Name: Cultura e dosaggio delle popolazioni di caenorhabditis elegans a grande scala (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Impara a coltivare grandi popolazioni di Caenorhabditis elegans su piastre LSCP per ricerche omiche. Questo metodo consente analisi comparative con manipolazione minima e documentazione affidabile della crescita.

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Ringraziamo i membri dell'Edison Lab per le utili discussioni e feedback su questo manoscritto; in particolare, B.M. Garcia. Alcuni ceppi sono stati forniti dal CGC, che è finanziato da NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), e CeNDR, che è finanziato da NSF Living Collections CSBR 1930382. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del NIH (U2CES030167).

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<li>Jeong, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+structure+and+biological+activity+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer-inducing+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone.</a> Nature. 433 (7025), 541-545 (2005).</li>
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<li>Kaplan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascaroside+Expression+in+Caenorhabditis+elegans+Is+Strongly+Dependent+on+Diet+and+Developmental+Stage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ascaroside Expression in Caenorhabditis elegans Is Strongly Dependent on Diet and Developmental Stage.</a> PLoS One. 6 (3), 17804(2011).</li>
<li>Golden, J., Riddle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218 (4572), 578-580 (1982).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Una varietà di navi può essere utilizzata come LSCP. In questo protocollo è stata utilizzata una teglia standard in vetro. Gli LSPC in uso avevano dimensioni esterne di 35,56 x 20,32 cm, dimensioni interne di 27,94 x 17,78 cm e circa 4,45 cm di profondità e erano dotati di un coperchio montato. Pertanto, la quantità di batteri qui utilizzati è stata ottimizzata per un LSCP con le dimensioni di cui sopra per produrre una grande popolazione di vermi a stadio misto. Il volume e la concentrazione batterica possono essere regolati per soddisfare le esigenze sperimentali.
La contaminazione da muffe, funghi o altre fonti batteriche può verificarsi in qualsiasi fase del metodo LSCP, quindi maneggiare i campioni con cura. Prima di iniziare qualsiasi fase del protocollo, assicurarsi che lo spazio di lavoro sia pulito con il 70% di etanolo e il 10% di candeggina. Se disponibile, trattare le aree usate con luce UV per 30 minuti e accendere un filtro dell'aria HEPA 30 minuti prima di iniziare ogni passaggio.
Facendo crescere l'LSCP in un ambiente controllato ( cioè , in una sala CT impostata a 20 °C),l'utentepuò monitorare più facilmente la crescita del campione e documentare la potenziale contaminazione. Se la superficie della LSCP viene contaminata, tagliare la contaminazione quando possibile e lasciare che il campione continui a crescere o scartare il campione se la contaminazione non è possibile controllare. È imperativo affrontare rapidamente la contaminazione per ridurre la crescita indesiderata e garantire che non superi i vermi per le risorse.
Questo metodo è pensato per coloro che vogliono coltivare culture di popolazione mista su larga scala di C. elegans. Sebbene sia possibile coltivare popolazioni sincronizzate di vermi sull'LSCP come fatto su piastre petri disponibili in commercio e in coltura liquida, gli autori non hanno testato questa opzione. Inoltre, se gli utenti desiderano coltivare in media più di 2,4 milioni di worm in un determinato campione, si consiglia un metodo diverso4. Il successo della crescita dipende dalla tensione in fase di elaborazione nella pipeline. Gli autori sono stati in grado di far crescere con successo popolazioni di circa 2,4 milioni di vermi in almeno cinque repliche biologiche di 15 ceppi di Elegans C. , indicando che il metodo è robusto.
Prima di iniziare l'esperimento si noti che l'età e la salute di un dato verme possono influenzare la fecondità e il conseguente tempo di crescita della popolazione. Assicurarsi che i worm siano mantenuti in condizioni di salute con uno stress minimo prima di essere utilizzati in questa pipeline. Si presume che campioni di stock siano stati creati, congelati e conservati a -80 °C per ridurre la deriva genetica nel tempo.
