Name: Visualizzazione dellinterazione delle proteine di riparazione del DNA per immunofluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Scopri l'immunofluorescenza indiretta per studiare le interazioni tra proteine di riparazione del DNA nelle cellule HeLa. Questo metodo permette di visualizzare il reclutamento temporale e la formazione di foci proteici.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Fondazione Area San Antonio. Il Mays Cancer Center è supportato dalla sovvenzione core di supporto al centro oncologico NCI P30 CA054174. Vorremmo ringraziare Stephen Holloway per il suo aiuto nell'approvvigionamento delle reagenti e il laboratorio Sung per aver fornito spazio e capacità di microscopia.

1. Coltura cellulare HeLa
<ol><li>Il vetro rotondo pre-trattamento copre le coperture con 1 M HCl a 50 gradi centigradi per 16-18 ore. Risciacquare con ddH2O e conservare al 100% EtOH.</li>
	<li>Preparare il supporto di coltura cellulare: aggiungere il 10% (v/v) FBS al supporto DMEM.</li>
	<li>Crescere 4,0 x 104 celle/bene in una piastra sterile a 12 possidetti con un coperture rotonde da 18 mm a 37 gradi centigradi e 5% di CO2 in un'incubatrice umida. Coltivare le cellule fino all'80% di confluenza (circa 24 ore).</li>
</ol>2. Trattamento cellulare con radiazioni (IR)
<ol><li>Per indurre la formazione di rotture a doppio filamento, esporre le cellule a 4 Gy γ-irradiazione (controllo: Nessuna irradiazione, t-0). Nella cella gamma -40, questo corrisponde a 4,54 min, a 0,815 Gy al minuto.</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 gradi centigradi e al 5% di CO2 in un'incubatrice umidificata per la durata appropriata (punti di tempo scelti qui t, 2, 4, 16 h).</li>
</ol>3. Estrazione nucleare e fissazione cellulare
<ol><li>Preparare le soluzioni stock: 0,2 M PIPES (pH 6.8), 5 M NaCl, 2 M saccarosio, 1 M MgCl2, 0,1 M EGTA (pH 8.0).</li>
	<li>Preparare il buffer di estrazione nucleare (NEB): sciogliere 10 mM PIPES (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 mM sacrose, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA (pH 8.0) e 0.5% (v/v) Triton X-100 in ddH2O. Mix fino a quando non si dissoled completamente.</li>
	<li>Preparare la paraformaldeide (PFA) del 4% (v/v): sciogliere 10 mL della soluzione aques PFA del 16% in 30 mL PBS. Mescolare fino a quando non si dissolva completamente.</li>
	<li>Al momento opportuno (t- 0, 1, 2, 4, 16 h), lavare le celle due volte con 1 mL di PBS. Rimuovere completamente PBS.</li>
	<li>Aggiungere 200 L di NEB ad ogni pozzo per l'estrazione dei nuclei cellulari (il citoplasma è degradato, rimane solo il nucleo) (Figura 2). Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente e rimuovere completamente. NOTA: non superare i 2 minuti.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61447/61447fig02.jpg"> Figura 2: Estrazione nucleare. Immagini rappresentative delle cellule prima dell'estrazione nucleare (a sinistra) e post (a destra). Il citoplasma deve essere digerito, ma la struttura nucleare dovrebbe rimanere intatta dopo l'estrazione (a destra). (A) ingrandimento 20x; barra della scala : 20 m e (B) 40x ingrandimento; barra della scala : 10 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61447/61447fig02large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="6"><li>Lavare le celle con 1 mL di PBS. Rimuovere completamente PBS. Aggiungere PBS con attenzione, le cellule sono molto fragili in questo passaggio.</li>
	<li>Aggiungere 200 L del 4% (v/v) PFA ad ogni pozzo per la fissazione delle cellule. Incubare per 10 minuti a 4 gradi centigradi. Rimuovere completamente PFA.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di PBS. NOTA: le celle possono essere conservate in PBS a 4 gradi centigradi.</li>
</ol>4. Colorazione immunofluorescenza
<ol><li>Preparare la soluzione di blocco: sciogliere il 5% BSA (w/v) in PBS e aggiungere lo 0,3% (v/v) Triton X-100. Mescolare fino a quando completamente sciolto.</li>
	<li>Preparare il buffer di diluizione: sciogliere 1% BSA (w/v) in PBS e aggiungere 0,3% (v/v) Triton X-100. Mescolare fino a quando completamente sciolto.</li>
	<li>Per il blocco, aggiungere 200 L di soluzione di blocco a ciascun pozzo. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente o 16-18 ore a 4 gradi centigradi. NOTA: Se verrà utilizzato un anticorpo di capra, aggiungere il 5% di siero di capra alla soluzione di blocco.</li>
	<li>Diluire l'anticorpo primario nel buffer di diluizione (1:500; vedere la tabella 2 per la lista degli anticorpi) e il vortice fino a quando non è ben miscelato. NOTA: Se si usa l'anticorpo di capra, aggiungere l'1% di siero di capra al tampone di diluizione.</li>
	<li>In una scatola di umidità / incubazione, aderire un pezzo di parafilm. Aggiungere 10 L di anticorpi primari (in una singola goccia). Allineare un bordo del coperture con la goccia e abbassare lentamente sul parafilm, affinché il liquido si diffonda in tutto (evitare le bolle se possibile). Incubare per 2 ore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le coperture tre volte in PBS per 1 minuto.</li>
	<li>Diluire l'anticorpo secondario nel buffer di diluizione (concentrazione finale: 2 g/mL) e nel vortice fino a quando non è ben miscelato.</li>
	<li>Applicare 10 L di anticorpi secondari come descritto per gli anticorpi primari. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente. NOTA: Proteggere dalla luce.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Anticorpo</td>
			<td>Azienda</td>
