquanta goccioline da 20 μL contenenti le cellule possono essere placcate su una piastra da 10 cm.</li>
		<li>Aliquotare il numero appropriato di cellule, quindi centrifugare le cellule a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Risospese le cellule nel volume appropriato del mezzo di differenziazione per una densità cellulare di 5,0 x 102 cellule per 20 μL (ad esempio, 2,5 x 104 cellule in 1 mL di mezzo di differenziazione).</li>
		<li>Utilizzando una micropipetta o una pipetta ripetitore, posizionare 20 μL di goccioline della sospensione cellulare sul coperchio della piastra di coltura tissutale. Assicurati che le goccioline non siano troppo vicine l'una all'altra per impedire loro di fondersi. NOTA: le goccioline possono essere placcate su una piastra di fissaggio trattata con coltura di tessuto o su una piastra di sospensione in quanto verranno posizionate sul coperchio e non sulla piastra stessa. Per un approccio più fattibile e sterile, piallare le goccioline su una piastra di coltura tissutale di attacco e trasferirle su una piastra di sospensione come descritto di seguito.</li>
		<li>Riempire la piastra con 5-10 ml di 1x PBS e rimettere con cura il coperchio sulla piastra. Incubare la coltura nell'incubatore a 37 °C. NOTA: PBS viene aggiunto alla piastra di coltura per evitare che le goccioline si secchino.</li>
	</ol></li>
	<li>Il giorno 2,utilizzare una micropipetta per raccogliere le goccioline dal coperchio e metterle in una piastra di sospensione per colture cellulari di 10 cm riempita con 10 ml di mezzo di differenziazione. Incubare la coltura su uno shaker orbitale che scuote a bassa velocità nell'incubatore.</li>
	<li>Il giorno 4,per raccogliere gli EB, raccogliere le cellule, centrifugare a 200 x g per 3 min e rimuovere il surnatante. NOTA: Gli EB possono anche essere lavati con 1x PBS secondo i requisiti degli esperimenti successivi.</li>
	<li>Per continuare la procedura e indurre la differenziazione EB in cellule progenitrici neurali (NPC), preparare il mezzo di differenziazione con acido retinoico (RA) da 5 μM.</li>
	<li>Rimuovere il vecchio mezzo pellettizzando gli EB a 100 x g per 3 minuti o lasciare che gli EB si depositino prima di aspirare il vecchio mezzo. Aggiungere 10 ml del mezzo di differenziazione contenente 5 μM RA alla piastra di coltura.</li>
	<li>Il giorno 6, sostituire almeno la metà del mezzo con un mezzo fresco contenente 5 μM RA inclinando la piastra e pipettando il mezzo come descritto sopra. NOTA: Si raccomanda di sostituire almeno la metà del mezzo con un mezzo fresco contenente RA nei giorni 5 e 7. Prendi nota dell'indicatore rosso fenolo; se diventa giallastro, è meglio sostituire tutto il mezzo.</li>
	<li>Il giorno 8,raccogli gli NPC raccogliendo le cellule, centrifugando a 200 x g per 3 minuti e rimuovendo il surnatante. NOTA: Gli NPC possono anche essere lavati con 1x PBS in base alle esigenze degli esperimenti successivi. Se necessario, gli NPC possono essere congelati e scongelati di nuovo per una successiva coltura e analisi. Se gli NPC devono essere coltivati, l'accutasi può anche essere usato come alternativa alla tripsina.</li>
	<li>Per continuare la procedura e differenziare gli NPC in neuroni, raccogliere gli NPC in un tubo conico da 15 ml mediante centrifugazione, dissociarli con tripsina e incubarli a 37 °C per 3 min. Pipettare gli NPC per garantire che tutti gli aggregati NPC siano dissociati e neutralizzare la tripsina con il mezzo.</li>
	<li>Filtrare le cellule con un colino di cellule di nylon da 40 μm e contare le cellule prima di placcarle ad una densità di 1,5 x10 5/cm2 in mezzo N2 (DMEM/F12 medio + 3 mg/mL di glucosio + 3 mg/mL di albumina sierica bovina ricca di lipidi (LBSA) + supplemento di 1:100 N2 + 10 ng/mL bFGF + 50 U/mL penna/streptococco + 1 mM di L-glutammina) su una piastra trattata con colture tissutali per successivi esperimenti di PCR e western blot; o su una camera di coltura tissutale per esperimenti di immunofluorescenza.</li>
	<li>Il giorno 9, sostituire il vecchio mezzo con un mezzo N2 fresco.</li>