A seconda delle esigenze di un dato esperimento, il numero di adulti gravidi in partenza su un LSCP può essere modificato. La modifica del numero di adulti gravidi in partenza sulla LSCP cambierà il tasso di crescita e quindi il tempo di raccolta. Cinque adulti gravidi sono usati per seminare ogni LSCP per i seguenti motivi: (1) Era necessario un modo semplice, veloce ed efficiente per seminare molti ceppi di C. elegans sui LSCP contemporaneamente e (2) per ridurre le differenze di età tra gli adulti gravidi raccolti che potrebbero portare all'eterogeneità della crescita.
Questo metodo consente all'utente di raccogliere grandi popolazioni di vermi con tutte le fasi del ciclo di vita presenti. Con i metodi attuali disponibili, la raccolta di campioni su larga scala di C. elegans richiede la sincronizzazione della candeggina per ottenere il numero di worm desiderati per il lavoro a valle. Dato questo approccio, ora si può coltivare il maggior numero possibile di vermi in fermentatori o colture liquide su larga scala senza le difficoltà associate alla sincronizzazione della candeggina e a più passaggi di movimentazione. Il nostro protocollo consente di indirizzare i ceppi di interesse in modo efficiente, utilizzare un tempo di gestione minimo per far crescere il campione stesso e isolare le fasi dei worm o della popolazione in base alle esigenze nelle pipeline downstream.
Un LPFC è stato utilizzato come strumento per documentare la distribuzione e le dimensioni della popolazione in un dato LSCP. L'LPFC utilizzato è un sistema a flusso continuo che analizza, ordina e distribuisce i worm in base alle loro dimensioni (TOF) e alla densità ottica. Quando un dato worm passa attraverso la cella di flusso, il rilevatore di perdita di luce assiale cattura la quantità di luce del segnale bloccata da un laser a stato solido da 488 nm per il periodo di tempo necessario a passare un verme, dando all'utente il TOF e la densità ottica del worm. Le ottiche e i rivelatori di raccolta della fluorescenza possono anche essere utilizzati per massimizzare la sensibilità e la raccolta della fluorescenza su ciascun campione. I parametri di raccolta LPFC variano in base allo strumento. Gli utenti possono utilizzare una varietà di piattaforme per acquisire le dimensioni del worm e non si limitano all'utilizzo di questo protocollo se un LPFC non è disponibile.
Gli autori stanno usando campioni coltivati nel metodo qui descritto per identificare metaboliti sconosciuti in vari ceppi di C. elegans tramite cromatografia liquida - spettrometria di massa, spettroscopia NMR e sequenziamento dell'RNA. Gli autori prevedono di continuare a utilizzare questo metodo per la crescita di campioni in questa pipeline con una varietà di ceppi C. elegans in quanto nuovi ceppi di interesse possono essere facilmente elaborati utilizzando questa pipeline.

C. elegans è un piccolo nematode libero che si trova in tutto il mondo in una varietà di habitat naturali1. La sua relativa facilità di crescita, il tempo di generazione rapida, il sistema di riproduzione e il corpo trasparente lo rendono un potente organismo modello che è stato ampiamente studiato in biologia dello sviluppo, invecchiamento, neurobiologia e genetica2,3. Il copioso lavoro su C. elegans lo rende un candidato principale da utilizzare negli studi in omica per collegare in modo completo i fenotipi con componenti biologici complessi e le loro relazioni in un dato organismo.
Per utilizzare C. elegans nella ricerca collaborativa sull'omica, è necessario un metodo per generare grandi popolazioni miste di animali in cui un singolo campione può essere suddiviso e utilizzato su piattaforme e strumenti diversi per analisi comparative. La creazione di una pipeline per generare un campione di questo tipo richiede una forte consapevolezza della dieta, dell'ambiente, dello stress, della struttura della popolazione e della gestione e raccolta dei campioni. Pertanto, è fondamentale integrare le condizioni di coltivazione standard e riproducibili nelle tubazioni su larga scala. Nella ricerca C. elegans, due metodi tradizionali sono utilizzati per la coltura dei vermi: piatti di Agar Petri e coltura liquida4.