			<td>Riferimento</td>
			<td>fonte</td>
		</tr>
<tr>
<td>53BP1</td>
			<td>Segnalazione cellulare</td>
			<td>4937</td>
			<td>Coniglio</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-Mouse IgG H&amp;L (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150103</td>
			<td>Asino</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antifosfo-Histone H2A. X (Ser139), clone JBW301</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-Rabbit IgG H&amp;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150081</td>
			<td>Capra</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Anticorpi utilizzati. Elenco degli anticorpi utilizzati in questo studio.
<ol start="9"><li>Lavare le coperture tre volte in PBS per 1 minuto.</li>
	<li>Lavare i coperture con H2O per 1 minuto.</li>
	<li>Controteni il DNA con DAPI: applicare 10 L di 300 nM DAPI (come descritto per gli anticorpi), incubare per 30 minuti a temperatura ambiente e quindi montare su vetrino con un supporto di montaggio a base di glicerolo. In alternativa, aggiungere una goccia (10 L) di supporti di montaggio antifadi commerciali contenenti DAPI su una diapositiva e applicare un coverslip. Premere delicatamente il coverslip e rimuovere il liquido in eccesso intorno ad esso con un tovagliolo di carta.</li>
	<li>Sigillare i coperture con smalto trasparente e lasciarli asciugare per 20 minuti.</li>
	<li>Conservare le diapositive a 4 gradi centigradi.</li>
</ol>5. Acquisizione di immagini
<ol><li>Posizionare una goccia di olio di immersione sulla lente obiettivo 60x. Utilizzare DAPI per individuare i nuclei attraverso il pezzo oculari.<ol>
<li>Per l'acquisizione di immagini XY, aprire il software di acquisizione e selezionare i parametri: Tipo di scanner: Galvano; Modalità scanner: Andata e ora; Dimensioni dell'immagine: 512-512; Modalità PMT: VBF; Media PMT: telaio (4 volte); Scansione sequenziale PMT: linea.</li>
		<li>Selezionare il colorante e i rilevatori: Canale (CH1), Colorare (DAPI), Rilevatore (SD1) Canale (CH2), Dye (Alexa Fluor 488), Rilevatore (HSD3) Canale (CH3), Dye (Alexa Fluor 647), Rilevatore (HSD4)</li>
		<li>Selezionare ON in "z".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Regolare l'immagine dal vivo. Premere il pulsante Live nella finestra Live.<ol>
<li>Regolare la messa a fuoco e impostare l'intensità laser (%), la sensibilità (HV), il guadagno e l'offset sulla finestra degli strumenti "PMT".<ol>
<li>Regolare l'intensità del laser (%): per la luminosità e lo sbiancamento. Più alta è l'intensità del laser, più forte è il segnale, ma il campione fotoseguita'.</li>
			<li>Regolare la sensibilità (HV): livello di rumore. Più alto è l'HV, più forte è il segnale, ma l'immagine sarà rumorosa se troppo alta. NOTA: mantenere sempre costante la tensione.</li>
			<li>Regolare l'offset: livello di sfondo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Selezionate Inizio/Fine (15 sezioni) per Pile .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avviare l'acquisizione.<ol>
<li>Selezionare la cartella in cui salvare le immagini. Premere il pulsante Start di LSM per avviare l'acquisizione dell'immagine. Premere il pulsante Fine serie per completare l'acquisizione dell'immagine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Analisi dei dati
<ol><li>Per l'analisi delle immagini, aprire il software di analisi.<ol>
<li>Premere la finestra degli strumenti Batch, selezionare le immagini da analizzare e selezionare la cartella di output.</li>
		<li>Premere la finestra degli strumenti Analisi e selezionare Proiezione (verrà visualizzata la proiezione di intensità massima da 15 sezioni).</li>
		<li>In Impostazione di input/outputselezionare il batch creato.</li>
		<li>Premere Processo per l'elaborazione delle immagini.</li>
		<li>Esportare le immagini come file .tiff.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per la quantificazione di foci nucleare, aprire CellProfiler.<ol>
<li>Aprire la γH2AX e la pipeline di quantificazione dei criteri di vendita (vedere Informazioni aggiuntive).</li>
		<li>Grafico dei dati utilizzando un software di tabella.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per l'analisi della co-localizzazione, aprire CellProfiler.<ol>
<li>Aprire la pipeline di colocalizzazione (vedere Informazioni aggiuntive). Un file di foglio di calcolo verrà creato e salvato nella posizione preferita. Tuttavia, i grafici stessi non verranno salvati automaticamente. Si suggerisce di scattare un'istantanea delle finestre da tenere per la registrazione dei risultati.</li>
		<li>Grafico dei dati utilizzando un software di tabella.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Betts, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNAs+CUPID1+and+CUPID2+mediate+breast+cancer+risk+at+11q13+by+modulating+the+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNAs CUPID1 and CUPID2 mediate breast cancer risk at 11q13 by modulating the response to DNA damage.</a> American Journal of Human Genetics. 101 (2), 255-266 (2017).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'analisi dei tempi e dell'efficienza della riparazione dei danni al DNA tramite microscopia si è dimostrata essenziale per capire come funziona il macchinario per la riparazione del DNA, nelle cellule normali e nelle patologie umane come il cancro.
Lo sviluppo di anticorpi specifici che consentono il rilevamento di proteine attivate nella loro versione fosforicolata (come γH2AX, pRPA, pRAD50 e altri10,,23,...