	<li>Il giorno 10,cambiare il mezzo N2 con il mezzo N2 / B27 (50% DMEM / F12 e 50% basale neurale, 3 mg / mL LBA, 1: 200 N2 supplemento, 1: 100 B27 supplemento, 50 U / mL penna / streptococco e 1 mM L-glutammina).</li>
	<li>Nei giorni 11-12, raccogliere i neuroni come segue. Lavare le cellule con 1x PBS, aggiungere tripsina e incubare la coltura nell'incubatore a 37 °C per 3 minuti prima di neutralizzare la tripsina con mezzo e centrifugare a 200 x g per 3 min.</li>
</ol>3. Caratterizzazione di mESC e cellule differenziate
<ol><li>Saggio della fosfatasi alcalina (AP) 
	<ol>
<li>Utilizzare un kit per valutare l'attività della fosfatasi alcalina (vedere la Tabella dei materiali).</li>
		<li>Rimuovere il mezzo dalla piastra di coltura e lavare gli ESC con 1x PBS.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL della soluzione fissa (composta da formaldeide e metanolo) fornita con il kit alla piastra e incubarla a temperatura ambiente per 2-5 minuti. NOTA: l'eccessiva incubazione nella soluzione di correzione può compromettere l'attività pa.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione fissa, lavare gli ESC con 1x PBS e lasciare una certa quantità di PBS nella piastra. NOTA: mantenere le ESC umide in PBS per non compromettere l'attività AP.</li>
		<li>Preparare la soluzione AP mescolando le soluzioni di substrato A, B e C con un rapporto 1:1:1. Mescolare prima le soluzioni A e B e incubare la miscela a temperatura ambiente per 2 minuti prima di aggiungere la soluzione C.</li>
		<li>Rimuovere il PBS 1x e aggiungere la soluzione AP preparata in precedenza.</li>
		<li>Incubare gli ESC per circa 15 minuti al buio avvolgendo la piastra di coltura con un foglio di alluminio o eseguendo il passaggio 3.5 in una stanza buia.</li>
		<li>Monitorare la reazione e rimuovere la soluzione di reazione quando la soluzione diventa luminosa per evitare macchie non specifiche.</li>
		<li>Lavare gli ESC due volte con 1x PBS.</li>
		<li>Evitare che il campione si asciughi coprendo gli ESC con 1x PBS o mezzo di montaggio. NOTA: per l'espressione AP verrà visualizzata una macchia rossa o viola. La piastra può essere conservata in frigorifero a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>RT-qPCR 
	<ol>
<li>Raccogliere le cellule in varie fasi seguendo i passaggi 1.6-1.7 e 2.4 rispettivamente per ESC ed EB e NPC.</li>
		<li>Isolare l'RNA utilizzando RNA, DNA e soluzione di estrazione proteica (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Genera cDNA con un kit di trascrittasi inversa (vedi la Tabella dei materiali)e segui il manuale del produttore.</li>
	</ol></li>
	<li>Fissazione e incorporamento 
	<ol>
<li>Raccogliere EB e NPC come descritto sopra (fase 2.6) e fissarli con una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% in 1x PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il PFA e lavare il campione con 1x PBS per 5 minuti.</li>
		<li>Posizionare il campione in una diluizione seriale di 1s PBS, 10%, 20% e 30% di saccarosio a 25\u201228 °C, dove il campione viene trasferito alla soluzione successiva dopo 30 minuti di incubazione. NOTA: Il campione può essere conservato nella soluzione di saccarosio al 30% a 4 °C prima di continuare con la fase di incorporamento.</li>
		<li>Bagnare la punta della pipetta con soluzione di saccarosio prima di posizionare il campione (senza impilarli) al centro del criostampo e pipettare il liquido in eccesso. NOTA: la carta da filtro può essere utilizzata anche per rimuovere la soluzione in eccesso. Bagnare la punta della pipetta con una soluzione di saccarosio è importante per evitare che gli EB e gli NPC si attacchino alle pareti della punta.</li>
		<li>Aggiungere con attenzione la soluzione a temperatura di taglio ottimale (OCT) allo stampo senza sospescere nuovamente i campioni e rimuovere le bolle in eccesso con una pipetta.</li>
		<li>Posizionare lo stampo con il campione su un miscelatore da laboratorio a bassa velocità per agitare leggermente il campione per 15 minuti. Questo aiuta a sistemare gli EB e gli NPC verso il basso se vengono risospesi nella soluzione OCT.</li>