Storicamente, quando sono necessarie grandi quantità di C. elegans, vengono coltivate in coltura liquida4. I passaggi coinvolti nella generazione di una grande popolazione di vermi nella coltura liquida richiedono più passaggi di manipolazione che spesso includono la sincronizzazione della candeggina con cuticole gravide gravide per adulti, rilasciando embrioni per raggiungere la dimensione della popolazione desiderata. Tuttavia, quando si utilizza la sincronizzazione della candeggina, la crescita della popolazione dipende dall'inizio delle dimensioni del censimento e, pertanto, ha effetti sulla crescita successiva e sul numero di abitanti. Inoltre, i ceppi di C. elegans variano nella sensibilità della cuticola, nel tempo di esposizione e nella risposta allo stress alla sincronizzazione della candeggina, rendendo difficile il dosaggio di molti ceppi allavolta 5,6,7,8,9.
Inoltre, la crescita dei vermi nella coltura liquida richiede un paio di passaggi di trasferimento in quanto spesso si consiglia di coltivare solo una generazione di vermi prima della raccolta perché il sovraffollamento può facilmente verificarsi se coltivato per più generazioni e portare alla formazione di dauer nonostante la presenza dicibo 10. La formazione di Dauer avviene attraverso piccole molecole di segnalazione come gli ascarosides, spesso indicati come "feromoni dauer"11,12,13,14, vengono rilasciati in mezzi liquidi ed effetto la crescita della popolazione. Inoltre, la crescita di grandi popolazioni di vermi in coltura liquida porta all'accumulo eccessivo di batteri nella coltura, creando difficoltà quando è necessario un campione pulito per i test fenotipiche a valle. Infine, quando una coltura liquida viene contaminata, è più difficile da mantenere poiché le spore fungine o le cellule batteriche sono facilmente disperse in tutto il supporto15.
L'altro metodo tradizionale di coltivazione di C. elegans è sui piatti agar Petri. Le piastre Petri disponibili in commercio consentono di coltivare facilmente più generazioni di vermi a stadio misto senza i rapidi effetti del sovraffollamento e dell'elevata formazione di dauer come si vede nelle colture liquide. Tuttavia, uno svantaggio per la crescita dei vermi sulle tradizionali piastre di Agar Petri è che la più grande piastra di Petri disponibile in commercio non produce grandi popolazioni di vermi per uno studio di -omica senza aggiungere in una fase di sincronizzazione della candeggina. In sintesi, coltivare popolazioni a fasi miste di C. elegans su piatti agar Petri è più adatto per raccogliere dati -omics, ma abbiamo richiesto un metodo per generare popolazioni molto grandi senza cultoe liquida.
Qui presentiamo un metodo per la cultura e raccogliamo grandi popolazioni di C. elegans a fase mista su lastre di coltura su larga scala (LSCP). La raccolta di campioni attraverso questa pipeline produce abbastanza campioni per raccogliere dati fenotipici e di popolazione, insieme a tutti i dati necessari per gli esperimenti di -omica(ad esempio,genomica, trascrittomica, proteomica e metabolomica). Inoltre, il metodo LSCP richiede una manipolazione minima degli animali, meno tempo di preparazione dell'utente, fornisce uno stretto controllo ambientale e garantisce che la manipolazione di ciascun campione sia coerente durante tutto lo studio per la riproducibilità complessiva.