Le cellule umane sono costantemente esposte a una varietà di agenti dannosi per il DNA di varie origini. Le fonti esogene sono per lo più costituite da esposizione a radiazioni, sostanze chimiche (compresi agenti chemioterapici e alcuni antibiotici), e virus, mentre le principali fonti endogene includono errori nella replicazione del DNA e nello stress ossidativo. Gli effetti diretti dell'esposizione genotossica possono variare da una base modificata a una rottura del doppio filamento del DNA potenzialmente letale (DSB), a seconda dello stress e della dose di esposizione. In definitiva, danni al DNA non riparati o riparati in modo improprio possono portare all'accumulo di mutazioni, riarrangiamenti genomici, instabilità del genoma e alla fine portare alla carcinogenesi1. Le cellule dei mammiferi hanno sviluppato percorsi complessi per riconoscere specifici tipi di danni al DNA2,3 e ripararli in modo tempestivo, sincronizzati con la progressione del ciclo cellulare.
Le radiazioni ionizzanti (IR) danneggiano la doppia elica del DNA e creano rotture a doppio filamento (DSB), una delle forme più deleteri di danno al DNA. Il complesso MRN (MRE11, RAD50, NBS1) funziona come un sensore di DNA termina e attiva la proteina chinasi ataxia telangiectasia mutato (ATM)4,5. Dopo l'attivazione iniziale di ATM da fini dna, ATM innesca una cascata di eventi DDR sul sito della rottura, avviando con un evento chiave, la fosforilazione della variante istone H2AX6. La fosforilazione H2AX sui residui S139 la attiva in γH2AX, che si estende su regioni fino a megabase intorno alla lesione del DNA6,7,8,9. Questo evento aumenta l'accessibilità del DNA, portando al reclutamento e all'accumulo di altre proteine di riparazione del DNA7. Poiché γH2AX è abbondantemente e specificamente indotto DSBs circostanti, può essere facilmente visualizzata utilizzando anticorpi specifici, ed è comunemente usato come marcatore surrogato per DSB nel campo di riparazione del DNA. Una volta segnalata la rottura, le cellule attivano le loro vie di riparazione del DNA ed elaborano il danno al DNA. La proteina MDC1 (mediatore della proteina checkpoint del danno al DNA 1) lega direttamente γH2AX10,interagisce con ATM11 e anche con NBS112,,13. Contribuisce ad aumentare la concentrazione del complesso MRN presso il DSB e ad avviare un ciclo di feedback ATM positivo. γH2AX viene rapidamente rimosso una volta riparata la rottura, consentendo di conseguenza il monitoraggio dell'autorizzazione DSB. Seguita dalla microscopia, la diminuzione della γH2AX nel tempo fornisce una misurazione indiretta delle rotture residue e dell'efficienza di riparazione del DNA.
Le cellule eucariotiche possono riparare i DSB da diversi percorsi, mentre le due principali sono l'unione finale non omologa (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR) (Figura 1). NHEJ lega essenzialmente il DNA a doppio filamento termina senza l'uso di omologia estesa e opera per tutto il ciclocellulare 14,15. HR diventa predominante durante le fasi S e G2, ed è altrimenti represso, dal momento che richiede una sorella cromata come modello omologa per lariparazione 14,16. La scelta del percorso tra NHEJ e HR dipende non solo dalla vicinanza fisica della sorella cromatica, ma anche dall'estensione della resezione finale del DNA17, che inibisce NHEJ.
La riparazione DSB dipendente dall'omologia inizia con la degradazione nucleolitica del filamento 5' dalle estremità di rottura per generare code di DNA a 3' filamento singolo (ssDNA), un processo denominato resezione 5'-3'. Il complesso MRN avvia la resezione finale del DNA e l'ulteriore resezione viene elaborata in combinazione con BLM/EXO1 (Proteina sindrome di Bloom/esonucleasi 1) o BLM/DNA2 (replicazione del DNA Elicase/nucleasi dipendente da ATP)18,19,20,21,22. La resezione finale del DNA è potenziata dal CtIP (proteina che interagisce con il CtBP) attraverso la sua interazione diretta con il complesso MRN23 e il reclutamento di BRCA1 (proteina di suscettibilità al tipo 1 del cancro al seno)24,25. La proteina di replica A (RPA) si lega prontamente alla ssDNA esposta e viene quindi spostata dalla proteina ricombinata RAD51 per formare un filamento nucleoproteina che catalizza la ricerca omologa e l'invasionedel filamento 26,27,28.
L'avvio della resezione è un passo critico per la scelta del percorso di riparazione. Una volta avviata la resezione, le estremità del DNA diventano substrati poveri per la legazione da parte dell'eterodimero Ku70/Ku80 (componente del percorso NHEJ) e le cellule sono impegnate in HR17,29,30. L'eterodimero Ku70/Ku80 si lega alle estremità DSB, reclutando DNA-PKcs e p53 Binding Protein 1 (53BP1)29,30. 53BP1 agisce come una barriera alla resezione in G1, bloccando così le risorse umane durante la promozione di NHEJ31,32, ma viene rimosso in modo dipendente da BRCA1 nella fase S, consentendo di conseguenza la resezione33,34. Pertanto, 53BP1 e BRCA1 svolgono ruoli opposti nella riparazione DSB, con 53BP1 essendo un facilitatore NHEJ mentre BRCA1 agisce consentendo interruzioni per la riparazione attraverso HR.