		<li>Congelare rapidamente il campione posizionando lo stampo in azoto liquido o su ghiaccio secco. NOTA: i campioni possono essere conservati in un congelatore a -70 °C prima di passare al passaggio successivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Criosezione 
	<ol>
<li>Impostare il criostato in modo che si raffreddi a -20--18 °C prima di trasferire il campione allo strumento.</li>
		<li>Staccare il blocco OCT congelato dallo stampo e fissarlo sul supporto con una piccola soluzione OCT posizionata sulla superficie del supporto.</li>
		<li>Allineare il blocco dello Strumento di personalizzazione di Office in modo che gli NB e gli NPC siano più vicini al pannello per garantire che il campione non vada perso durante il sezionamento.</li>
		<li>Sezionare con attenzione 10 μm del blocco e prestare molta attenzione alle fette che contengono il campione.</li>
		<li>Posizionare rapidamente la fetta OCT contenente il campione sul vetrino di vetro che incorpora il tessuto e lasciare asciugare all'aria le fette OCT per 1 ora a temperatura ambiente. NOTA: I campioni possono essere conservati a -70 °C per un uso successivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunofluorescenza (IF) 
	<ol>
<li>Blocca sezioni OCT o camere di coltura contenenti neuroni in 10% di siero d'asino normale / 0,1% Triton X-100 in 1x PBS per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubare i campioni in anticorpi primari diluiti in siero d'asino normale al 5% e Triton X-100 allo 0,05% in 1x PBS durante la notte a 4 °C.</li>
		<li>Lavare i campioni in 1x PBS/0,1% Triton X-100 tre volte per 5 minuti ogni lavaggio.</li>
		<li>Incubare i campioni con anticorpi secondari diluiti in siero d'asino normale al 5% / Triton X-100 allo 0,05% in 1x PBS per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavare i campioni in 1x PBS/0,1% Triton X-100 tre volte per 5 minuti ogni lavaggio, quindi incubare i campioni in 1 μg/mL DAPI.</li>
		<li>Montare i campioni con un coperchio e un mezzo di montaggio e lasciarlo asciugare.</li>
		<li>Osservare i campioni al microscopio a fluorescenza.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi RNA-seq 
	<ol>
<li>Raccogliere le cellule in varie fasi ed eseguire l'estrazione dell'RNA (vedere il passaggio 3.2).</li>
		<li>Preparare le librerie di cDNA, eseguire il sequenziamento profondo e l'analisi dei dati secondo il protocollo descritto in Wang et al.8.</li>
		<li>Eseguire l'analisi gene ontology (GO) utilizzando il pacchetto R, clusterProfiler.</li>
	</ol></li>
	<li>Citometria a flusso 
	<ol>
<li>Raccogliere le ESC seguendo i passaggi 1.6-1.7 e risospensionare le celle nel mezzo. Raccogliere gli EB e gli NPC seguendo il passaggio 2.4 e risospensionare le cellule nel mezzo.</li>
		<li>Filtrare la sospensione cellulare utilizzando il filtro per celle di nylon da 40 μm in un nuovo tubo conico da 15 ml.</li>
		<li>Misurare il segnale GFP dei campioni utilizzando il citometro a flusso (eseguito dalla struttura principale dell'istituzione).</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Bahmad, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Akt%2FmTOR+pathway+in+cancer+stem%2Fprogenitor+cells+is+a+potential+therapeutic+target+for+glioblastoma+and+neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma.</a> Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).</li>
<li>Bastiaens, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+a+MEMS-Based+3D+Cell+Culture+System+for+in+vitro+Neuro-Electrophysiological+Recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Mechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings.</a> Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).</li>
<li>Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-layer%3A+The+case+for+3D+bioprinting+neurons+to+create+patient-specific+epilepsy+models%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models.</a> Materials. 12 (19), (2019).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Joshi, P., Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+imaging+%28HCI%29+on+miniaturized+three-dimensional+%283D%29+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures.</a> Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano che non ci sono interessi finanziari concorrenti.