<table><tbody><tr><td>Pipette serologiche sterili da 10 mL</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Punte da 10 ul.</td><td>VWR</td><td>89079-438</td><td></td></tr><tr><td>Punte da 100 ul per pipette</td><td>VWR</td><td>89079-442</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro graduato da 1000 mL</td><td>VWR</td><td>10124-380</td><td></td></tr><tr><td>Punte da 1000 ul per pipette</td><td>VWR</td><td>89079-488</td><td></td></tr><tr><td>Tubi conici da 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo a 190 gradi</td><td>VWR</td><td>89125-166</td><td></td></tr><tr><td>Fiaschetta Erlenmeyer da 2 L</td><td>VWR</td><td>75804-654</td><td></td></tr><tr><td>Tubi conici da 50 mL</td><td>VWR</td><td>75874-294</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>05040-100G</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di aspirazione del fluido G a controllo BVC</td><td>Vacuubrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>Sigma</td><td>C3045-25G</td><td></td></tr><tr><td>Candeggina Clorox</td><td>VWR</td><td>89414-502</td><td></td></tr><tr><td>Sala di controllo della temperatura del Conviron</td><td>Conviron</td><td></td><td>https://www.conviron.com/environmental-rooms</td></tr><tr><td>Corning Low Volume 384 Well Nero con micropiastra trasparente a fondo piatto in polistirolo trattato TC</td><td>VWR</td><td>89089-866</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Accuspin 3R</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra a fondo piatto a 24 pozzi</td><td>VWR</td><td>29443-952</td><td></td></tr><tr><td>Purificatore Honeywell True HEPA 465 sq ft.</td><td>Ferramenta</td><td>204390560</td><td></td></tr><tr><td>HT115 E. coli (DE3)</td><td>CGC</td><td>HT115(DE3)</td><td>https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3)</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR</td><td>470224-038</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Coltura su larga scala (LSCP)</td><td>Pyrex</td><td>1090948</td><td>Teglia da forno in vetro Pyrex da 2 quarti con coperchio rosso</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Sigma</td><td>C86677-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR</td><td>97062-998</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini semplici per microscopio</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>Filtro milliporo</td><td>Millipore</td><td>1.11727.2500</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivi Molecolari ImageXpress</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>Numero modello: IXMConfocal</td><td>https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , gli autori hanno utilizzato MetaXpress Software Versione 6.5.4.532</td></tr><tr><td>Nisstatina (10mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>N6261-25MU</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Sigma</td><td>P7750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri (6 cm)</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Controller</td><td>VWR</td><td>613-4180</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>VWR</td><td>0781-500G</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di potassio</td><td>Fisher</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere Rosse Fluroscenti</td><td>Poliscienze</td><td>19507-5</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>746398-500G</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Fisher</td><td>111357</td><td></td></tr><tr><td>Dibase fosfato di sodio anidro</td><td>Fisher</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Standard Gilson Pipette Set</td><td>Gilson</td><td>FA10002M, FA10004M, FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Streptomicina (100mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>Union Biometrica COPAS BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>https://www.unionbio.com/biosorter/ , gli autori utilizzavano: Flow Pilot versione 1.6.1.3.</td></tr></tbody></table>

cultura e dosaggio delle popolazioni di caenorhabditis elegans a grande scala

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) è stato e rimane un prezioso organismo modello per studiare biologia dello sviluppo, invecchiamento, neurobiologia e genetica. L'ampio corpus di lavori su C. elegans lo rende un candidato ideale per integrarsi negli studi su animali interi a grande popolazione per sezionare le componenti biologiche complesse e le loro relazioni con un altro organismo. Per utilizzare i C. elegans nella ricerca collaborativa sull'economia, è necessario un metodo per generare grandi popolazioni di animali in cui un singolo campione può essere suddiviso e analizzato su diverse piattaforme per analisi comparative.
Qui viene presentato un metodo per la coltura e raccogliere un'abbondante popolazione di Elegans a fase mista C. su una piastra di coltura su larga scala (LSCP) e i successivi dati fenotipici. Questa pipeline produce un numero sufficiente di animali per raccogliere dati fenotipici e di popolazione, insieme a tutti i dati necessari per gli esperimenti di -omica (ad esempio, genomica, trascrittomica, proteomica e metabolomica). Inoltre, il metodo LSCP richiede una manipolazione minima per gli animali stessi, meno tempo di preparazione dell'utente, fornisce uno stretto controllo ambientale e garantisce che la manipolazione di ciascun campione sia coerente durante tutto lo studio per la riproducibilità complessiva. Infine, vengono presentati i metodi per documentare le dimensioni della popolazione e la distribuzione della popolazione delle fasi di vita di C. elegans in un dato LSCP.

