Differenziazione e caratterizzazione di progenitori neurali e neuroni da cellule staminali embrionali di topo

Oltre al protocollo per la differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in cellule neuronali, mostriamo anche una serie di esperimenti in grado di analizzare in modo completo il processo di differenziazione. Queste tecniche sono pertinenti allo sviluppo embrionale ectodermico precoce, fornendo ai ricercatori opzioni per analizzare la differenziazione delle cellule neuronali. Quando si tenta questa procedura, è essenziale iniziare con cellule staminali in condizioni ottimali.

Quindi è importante che gli EB, gli MPC e i neuroni siano coltivati in terreni freschi e ottimali. La dimostrazione visiva di questo protocollo è importante, perché contiene dettagli minuti che possono influenzarne il successo e l'efficacia, in particolare la parte di differenziazione. Inizia allestendo una coltura cellulare a goccia sospesa.

Per una piastra di coltura cellulare da 10 centimetri, regolare la concentrazione a 500 cellule per 20 microlitri di terreno di differenziazione. Preparare una quantità sufficiente di sospensioni cellulari per 50 goccioline da 20 microlitri. Utilizzare una micropipetta o una pipetta a ripetizione per posizionare goccioline da 20 microlitri di sospensione cellulare sul coperchio di una piastra di coltura tissutale, assicurandosi che le goccioline non siano troppo vicine tra loro, per evitare che si fondano.

Riempi il piatto con da cinque a 10 millilitri di PBS e rimetti con cura il coperchio sul piatto. Incubare la coltura nell'incubatrice a 37 gradi Celsius. Dopo due giorni, raccogliere le goccioline dal coperchio e posizionarle in una piastra di sospensione per colture cellulari di 10 centimetri riempita con 10 millilitri di terreno di differenziazione, quindi posizionare la piastra su un agitatore orbitale impostato a bassa velocità nell'incubatore.

Dopo altri due giorni, centrifugare le cellule a 200 volte G per tre minuti e rimuovere il surnatante. Per indurre la differenziazione del corpo embrioide in cellule progenitrici neurali, risospendere le cellule nel mezzo di differenziazione con acido retinoico a cinque micromolari. Incubare la piastra per due giorni, quindi sostituire almeno metà del terreno con un terreno fresco, inclinando la piastra e pipettandola verso l'esterno.

Raccogliere le cellule due giorni dopo centrifugandole a 200 volte G per tre minuti e rimuovendo il surnatante. Fissare i corpi embrioidi e le cellule progenitrici neurali con il 4% di PFA in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi rimuovere il PFA e lavare le celle in PBS per cinque minuti.

Incubare le cellule in serie in soluzioni di PBS 10, 20 e 30% saccarosio, a 25-28 gradi Celsius, con ogni incubazione della durata di 30 minuti o più fino a quando le cellule non si depositano sul fondo della provetta. E usalo per trasferire il campione al centro di un criostampo, pipettando il liquido in eccesso. Aggiungere con cautela la temperatura di taglio ottimale o la soluzione OCT allo stampo, senza risospendere il campione, quindi rimuovere le bolle in eccesso con una pipetta.

Posizionare lo stampo con il campione su un miscelatore da laboratorio a bassa velocità per 15 minuti, che sistemerà i corpi embrioidi e le cellule progenitrici neurali sul fondo della soluzione OCT. Quindi congelare rapidamente il campione posizionando lo stampo in azoto liquido. Bloccare le sezioni OCT o le camere di coltura contenenti neuroni in siero d'asino normale al 10% e Triton X-100 allo 0,1% in PBS per un'ora a temperatura ambiente.

Quindi incubare i campioni in anticorpi primari, diluiti in siero d'asino normale al 5% e Triton X-100 allo 0,05% in PBS, a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, lavare i campioni in PBS con Triton X-100 allo 0,1% tre volte per cinque minuti per lavaggio. Incubarli con anticorpi secondari, diluiti in siero d'asino normale al 5% e Triton X-100 allo 0,05% in PBS, per un'ora a temperatura ambiente.

Ripetere i lavaggi in Triton X-100 e PBS, quindi incubare il campione in un microgrammo per millilitro DAPI. Montare il campione con un vetrino coprioggetto e un mezzo di montaggio, lasciarlo asciugare e visualizzarlo con un microscopio a fluorescenza. Per eseguire la differenziazione neuronale, le cellule E14 sono state coltivate su fibroblasti embrionali di topo irradiati con raggi gamma fino a quando la popolazione di fibroblasti non si è diluita.

La pluripotenza delle cellule E14 è stata confermata con la colorazione con fosfatasi alcalina. Dopo la differenziazione, i corpi embrionali avevano una forma rotonda che aumentava continuamente di dimensioni. Entro il decimo giorno, le cellule progenitrici neurali che si differenziano in neuroni, avevano una forma cellulare allungata.

Esperimenti di immunofluorescenza sono stati eseguiti su cellule progenitrici neurali all'ottavo giorno e sui neuroni al giorno 12. La colorazione positiva è stata osservata per l'annidamento nelle cellule progenitrici neurali e per i neurofilamenti nei neuroni. È stata differenziata una linea di cellule staminali embrionali di topo che esprime un reporter GFP guidato dal promotore Sox1 e la citometria a flusso è stata eseguita sulle cellule staminali embrionali e sulle cellule progenitrici neurali.

È stato riscontrato che il 58,7% delle cellule totali allo stadio NPC sono GFP positive, mentre lo 0% sono GFP positive allo stadio ESC. Sono stati eseguiti esperimenti di sequenza di RNA su cellule staminali embrionali E14, corpi embrioidi e cellule progenitrici neurali. I geni nella mappa di calore della sequenza di RNA sono stati ordinati in base ai loro livelli di espressione.

L'analisi dell'ontologia genica dei quattro cluster genici ha mostrato che corrispondono a funzioni o percorsi cellulari distinti. Quando si esegue questo protocollo, l'EBS dovrebbe apparire come masse sferiche di cellule annerite. Per assicurarti che l'EBS cresca con tale substrato, cambia il substrato il primo giorno, se il substrato inizia a diventare giallastro.

Lo stesso approccio è importante per la coltura di MPC, poiché sia gli EB che le MPC si trovano in una fase critica dello sviluppo embrionale precoce. Altri saggi genomici funzionali, come ChIPseek e i saggi di cattura di conferma della cromatina dalle diverse fasi della differenziazione neuronale, possono essere eseguiti per comprendere i processi biologici sottostanti. L'integrazione mediante saggi di genomica chimica e funzionale nel processo di differenziazione dei neuroni, consente ai ricercatori di delineare meglio i meccanismi molecolari dello sviluppo embrionale precoce.