Il metodo per la differenziazione neurale delle cellule staminali embrionali di topo è stato stabilito per decenni e i ricercatori hanno continuato a modificare i protocolli precedenti o crearne di nuovi per vari scopi7,10,11. Abbiamo utilizzato una serie di saggi per analizzare in modo completo l'efficienza e il progresso delle fasi di differenziazione delle mESC ai neuroni, che possono essere utilizzate nell'analisi di altre d...

Fin dalla loro prima derivazione dalla massa cellulare interna delle blastocisti di topo in via di sviluppo1,2,le cellule staminali embrionali di topo (mESC) sono state utilizzate come potenti strumenti per studiare l'auto-rinnovamento e la differenziazione delle cellule staminali3. Inoltre, lo studio della differenziazione mESC porta a un'enorme comprensione dei meccanismi molecolari che possono migliorare l'efficienza e la sicurezza nella terapia basata sulle cellule staminali nel trattamento di malattie come i disturbi neurodegenerativi4. Rispetto ai modelli animali, questo sistema in vitro offre molti vantaggi, tra cui semplicità nella pratica e nella valutazione, basso costo nel mantenimento delle linee cellulari in contrasto con gli animali e relativa facilità nelle manipolazioni genetiche. Tuttavia, l'efficienza e la qualità dei tipi di cellule differenziate sono spesso influenzate da diverse linee di mESC e dai metodi di differenziazione5,6. Inoltre, i saggi tradizionali per valutare l'efficienza della differenziazione si basano sull'esame qualitativo di geni marcatori selezionati che mancano di robustezza e quindi non riescono a cogliere i cambiamenti globali nell'espressione genica.
Qui miriamo a utilizzare una batteria di saggi per la valutazione sistematica della differenziazione neuronale. Utilizzando sia le tradizionali analisi in vitro su marcatori selezionati che l'RNA-seq, stabiliamo una piattaforma per la misurazione dell'efficienza di differenziazione e dei cambiamenti trascrittomici durante questo processo. Sulla base di un protocollo precedentemente stabilito7,abbiamo generato corpi embrioidi (EB) attraverso la tecnica della goccia sospesa, seguita dall'induzione utilizzando la quantità soprafisiologica di acido retinoico (RA) per generare cellule progenitrici neurali (NPC), che sono state successivamente differenziate in neuroni con mezzo di induzione neurale. Per esaminare l'efficienza del differenziamento, oltre ai tradizionali test RT-qPCR e immunofluorescenza (IF), abbiamo eseguito RNA-seq e citometria a flusso. Queste analisi forniscono una misurazione completa della progressione della differenziazione specifica dello stadio.