La crescita di C. elegans utilizzando il metodo LSCP produce in media circa 2,4 milioni di vermi a stadio misto per campione nell'corso di 12,2 giorni. La crescita di C. elegans con il metodo LSCP consente agli utenti di generare grandi popolazioni a stadio misto di C. elegans con poca manipolazione e manipolazione degli animali, ideale per studi di economia su larga scala ( Figura1). Una volta che un LSCP è diventato pieno di vermi adulti, ha raggiunto una grande dimensione della popolazione e ha meno batteri minimi, gli utenti possono raccogliere e stimare le dimensioni della popolazione. Questo punto può anche servire da controllo di qualità valutando se la popolazione è sufficiente da utilizzare in una pipeline -omica (Figura 2). Le dinamiche della popolazione dipendono dal ceppo stesso,dal comportamento del ceppo (cioè, i ceppi scavatori tendevano ad avere un minore recupero deivermi) e dal successodella crescita (cioè, contaminazione). Il metodo LSCP è stato testato su 15 ceppi di C. elegans contenenti una miscela di mutanti del Caenorhabditis Genetics Center (CGC) e cendr (Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource)25. I genotipi di ceppo sono descritti nella tabella complementare 3.
Il metodo LSCP ha prodotto dimensioni della popolazione da circa 94.500 a 9.290.000. La dimensione media della popolazione all'interno del ceppo di riferimento, PD1074, e tra i ceppi era di circa 2,4 milioni di vermi (Figura 3). Non sono state riscontrate differenze significative nelle dimensioni stimate della popolazione tra i ceppi di C. elegans nel corso di una media di 12,2 giorni di crescita LSCP(figura 4). I PD1074 LSCP hanno impiegato tra i 10 e i 14 giorni per crescere fino a raggiungere una popolazione a fasi miste. Il tempo medio di crescita nel PD1074 è stato di 10 giorni. La tensione in crescita più lenta è cresciuta per un massimo di 20 giorni e la varietà in più rapida crescita è cresciuta per un minimo di 10 giorni(figura 4).
Pertanto, utilizzando questo metodo LSCP, gli utenti possono facilmente integrare nuovi ceppi di interesse in uno studio con poca conoscenza dei tempi di sviluppo e delle competenze di base. Si noti che i ceppi e i fenotipi che devono essere mantenuti mediante prelievo, hanno difetti di fecondità, sono eterozigoti o hanno difetti di crescita potrebbero non funzionare bene in questa pipeline.
La citometria a flusso di particelle di grandi dimensioni e l'imaging di campioni consentono agli utenti di documentare la distribuzione della popolazione. Un'ampia varietà di piattaforme può essere utilizzata per misurare la crescita demografica di successo.
Per le misurazioni riproducibili dell'omica, è importante coltivare colture coerenti. Le metriche della riproducibilità delle impostazioni cultura sono il numero di worm e una distribuzione delle dimensioni coerente per un determinato ceppo. Mostriamo la distribuzione del campione per il ceppo di riferimento, PD1074 – una variante del ceppo originale N2 Bristol, utilizzando le immagini al microscopio lPFC23,26 e micro confocale come proxy per il successo della crescita. Poiché i vermi sono stati misurati dallo stadio L1 fino all'adulto gravid sulla distribuzione LPFC (Figura 5), nell'imaging successivo (Figura 6) e nella variazione della distribuzione della popolazione tra i campioni (Figura 7), possiamo vedere che questa pipeline ha generato una popolazione a fase mista di C. elegans.