In laboratorio, la formazione di DSB può essere indotta da radiazioni ionizzanti (IR). Mentre questo esempio utilizza una dose elevata di 4 Gy, 1 Gy e 2 Gy anche creare una quantità significativa di DSB, adatto per l'analisi della formazione di foci da proteine abbondanti. È importante notare che il tipo e la dose di radiazioni utilizzate possono portare a diverse lesioni nel DNA e nella cellula: mentre l'IR induce ISB, può anche causare rotture di singoli filamenti o modificazione della base (vedi35,36 per un riferimento sul trasferimento di energia lineare di irradiazione (LET) e sul tipo di danno al DNA). Per determinare la cinetica della formazione di foci ionizzanti indotta da radiazioni (IRIF) e la loro distanza, che indicano la riparazione del danno e l'inversione del DDRattivato 8,9,37,38, la formazione di foci può essere monitorata in diversi punti di tempo dopo la radiazione ionizzante. La tempistica di attivazione e di sgombero di tutte le principali proteine danno del DNAè nota 39, e molti sono studiati come marcatori surrogati di eventi chiave. Ad esempio, pRPA, che possiede un'elevata affinità per ssDNA viene utilizzato come surrogato della resezione di rottura, le proteine MRN (MRE11, RAD50, NBS1) e le esonucleasi possono essere utilizzate anche per valutare l'efficienza della resezione. Mentre RAD51, BRCA1, BRCA2 (proteina di suscettibilità al cancro al seno 2) e PALB2 (partner e localizzatore di BRCA2) possono essere monitorati per valutare l'efficienza delle risorse umane, la presenza delle proteine Ku o 53BP1, vengono utilizzati come marcatori di NHEJ(Figura 1).
Poiché le proteine del macchinario per la riparazione del DNA si reclutano a vicenda per la rottura e l'assemblaggio in super-complessi, le interazioni DNA-proteina e proteina-proteina possono essere dedotte seguendo la loro localizzazione individuale nel tempo e analizzando la co-localizzazione delle proteine, come viene visualizzazioneto da segnali sovrapposti nella cella40,41,42. Nelle linee cellulari, l'introduzione di mutazioni puntino o la cancellazione in specifici geni di riparazione del DNA sia attraverso l'editing del genoma, sia per sovraespressione di mutanti a base di plasmidi, consente di eseguire lo studio di residui specifici e del loro possibile ruolo nel riconoscimento del danno al DNA (ad esempio, la co-localizzazione con γH2AX) o di un assemblaggio complesso (co-localizzazione con un'altra o più proteine), nonché il loro impatto sulla riparazione del DNA. Qui, usiamo l'immunofluorescenza indiretta come mezzo per studiare la formazione e la risoluzione dei DSB seguendo γH2AX foci nel tempo. Presentiamo anche un esempio di formazione di foci e analisi di co-localizzazione da parte di un attore importante nella riparazione DSB: p53 Binding Protein 1 (53BP1)32. Come accennato in precedenza, 53BP1 è considerato centrale per la scelta del percorso di riparazione del DNA. Dopo l'accumulo di 53BP1 e la sua co-localizzazione con γH2AX fornisce preziose informazioni sulla fase del ciclo cellulare, l'accumulo di danni al DNA e il percorso utilizzato per riparare i DSB. Lo scopo dell'immunolocalizzazione indiretta è quello di valutare l'efficienza della riparazione dei danni al DNA nelle linee cellulari, seguendo IR come in questo studio, o dopo l'esposizione a varie sollecitazioni nelle cellule, dal collegamento incrociato del DNA al blocco della forchetta di replica (un elenco di agenti dannosi per il DNA è fornito nella tabella 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61447/61447fig1v2.jpg"> Figura 1: Vie di riparazione del doppio filamento del DNA (DSB). La riparazione DSB prevede due percorsi principali: la ricombinazione omologa (HR, a sinistra) e l'end-joining non omologho (NHEJ, a destra). Dopo la pausa, le proteine si attivano per contrassegnare la rottura (γH2AX), partecipare alla resezione finale (MRN), rivestire la ssDNA resected (pRPA), promuovere la ricombinazione (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) o limitare la resezione e promuovere NHEJ (53BP1). Altre proteine partecipano alla riparazione dei danni, ma le proteine elencate sono regolarmente seguite dall'immunofluorescenza indiretta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61447/61447fig1v2large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Agente dannoso del DNA</td>
			<td>Meccanismo d'azione</td>
			<td>Dose raccomandata</td>
		</tr>
<tr>
<td>γ/raggi X</td>
			<td>Radiazione Formazione di rotture a doppio filamento con alcuni effetti cellulari incontrollati</td>
			<td>1-4 Gy</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Il numero 36 del 36 Ar ioni</td>
			<td>Radiazione Formazione di rotture a doppio filamento</td>
			<td>270 keV/m</td>
		</tr>
<tr>
<td>particelle z</td>
			<td>Radiazione Formazione di rotture a doppio filamento</td>
			<td>116 keV/m</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bleomicina</td>
			<td>Inibitore della sintesi del DNA</td>
			<td>0,4-2 g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Camptothecin</td>
			<td>Inibitore della topoisomerasi I</td>
			<td>10-200 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cisplatino</td>
			<td>Agente di Alkylating (inducendo collegamenti incrociati intrastranti)</td>
			<td>0,25-2 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Doxorubicina</td>
			<td>Agente intercalante Inibitore della topoisomera II</td>
			<td>10-200 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Etoposide</td>
			<td>Inibitore della topoisomera II</td>
			<td>10 SM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hydroxyurea</td>
			<td>Inibitore della sintesi del DNA (per ribonucleotide reductase)</td>
			<td>10-200 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metano metilesulfonato</td>
			<td>Agente di Alkylating</td>
			<td>0,25-2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mitomicina C</td>
			<td>Agente di Alkylating</td>
			<td>0,25-2 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Luce ultravioletta (UV)</td>
			<td>Formazione di dimeri di timodina (generando distorsione della catena del DNA)</td>
			<td>50-100 mJ/cm2
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: agenti genotossici. Esempi di agenti dannosi per il DNA, il loro meccanismo d'azione e il danno indotto sulla base della concentrazione di lavoro suggerita.