<table><tbody><tr><td>0,05% Tripsina + 0,53mM EDTA 1X</td><td>Corning</td><td>25-052-CV</td><td></td></tr><tr><td>0,1% Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td>Preparato in acqua deionizzata</td></tr><tr><td>16% Paraformaldeide</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td>Diluito in 1X PBS</td></tr><tr><td>40-&mu; filtro cellulare m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Albumax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11020021</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 capra anti-topo IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>Antibody è stato diluito a 1:500 per IF</td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatasi Staining Kit II</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td></td></tr><tr><td>AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox</td><td>Azura Genomics</td><td>AZ-2105</td><td></td></tr><tr><td>Integratore B27</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto</td><td>BD</td><td>657338</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>11123149001</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer Kit DNA ad alta sensibilità</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Chir99021</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>C298-500</td><td>Fisher Chimico</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>R37606</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EB tampone</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>111000200</td><td>Pharmco</td><td>Diluito in acqua deionizzata</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S10250</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Vetrini per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500 Sistema di sequenziamento</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>BDH1133-4LG</td><td>BDH VWR</td><td>Analitico Diluito in acqua deionizzata</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Raccolto dal surnatante MEF</td></tr><tr><td>m18srRNA primer</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-GCAATTCCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'MEM</td></tr> <tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>mNanog primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'</td></tr><tr><td>mNes primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTGTTG-3'mNeuroD1</td></tr> <tr><td>primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'mOct4</td></tr> <tr><td>primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'- CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'mPax6</td></tr> <tr><td>primer</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-CTTGGGAAATCCGAGAGAGAGAGAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'N2</td></tr> <tr><td>integratore</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Nestin anticorpo primario</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>è stato diluito a 1:200 per IF</td></tr><tr><td>Neural basal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>21103049</tr><tr><td>Anticorpo primario del neurofilamento</td><td>DSHB</td><td>2H3</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex Illumina Kit di preparazione della libreria RNA-Seq direzionale rapido</td><td>BioO</td><td>Scientific NOVA-5138-07</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13034</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Preparato in acqua deionizzata</td></tr><tr><td>- Cloruro di potassio</td><td>P217-500G</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>- Fosfato di potassio monobasico anidro</td><td>0781-500G</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>- Cloruro di sodio</td><td>BP358-10</td><td>Fisher Bioreagents</td><td></td></tr><tr><td>- Fosfato di sodio, bibasico, eptaidrato</td><td>SX0715-1</td><td>Milipore</td><td></td></tr><tr><td>Primer per esameri casuali</td><td>Thermo Scientific</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>Acido retinoico</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Preparato in DMSO</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>84097</td><td>Diluito in 1X PBS</td></tr><tr><td>SuperScript III Trascrittasi inversa</td><td>Invitrogen</td><td>18064022</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. composto</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di isolamento TriPure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11667165001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Rapid</td><td>Illumina</td><td>20020616</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP176-100</td><td></td></tr></tbody></table>