Per dare un'occhiata più da vicino alla distribuzione della popolazione dei nostri campioni a fase mista, abbiamo esaminato la distribuzione di 35 LSCP PD1074 osservando la percentuale di vermi che rientrano in ogni regione durante l'intera distribuzione del tempo di volo (TOF)(cioè, lunghezzacorporea)(Figura 7A,B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica della pipeline di crescita worm LSCP. (A) Una volta ricevuti in laboratorio, tutti i ceppi sono stati preparati e congelati per la conservazione a lungo termine a -80 °C2. (B) Una piastra "master chunk" è stata preparata da un maga di verme congelato e conservata a 15 °C per essere utilizzata per non più di un mese. (C) Ogni campione ha subito quattro fasi successive di chunking per ridurre lo stress generazionale prima di crescere sulla LSCP. (D) 5 singoli adulti gravidi sono stati prelevati dalla piastra "chunk 4" 6 cm nella fase (D) e sbiancati in cinque aree dell'LSCP. (E) L'LSCP è stato collocato in una stanza a temperatura controllata e coltivato a 20 °C fino a quando l'LSCP non era pieno di vermi adulti, ha raggiunto una grande dimensione della popolazione e ha lasciato batteri minimi. (F) La popolazione di vermi è stata raccolta e raccolta per le fasi a valle. (G) Le aliquote sono state create dall'LSCP e sono state congelate per le applicazioni desiderate a valle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig02.jpg"> Figura 2: Panoramica della raccolta e della stima delle dimensioni della popolazione da parte della LSCP. (A) 50 mL di M9 sono stati utilizzati per lavare i vermi dalla superficie NGMA. La sospensione del verme è stata pipettata in un tubo conico da 50 ml. Il passaggio (A) è stato ripetuto due volte. (B)15 ml di sospensione del verme sono stati versati in un nuovo tubo conico da 15 ml. I vermi venivano pellettizzazione centrifugando. M9 + detriti sono stati aspirati senza disturbare il pellet di verme. Il passo (B) è stato ripetuto fino a quando non sono stati raccolti tutti i 150 mL di sospensione del verme. (C) Il pellet di verme è stato lavato e centrifugato tre volte con M9 per eliminare i detriti rimanenti. Una volta pulito il campione, il pellet di verme è stato rimorsinato in 10 mL di ddH2O. (D) È stata creata una diluizione seriale del campione per stimare le dimensioni della popolazione di vermi. Sono stati utilizzati i fattori di diluizione che consentivano di contare accuratamente i vermi. I fattori di diluizione utilizzati sono cambiati a seconda delle dimensioni della popolazione dell'LSCP. (E) Una volta scelti i fattori di diluizione, tutti i vermi di tutte e tre le repliche aliquote di tale diluizione sono stati pipettati su uno scivolo pulito e i vermi sono stati conteggiati al microscopio di sezionazione. (F) Il campione è stato suddiviso in aliquote di dimensioni appropriate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig03.jpg"> Figura 3: Il metodo LSCP ha generato in media una popolazione di 2,4 milioni di worm a stadio misto. L'LSCP produce dimensioni della popolazione nella popolazione più piccola che si è in crescita a circa 94.500 e con la più grande crescita della popolazione a circa 9.290.000. La dimensione media della popolazione in tutti i ceppi era di 2,4 milioni di vermi. Le barre sotto i nomi dei ceppo C. elegans indicano se un ceppo è un mutante CGC o un isolato naturale CeNDR. Per ogni ceppo viene visualizzata la dimensione del campione LSCP. Sono stati eseguiti confronti per tutte le coppie che utilizzano il test HSD di Tukey. Non sono state osservate differenze significative tra le dimensioni stimate della popolazione tra i ceppi di C. elegans (F(14.108) = 0,7, p = 0,77). Le barre colorate indicano i display a colori standard per la rispettiva rappresentazione dello sforzo C. elegans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig04.jpg"> Figura 4: Il metodo LSCP ha generato grandi popolazioni miste di worm in 10-20 giorni. Un dato C. elegans LSCP crebbe fino a quando il campione era pieno di vermi adulti, raggiunse una grande dimensione della popolazione e aveva un prato batterico minimo rimasto. Gli LSCP hanno