<table><tbody><tr><td>Soluzione acquosa di paraformaldeide (PFA) al 16% (v/v)</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>15710</td><td>La qualità della microscopia del PFA garantisce le migliori immagini. Se si utilizza "PFA fatto in casa", filtrare prima dell'uso.</td></tr><tr>Si raccomanda <td>l'albumina sierica bovina</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>Frazione di shock termico, per evitare precipitazioni/fondo.</td></tr><tr><td>Coverglass #1, rotondo da 18 mm (vetrini)</td><td>Neuvitro</td><td>NC0308920</td><td>I vetrini coprioggetti devono essere puliti e sterilizzati prima dell'uso, con HCl o etanolo.</td></tr><tr><td>DMEM, Alto glucosio [(+) 4,5 g/L D-glucosio, (+) L-glutammina, (-) Piruvato di sodio]</td><td>Gibco</td><td>11965118</td><td>Adattare i terreni di coltura alle esigenze della linea cellulare utilizzata.</td></tr><tr><td>DPBS, senza calcio, senza magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>PBS per la coltura dei tessuti.</td></tr><tr><td>Glicole etilenico-bis(&beta;-amminoetiletere)-N,N,N&prime;,acido n&prime;-tetraacetico (EGTA)</td><td>Research Products International</td><td>E57060</td><td>Tampone di estrazione nucleare.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>104370028</td><td>La qualità dell'FBS può essere valutata testando la formazione di focolai di gH2AX. Se nel lotto sono presenti tracce di endotossina genotossica, gH2AX sarà positivo in assenza di stress.</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (MgCl2)Research</td> <td>Products International</td><td>M24000</td><td>Tampone di estrazione nucleare.</td></tr><tr><td>Piperazina-N,N&prime;-bis(acido 2-etansolfonico) (PIPES)</td><td>Research Products International</td><td>P40150</td><td>Tampone di estrazione nucleare.</td></tr><tr>Al suo posto è possibile utilizzare il <td>supporto SlowFade Diamond Antifade con DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>S36973</td><td>300 nM DAPI con mezzo di montaggio VECTASHIELD Antifade.</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Research Products International</td><td>S23020 Tampone</td><td>di estrazione nucleare.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Research Products International</td><td>S24060 Tampone</td><td>di estrazione nucleare.</td></tr><tr>In alternativa è possibile utilizzare <td>i vetrini per microscopio Superfrost Plus</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td> i <td>vetrini in polisina.</td></tr><tr><td>Piastre a pozzetti multipli trattate con TC, dimensione 12 pozzetti Costar</td><td></td><td>3513</td><td>La semina sui vetrini coprioggetti avviene in una piastra a 12 pozzetti.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AmericanBio</td><td>AB02025</td><td>Tampone di estrazione nucleare.</td></tr><tr>Al suo posto è possibile utilizzare <td>l'enzima TrypLE Express (1X), senza fenolo rosso</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td>tripsina-EDTA.</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,5%), senza Gibco rosso fenolo</td><td></td><td>15400054</td><td>TrypLE possono essere utilizzati.</td></tr></tbody></table>

visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del dna per immunofluorescenza

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Le cellule dei mammiferi sono costantemente esposte a sostanze chimiche, radiazioni e sotto-prodotti metabolici naturali, che creano tipi specifici di insulti al DNA. Gli agenti genotossici possono danneggiare la spina dorsale del DNA, romperla o modificare la natura chimica delle singole basi. In seguito all'insulto al DNA, vengono attivati percorsi di risposta al danno del DNA (DDR) e vengono reclutate proteine coinvolte nella riparazione. Una pletora di fattori sono coinvolti nel rilevamento del tipo di danno e nell'attivazione della risposta di riparazione appropriata. La mancata attivazione e reclutamento dei fattori DDR può portare all'instabilità genomica, che sta alla base di molte patologie umane, tra cui il cancro. Studi sulle proteine DDR possono fornire informazioni sulla risposta ai farmaci genotossici e sui meccanismi cellulari della resistenza ai farmaci.
Ci sono due modi principali per visualizzare le proteine in vivo:l'osservazione diretta, etichettando la proteina di interesse con una proteina fluorescente e seguendola mediante imaging dal vivo, o immunofluorescenza indiretta su campioni fissi. Mentre la visualizzazione delle proteine con tag fluorescenti consente un monitoraggio preciso nel tempo, l'etichettatura diretta in N- o C-terminus può interferire con la localizzazione o la funzione delle proteine. L'osservazione delle proteine nella loro versione non modificata ed endogena è preferita. Quando le proteine di riparazione del DNA vengono reclutate nell'insulto del DNA, la loro concentrazione aumenta localmente e formano gruppi, o "foci", che possono essere visualizzati dall'immunofluorescenza indiretta utilizzando anticorpi specifici.
Anche se il rilevamento di proteine foci non fornisce una prova definitiva di interazione diretta, la co-localizzazione delle proteine nelle cellule indica che si raggruppano al sito del danno e possono informare della sequenza degli eventi necessari per la formazione complessa. Un'attenta analisi della sovrapposizione spaziale dei foci nelle cellule che esprimono versioni di tipo selvaggio o mutante di una proteina può fornire preziosi indizi su domini funzionali importanti per la funzione di riparazione del DNA. Infine, la co-localizzazione delle proteine indica possibili interazioni dirette che possono essere verificate dalla co-immunoprecipizione nelle cellule o dal pulldown diretto utilizzando proteine purificate.

Il giorno 2, o 24 h dopo le cellule di semina su coverslips, le cellule hanno subito una divisione e sono 80% confluente. Specifici abbattimenti o mutazioni nelle proteine di riparazione del DNA possono aumentare il tempo di raddoppio, o sensibilizzare le cellule al trattamento genotossico, e la densità di semina e le dosi di trattamento devono essere regolate di conseguenza. Per determinare le migliori condizioni di lavoro, la tempistica della risposta al danno del DNA può essere stabilita dal gonfiore occidentale di γH...

In seguito al danno al DNA, le cellule umane attivano percorsi di riparazione essenziali per ripristinare l'integrità del loro genoma. Qui, descriviamo il metodo dell'immunofluorescenza indiretta come mezzo per rilevare le proteine di riparazione del DNA, analizzare il loro reclutamento spaziale e temporale e contribuire a interrogare l'interazione proteina-proteina nei siti di danno al DNA.

Visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del DNA per immunofluorescenza