differenziazione e caratterizzazione di progenitori neurali e neuroni da cellule staminali embrionali di topo

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Descriviamo la procedura passo-passo per la coltura e la differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in lignaggi neuronali, seguita da una serie di saggi per caratterizzare le cellule differenziate. Le cellule staminali embrionali di topo E14 sono state utilizzate per formare corpi embrioidi attraverso il metodo della goccia sospesa, e poi indotte a differenziarsi in cellule progenitrici neurali dall'acido retinoico e infine differenziate in neuroni. La reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (RT-qPCR) e gli esperimenti di immunofluorescenza hanno rivelato che i progenitori neurali e i neuroni mostrano marcatori corrispondenti (nestina per i progenitori neurali e neurofilamento per i neuroni) rispettivamente al giorno 8 e 12 post-differenziazione. Esperimenti di citometria a flusso su una linea E14 che esprime un reporter GFP guidato dal promotore Sox1 hanno mostrato che circa il 60% delle cellule al giorno 8 sono GFP positive, indicando la differenziazione di successo delle cellule progenitrici neurali in questa fase. Infine, l'analisi RNA-seq è stata utilizzata per profilare i cambiamenti trascrittomici globali. Questi metodi sono utili per analizzare il coinvolgimento di geni e percorsi specifici nella regolazione della transizione dell'identità cellulare durante la differenziazione neuronale.