impiegato tra i 10 e i 20 giorni per crescere fino a raggiungere una popolazione a fasi miste, a seconda del ceppo. Il tempo medio di crescita tra i ceppi è stato di 12,2 giorni. Per ogni ceppo viene visualizzata la dimensione del campione LSCP. Ogni barra di errore è stata costruita utilizzando 1 deviazione standard dalla media. I livelli non collegati dalla stessa lettera sono significativamente diversi. Confronti per tutte le coppie che utilizzano il test HSD di Tukey. Una differenza significativa è stata riscontrata nella quantità di tempo di crescita sull'LSCP necessaria tra i ceppi di C. elegans (F(14.108) = 8,8, p < 0,0001*). Le barre colorate indicano i display a colori standard per la rispettiva rappresentazione dello sforzo C. elegans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2.jpg"> Figura 5: Misurazione mista della popolazione e della crescita del ceppo di riferimento di tipo selvatico, PD1074. Una distribuzione rappresentativa LPFC di una crescita LSCP del ceppo di riferimento di tipo selvaggio, una variante del ceppo originale N2 Bristol (PD1074) documenta la distribuzione delle dimensioni e il conteggio degli eventi di una popolazione a fase mista. L'asse x visualizza la lunghezza (Tempo di volo, TOF) dei worm ordinati. L'asse y mostra la densità ottica (estinzione ottica, EXT) dei vermi ordinati. Ogni punto dati è un worm documentato nell'esempio. Ogni area TOF utilizzata per l'analisi delle immagini viene visualizzata in un colore diverso. Sono state create venti regioni TOF (R2 – R21) che vanno da un TOF di 50 al 2050. I dettagli su ciascuna regione tof sono disponibili nella tabella complementare 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig06.jpg"> Figura 6: Le immagini dei worm ordinati dalle regioni TOF che vanno da R2 a R12 mostrano la distribuzione LPFC PD1074. Nella regione R2, i vermi L1 possono essere identificati e nella regione R9 vengono identificati adulti prevalentemente gravidi, che coprono i due estremi larvali dello sviluppo dandoci regioni approssimative all'interno della distribuzione citometrica del flusso di dove sono previsti stadi nella distribuzione. La barra di scala rappresenta 1 mm. Le immagini rappresentative sono state prese dalla distribuzione LPFC visualizzata nella figura 5e le caselle colorate corrispondono alle regioni della figura 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig07.jpg"> Figura 7: Distribuzione della popolazione attraverso le regioni del tempo di volo (TOF) nel ceppo di riferimento di tipo selvaggio, PD1074. Distribuzione dei worm nell'intera regione TOF che mostra le regioni in cui sono stati trovati i worm. Ogni PD1074 LSCP è rappresentato come un singolo colore. (A) L'asse x mostra le venti regioni TOF (R2 – R21) osservate e conteggiate per l'LSCP, che visualizzano l'intera distribuzione delle dimensioni. L'asse y mostra la percentuale di worm di un dato LSCP con una dimensione corporea che è caduta in una data regione TOF. (B) Poiché una frazione minore della popolazione di vermi si trova tra le regioni R7-R21, il registro della percentuale di vermi che rientrava in ciascuna regione è stato preso per visualizzare la distribuzione della popolazione. Nell'asse x vengono visualizzate le regioni TOF R7-R21. L'asse y visualizza il registro della percentuale di worm di un determinato LSCP con una dimensione corporea che è caduta in una determinata regione TOF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura complementare 1: Temperatura media giornaliera (°C) delle condizioni di crescita in cui l'LSCP è stato coltivato e gestito. Le temperature riportate della stanza a temperatura controllata (CT) sono state documentate e raccolte durante l'arco di sei mesi di crescita e raccolta del campione. La temperatura media giornaliera è riportata qui. Non sono state osservate differenze significative tra la temperatura in cui l'LCSP è cresciuto durante la durata del progetto (F(5,24) = 2,59, p = 0,0524). L'intera differenza di temperatura si è estendeta non superiore a 0,003 °C per tutta la durata di sei mesi della crescita e della generazione del campione. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453supfig01.jpg" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa cifra.</a>