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

L'immunofluorescenza indiretta consente di rilevare proteine di riparazione del DNA, foto di reclutamento spaziale e temporale e aiuta a interrogare le interazioni proteicheproteine nel sito di danni al DNA. A seguito del danno al DNA, le proteine di riparazione del DNA vengono reclutate nell'insulto del DNA mentre la loro concentrazione aumenta localmente, e formano gruppi chiamati focolai che possono essere visualizzati dall'immunofluorescenza indiretta su campioni fissi. Questa tecnica può essere utilizzata per rilevare i focolai proteici, nonché per quantificare la colocalizzazione del presente nelle cellule.Questo può aiutare a spiegare la sequenza di eventi necessari per la formazione complessa e per la riparazione del DNA. particolari interazioni con la proteinaproteina possono essere implicate da tali esperimenti. A dimostrare la procedura sarà Barbara De La Pena, una foto Postdoc di grande talento del mio laboratorio Begin coltivando 40.000 cellule HeLa in ogni piastra di pozzo ben oltre 12 con una coverlip di vetro rotonda di 18 millimetri all'80% di confluenza.Dopo aver esposto le cellule a quattro irradiazioni gamma grigie, lavarle due volte con un millilitro di PBS. Quindi rimuovere completamente il PBS e aggiungere 200 microlitri di NDB a ciascun pozzo. Incubare le cellule per due minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere l'NDB.Tieni presente che il tempo di incubazione può variare a seconda della linea cellulare, ma generalmente non deve superare i due minuti. Lavare le cellule con un millilitro di PBS. Quindi rimuovere completamente il PBS e aggiungere 200 microlitri del 4%PFA a ciascun pozzo per la fissazione delle celle.Incubare le cellule per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi rimuovere il PFA e aggiungere un millilitro di PBS ad ogni pozzo. Rimuovere completamente il PBS e quindi aggiungere 200 microlitri di soluzione di blocco a ciascun pozzo e incubare le cellule per due ore a temperatura ambiente o da 16 a 18 ore a quattro gradi Celsius.diluire l'anticorpo primario e il tampone di diluizione e vortice fino a quando ben miscelato in una scatola di umidità e qui un pezzo di parafilm e aggiungere 10 microlitri di anticorpo primario in una singola goccia. Allineare un bordo del coverslip dal pozzo con la goccia e abbassarlo lentamente sul parafilm che diffonde il liquido. incubare il coverslip per due ore a temperatura ambiente.Dopo l'incubazione lavare il coperchio scivola tre volte in PBS per un minuto per lavaggio. diluire l'anticorpo secondario e il tampone di diluizione e vortice fino a quando ben miscelato applicare 10 microlitri di anticorpo secondario su ogni coverlip come descritto in precedenza e incubarlo per due ore a temperatura ambiente protetta dalla luce. Lavare il coperchio scivola tre volte con PBS e una volta con acqua per un minuto per lavaggio.Quindi montarli su vetrini con un supporto di montaggio a base di glicerolo contenente coperchi di tenuta DAPI con smalto trasparente e lasciarli asciugare per 20 minuti. Posizionare una goccia di olio ad immersione sull'obiettivo 60 x e utilizzare DAPI per localizzare i nuclei attraverso l'oculare per l'acquisizione di immagini XYZ, aprire il software di acquisizione e impostare il tipo di scanner come galvano il tipo di scanner come andata e getta e 512 per 512 dimensioni dell'immagine. Nel pannello PMT impostare la modalità su MEDIA VBM su frame e scansione sequenziale su linea.Successivamente impostare i rilevatori di colorante e calore impostare il canale uno su DAPI e SD uno, il canale due su alexafluor 488 e HSD tre e il canale tre ad alexafluor a 647 e HSD quattro selezionare su per Z.To regolare l'immagine dal vivo, premere il pulsante live sulla finestra dal vivo e regolare la messa a fuoco. Quindi utilizzare la finestra degli strumenti PMT per impostare la sensibilità all'intensità del laser, il guadagno e l'offset per le pile z, selezionare start-to-end e 15 fette. Selezionare la cartella per salvare le immagini e premere il pulsante Start di LSM per iniziare ad acquisire.Al termine, premere il pulsante di fine serie per completare l'acquisizione dell'immagine. Aprire il software di analisi, quindi premere la finestra degli strumenti batch e selezionare le immagini da analizzare. Passare alla finestra degli strumenti di analisi e selezionare la proiezione, che mostrerà la proiezione di intensità massima da 15 fette.Nell'impostazione di output di input selezionare il batch e la cartella di output creati. Premere il processo per l'elaborazione delle immagini ed esportare le immagini come file TIFF. Eseguire la quantificazione nucleare con cellprofiler secondo le indicazioni manoscritte.Le cellule non trattate con la radiazione presentano pochissimi segni di esposizione gamma H2AX. In assenza di proteine essenziali di riparazione del DNA, l'accumulo di gamma H2AX può essere osservato durante le rotture del DNA. L'accumulo di rotture non ripaatrici può portare le cellule a diventare pre ipotoniche indicate dai nuclei gamma h2AX solidi.Dopo l'irradiazione, i nuclei presentano un gran numero di rotture a doppio filamento a cui la gamma H2AX si localizza estremamente rapidamente. Mentre in assenza di una radiazione si osservano pochi focolai in assenza di radiazioni, il numero di fuochi è stato quantificato in due quattro e 16 ore dopo una radiazione e per il controllo delle radiazioni NOA. A seconda della questione biologica sollevata e del tipo di dati richiesti, diverse opzioni di plottaggio dovrebbero essere considerate La colocalizzazione può essere studiata multiplexando gli anticorpi primari sollevati in diverse specie animali e utilizzando anticorpi secondari, etichettati con fluorofori distinti.Sovrapposizione di verde e rosso, dà origine a hotspot gialli, le due proteine di interesse sono presenti negli stessi pixel. L'analisi quantitativa della colocalizzazione può essere ottenuta con un approccio basato su oggetti o con un approccio statistico che esegue analisi basate sui coefficienti di correlazione di intensità. Una combinazione di anticorpi primari allevati in diverse specie animali, può essere utilizzata in questo protocollo.Assicurarsi che gli anticorpi siano compatibili e non interferiscano tra loro. È necessario impostare in modo appropriato l'anticorpo secondario da utilizzare rispetto a ciascuno degli anticorpi primari e considerare una particolare sovrapposizione spettrale quando si seleziona la minore forza da utilizzare. La colocalizzazione o le proteine indicano possibili interazioni dirette.Questo può essere verificato mediante precipitazione granulare nelle cellule o mediante put down diretto utilizzando proteine purificate in vitro.