Come rappresentazione del nostro metodo, abbiamo eseguito un esperimento di differenziazione EB, NPC e neuroni su cellule E14. Le cellule E14 sono state coltivate su MEF irradiati γ (Figura 1A) fino a quando la popolazione meF irradiata γ non si è diluita. Abbiamo confermato la pluripotenza delle cellule E14 eseguendo la colorazione della fosfatasi alcalina (AP)(Figura 1B)e successivamente RT-qPCR (vedi sotto) per i marcatori Nanog e Oct4. Le c...

Descriviamo la procedura per la differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali di topo in cellule neuronali utilizzando il metodo della goccia sospesa. Inoltre, eseguiamo un'analisi fenotipica completa attraverso RT-qPCR, immunofluorescenza, RNA-seq e citometria a flusso.

Differenziazione e caratterizzazione di progenitori neurali e neuroni da cellule staminali embrionali di topo

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Oltre al protocollo per la differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in cellule neuronali, mostriamo anche una serie di esperimenti in grado di analizzare in modo completo il processo di differenziazione. Queste tecniche sono pertinenti allo sviluppo embrionale ectodermico precoce, fornendo ai ricercatori opzioni per analizzare la differenziazione delle cellule neuronali. Quando si tenta questa procedura, è essenziale iniziare con cellule staminali in condizioni ottimali.Quindi è importante che gli EB, gli MPC e i neuroni siano coltivati in terreni freschi e ottimali. La dimostrazione visiva di questo protocollo è importante, perché contiene dettagli minuti che possono influenzarne il successo e l'efficacia, in particolare la parte di differenziazione. Inizia allestendo una coltura cellulare a goccia sospesa.Per una piastra di coltura cellulare da 10 centimetri, regolare la concentrazione a 500 cellule per 20 microlitri di terreno di differenziazione. Preparare una quantità sufficiente di sospensioni cellulari per 50 goccioline da 20 microlitri. Utilizzare una micropipetta o una pipetta a ripetizione per posizionare goccioline da 20 microlitri di sospensione cellulare sul coperchio di una piastra di coltura tissutale, assicurandosi che le goccioline non siano troppo vicine tra loro, per evitare che si fondano.Riempi il piatto con da cinque a 10 millilitri di PBS e rimetti con cura il coperchio sul piatto. Incubare la coltura nell'incubatrice a 37 gradi Celsius. Dopo due giorni, raccogliere le goccioline dal coperchio e posizionarle in una piastra di sospensione per colture cellulari di 10 centimetri riempita con 10 millilitri di terreno di differenziazione, quindi posizionare la piastra su un agitatore orbitale impostato a bassa velocità nell'incubatore.Dopo altri due giorni, centrifugare le cellule a 200 volte G per tre minuti e rimuovere il surnatante. Per indurre la differenziazione del corpo embrioide in cellule progenitrici neurali, risospendere le cellule nel mezzo di differenziazione con acido retinoico a cinque micromolari. Incubare la piastra per due giorni, quindi sostituire almeno metà del terreno con un terreno fresco, inclinando la piastra e pipettandola verso l'esterno.Raccogliere le cellule due giorni dopo centrifugandole a 200 volte G per tre minuti e rimuovendo il surnatante. Fissare i corpi embrioidi e le cellule progenitrici neurali con il 4% di PFA in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi rimuovere il PFA e lavare le celle in PBS per cinque minuti.Incubare le cellule in serie in soluzioni di PBS 10, 20 e 30% saccarosio, a 25-28 gradi Celsius, con ogni incubazione della durata di 30 minuti o più fino a quando le cellule non si depositano sul fondo della provetta. E usalo per trasferire il campione al centro di un criostampo, pipettando il liquido in eccesso. Aggiungere con cautela la temperatura di taglio ottimale o la soluzione OCT allo stampo, senza risospendere il campione, quindi rimuovere le bolle in eccesso con una pipetta.Posizionare lo stampo con il campione su un miscelatore da laboratorio a bassa velocità per 15 minuti, che sistemerà i corpi embrioidi e le cellule progenitrici neurali sul fondo della soluzione OCT. Quindi congelare rapidamente il campione posizionando lo stampo in azoto liquido. Bloccare le sezioni OCT o le camere di coltura contenenti neuroni in siero d'asino normale al 10% e Triton X-100 allo 0,1% in PBS per un'ora a temperatura ambiente.Quindi incubare i campioni in anticorpi primari, diluiti in siero d'asino normale al 5% e Triton X-100 allo 0,05% in PBS, a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, lavare i campioni in PBS con Triton X-100 allo 0,1% tre volte per cinque minuti per lavaggio. Incubarli con anticorpi secondari, diluiti in siero d'asino normale al 5% e Triton X-100 allo 0,05% in PBS, per un'ora a temperatura ambiente.Ripetere i lavaggi in Triton X-100 e PBS, quindi incubare il campione in un microgrammo per millilitro DAPI. Montare il campione con un vetrino coprioggetto e un mezzo di montaggio, lasciarlo asciugare e visualizzarlo con un microscopio a fluorescenza. Per eseguire la differenziazione neuronale, le cellule E14 sono state coltivate su fibroblasti embrionali di topo irradiati con raggi gamma fino a quando la popolazione di fibroblasti non si è diluita.La pluripotenza delle cellule E14 è stata confermata con la colorazione con fosfatasi alcalina. Dopo la differenziazione, i corpi embrionali avevano una forma rotonda che aumentava continuamente di dimensioni. Entro il decimo giorno, le cellule progenitrici neurali che si differenziano in neuroni, avevano una forma cellulare allungata.Esperimenti di immunofluorescenza sono stati eseguiti su cellule progenitrici neurali all'ottavo giorno e sui neuroni al giorno 12. La colorazione positiva è stata osservata per l'annidamento nelle cellule progenitrici neurali e per i neurofilamenti nei neuroni. È stata differenziata una linea di cellule staminali embrionali di topo che esprime un reporter GFP guidato dal promotore Sox1 e la citometria a flusso è stata eseguita sulle cellule staminali embrionali e sulle cellule progenitrici neurali.È stato riscontrato che il 58,7% delle cellule totali allo stadio NPC sono GFP positive, mentre lo 0% sono GFP positive allo stadio ESC. Sono stati eseguiti esperimenti di sequenza di RNA su cellule staminali embrionali E14, corpi embrioidi e cellule progenitrici neurali. I geni nella mappa di calore della sequenza di RNA sono stati ordinati in base ai loro livelli di espressione.L'analisi dell'ontologia genica dei quattro cluster genici ha mostrato che corrispondono a funzioni o percorsi cellulari distinti. Quando si esegue questo protocollo, l'EBS dovrebbe apparire come masse sferiche di cellule annerite. Per assicurarti che l'EBS cresca con tale substrato, cambia il substrato il primo giorno, se il substrato inizia a diventare giallastro.Lo stesso approccio è importante per la coltura di MPC, poiché sia gli EB che le MPC si trovano in una fase critica dello sviluppo embrionale precoce. Altri saggi genomici funzionali, come ChIPseek e i saggi di cattura di conferma della cromatina dalle diverse fasi della differenziazione neuronale, possono essere eseguiti per comprendere i processi biologici sottostanti. L'integrazione mediante saggi di genomica chimica e funzionale nel processo di differenziazione dei neuroni, consente ai ricercatori di delineare meglio i meccanismi molecolari dello sviluppo embrionale precoce.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Descriviamo una piccola molecola a base di protocollo per la differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in cellule precursori degli oligodendrociti (OPC). Questo protocollo genera Olig2 + NG2 + OPC ad alta efficienza da 30 giorni di differenziazione. Abbiamo anche descrivere un metodo per generare "chiodare" OPC che può sparare potenziali d'azione.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali in precursori degli oligodendrociti

Abbiamo sviluppato un nuovo protocollo per migliorare l'efficienza del differenziamento in vitro delle cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori. Le cellule staminali differenziate acquisito motoneuroni presenta come evidenziato dalla espressione di marcatori neuronali e motorie dei neuroni che utilizzano tecniche immunoistochimiche.

Differenziazione efficiente di cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori

Questo video dimostra la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane, o hESC, direttamente in cellule progenitrici neurali senza l'utilizzo di cellule feeder o passaggi intermedi. L'inibizione selettiva della proteina morfogenetica ossea o BMP e le vie di segnalazione del fattore di crescita trasformante-beta, o TGF-β, portano alla differenziazione delle hESC in cellule progenitrici neurali, o NPC.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali umane in progenitori neurali

Questo video dimostra un metodo per la generazione in vitro di cellule progenitrici neurali (NPC) da cellule staminali embrionali di topo (mESC). Le mESC vengono coltivate in sospensione per formare corpi embrioidi (EB), che vengono poi guidati a differenziarsi in NPC tramite trattamento con acido retinoico in una coltura aderente.

Una tecnica per generare cellule progenitrici neurali da cellule staminali embrionali di topo

Il video ha mostrato un metodo di coltura cellulare per differenziare le cellule progenitrici neurali in neuroni. Incubando le cellule in un terreno ricco di sostanze nutritive integrato con fattori di crescita, le cellule progenitrici sono maturate in neuroni con assoni e dendriti sviluppati. Un agente stabilizzante ha assicurato la vitalità cellulare e protetto dal danno ossidativo durante tutto il processo di differenziazione.

Differenziazione delle cellule progenitrici neurali in neuroni

Questo protocollo descrive in dettaglio il metodo per generare progenitori neurali da cellule staminali embrionali utilizzando un metodo monostrato privo di siero. Questi progenitori possono essere utilizzati per derivare tipi di cellule neurali mature o per studiare il processo di specificazione neurale e sono suscettibili di ridimensionamento in formato multipozzetto per lo screening dei composti.

Differenziamento neurale delle cellule staminali embrionali di topo in siero privo monostrato Cultura

Descriviamo una tecnica per utilizzare le cellule staminali embrionali murine per generare due o tre corpi embrionali tridimensionali. Abbiamo poi spiegato come indurre la differenziazione neuronale delle cellule del corpo embrionali di acido retinoico, e come analizzare il loro stato di differenziazione dal marcatore di cellule progenitrici immunofluorescenza e immunoblotting.

Analisi di acido retinoico-indotta neurale differenziazione di cellule staminali embrionali di topo a organi embrionali due e tridimensionali

Questo protocollo descrive un metodo per la generazione di corticale Interneurone progenitori e precursori post-mitotici Interneurone da cellule staminali embrionali di topo usando un metodo modificato embryoid corpo-a-monostrato. Questi progenitori/precursori possono essere usati in vitro o fluorescente ordinati e trapiantate nel neocortex neonatale per lo studio della determinazione di destino o usati in applicazioni terapeutiche.

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Qui, presentiamo una nuova tecnica microsurgical per l'isolamento delle cellule staminali neurali dall'eminenza E13 del mouse embrione gangliare.

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Presentato qui è un protocollo per la generazione di una coltura unicellulare di cellule staminali embrionali umane e la loro successiva differenziazione in cellule progenitrici neurali. Il protocollo è semplice, robusto, scalabile e adatto per lo screening farmacologico e le applicazioni di medicina rigenerativa.

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