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In questo video, descriviamo il metodo di immunofluorescenza per visualizzare la localizzazione delle proteine di riparazione del DNA γH2AX e 53BP1 nei siti di rotture del DNA a doppio filamento nei nuclei cellulari irradiati.

Visualizzazione basata sull'immunofluorescenza delle interazioni proteiche di riparazione del DNA

In questo video, descriviamo la tecnica di microscopia a immunofluorescenza per rilevare specifiche proteine di risposta al danno del DNA localizzate nei siti di rottura del doppio filamento di DNA nelle cellule mononucleate umane. Le proteine sono riconosciute da specifici anticorpi primari, che a loro volta si legano agli anticorpi secondari marcati con fluorofori che emettono fluorescenza durante la visualizzazione microscopica, consentendo la visualizzazione delle proteine come focolai...

Microscopia a immunofluorescenza per l'analisi delle rotture del DNA a doppio filamento

L'imaging spettroscopico elettronico può visualizzare e distinguere l'acido nucleico dalle proteine con una risoluzione nanometrica. Può essere combinato con il sistema miniSOG, che è in grado di marcare in modo specifico le proteine marcate in campioni di microscopia elettronica a trasmissione. Illustriamo l'uso di queste tecnologie utilizzando come esempio i fuochi di riparazione della rottura a doppio filamento.

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine ​​di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

Qui viene dimostrato come può essere utilizzato il test di Ligation Proximity (PLA) in situ per rilevare e visualizzare le interazioni proteiche-proteiche dirette tra ATM e p53 nelle colture di cellule di sospensione esposte a stress genotossico.

Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

Microirradiation laser è uno strumento utile per gli studi della riparazione del DNA in cellule viventi. È indicato un approccio metodologico per l'utilizzo del laser UVA per indurre varie lesioni del DNA. Abbiamo ottimizzato un metodo per microirradiation locale che mantiene il normale ciclo cellulare; quindi, cellule irradiate procedono attraverso mitosi.

Avanzate tecniche di microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-proteina e cinetica alle lesioni del DNA

Questo manoscritto fornisce un protocollo per l'analisi delle rotture del doppio filamento di DNA da microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1.

Microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 per analizzare la formazione e la riparazione di rotture a doppio filamento del DNA

Studiare la cinetica di riparazione danni del DNA richiede un sistema di indurre lesioni alle regioni definite sub-nucleare. Descriviamo un metodo per creare interruzioni di double-stranded localizzate utilizzando un microscopio confocale a scansione laser, dotato di un laser di 405 nm e forniscono procedure automatizzate per quantificare la dinamica di fattori di riparazione a queste lesioni.

Indagine di assunzione di proteine per lesioni del DNA utilizzando 405 Nm Laser Micro-irradiazione

Riparazione di rotture a doppio filamento del DNA è un processo dinamico, che richiede non solo la formazione di complessi di riparazione presso le pause, ma anche la loro risoluzione dopo che la lesione è indirizzata. Qui, usiamo il microscopia di immunofluorescenza per interruzioni di double-stranded transitorie e di lunga durata come strumento per sezionare questo meccanismo di mantenimento del genoma.

Che caratterizzano i processi di riparazione del DNA alle rotture del DNA transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza

La risposta al danno del DNA indotta dalle radiazioni attivata dal fascio misto di neutroni utilizzato nella terapia di cattura di neutroni boronica (BNCT) non è stata completamente stabilita. Questo protocollo fornisce una procedura graduale per rilevare i foci indotti da radiazioni (RIF) delle proteine di riparazione mediante colorazione immunofluorescenza nelle linee cellulari del cancro del colon umano dopo l'irradiazione con il fascio di neutroni misto.

Immunofluorescenza Immagini di danno al DNA e riparazione Foci nelle cellule tumorali del colon umano

Il presente protocollo descrive i metodi per valutare le proteine di riparazione del danno al DNA negli organoidi di cancro ovarico derivati da pazienti. Qui sono inclusi metodi completi di placcatura e colorazione, nonché procedure di quantificazione dettagliate e oggettive.

Visualizzazione delle proteine di riparazione del danno al DNA negli organoidi del cancro ovarico derivati dal paziente tramite saggi di immunofluorescenza

Il seguente protocollo presenta la rilevazione di focolai di DNA a singolo filamento nella fase G1 del ciclo cellulare utilizzando la sincronizzazione del ciclo cellulare seguita dalla colorazione immunofluorescente RPA2.

Visualizzazione dei focolai di DNA a singolo filamento nella fase G1 del ciclo cellulare

Scopri l'immunofluorescenza indiretta per studiare le interazioni tra proteine di riparazione del DNA nelle cellule HeLa. Questo metodo permette di visualizzare il reclutamento temporale e la formazione di foci proteici.

Visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del DNA per immunofluorescenza

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