Tabella complementare 1: Regioni gated TOF utilizzate per ordinare i vermi in piastre da 384 pozza per l'imaging. Le aree binned sono state create per coprire un TOF di 100 in tutta la distribuzione TOF dal 50 al 2050. Le regioni recintate possono essere modificate e ottimizzate in base alle proprie esigenze. Ogni area TOF utilizzata per l'analisi delle immagini viene visualizzata in un colore diverso. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table1_FINAL.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella supplementare 2: modello di piastra a 384 pozzi di regioni TOF e layout di replica. Ogni campione è stato ordinato in una piastra da 384 po', per l'imaging. Sono state create quattro repliche per ogni area selezionata per l'ordinamento. Le regioni recintate possono essere modificate e ottimizzate in base alle proprie esigenze. Cfr. tabella complementare 1 per specifiche regioni recinta create e utilizzate in questo protocollo. Ogni area TOF utilizzata per l'analisi delle immagini viene visualizzata in un colore diverso. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table2_FINAL.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella complementare 3: I ceppi di C. elegans utilizzati in questo protocollo contengono una miscela di ceppi di CGC e CeNDR. La tensione, il genotipo, la sorgente di deformazione e i dettagli sono descritti in questa tabella. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table3_FINAL.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

Per utilizzare Caenorhabditis elegans (C. elegans) nella ricerca omica, è necessario un metodo per generare grandi popolazioni di vermi in cui un singolo campione può essere misurato su piattaforme per analisi comparative. Qui viene presentato un metodo per la cultura delle popolazioni C. elegans su tavole di coltura su larga scala (LSCPs) e per documentare la crescita della popolazione.

Cultura e dosaggio delle popolazioni di caenorhabditis elegans a grande scala

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Questa tecnica ci consente di raccogliere popolazioni di worm su larga scala da utilizzare per più piattaforme omiche con manipolazione minima. Questa tecnica ci permette di raccogliere popolazioni di C.elegans a fase mista attraverso più esperimenti omici per ottenere un quadro olistico di ogni campione. Per individuare lo sbiancamento degli adulti gravidi su lastre di coltura su larga scala, fiammare un verme raccogliere su un bruciatore Bunsen e utilizzare il piccone per raccogliere E.coli fresco dal bordo del prato batterico su una piastra di coltura su larga scala.Scegli un singolo adulto gravid dalla quarta piastra del pezzo per lo sbiancamento spot e aggiungi cinque microlitri di soluzione di ipoclorito alcalino appena preparata in un angolo della piastra di coltura su larga scala lontano dal prato E.coli. Posizionare l'adulto gravide nella soluzione alcalina di ipoclorito e toccare il nematode per interrompere la cuticola e rilasciare le uova. Quando un totale di cinque adulti sono stati posizionati uniformemente intorno al prato E.coli nello stesso modo, riposizionare il coperchio sul piatto.Per raccogliere campioni da piastre di coltura su larga scala, versare 50 millilitri di soluzione M9 su una superficie di lamiera di coltura su larga scala e ruotare la piastra per assicurarsi che l'M9 copra l'intera superficie di agarosio medio di crescita del nematode. Innescare una pipetta sierologica sterile con M9 e inclinare la piastra in modo che la popolazione di M9 e vermi si riunisca in un angolo della piastra. Utilizzare la pipetta innescata per aspirare la sospensione del verme e aggiungere i vermi a un tubo conico da 50 millilitri.Posizionare il tubo su un rocker per interrompere eventuali ciuffi batterici e detriti. Quando tutti i vermi sono stati raccolti da tutte e tre le piastre, trasferire 15 millilitri di vermi da ogni tubo in ciascuno dei tre tubi conici da 15 millilitri e sedimentare i vermi nei tubi mediante centrifugazione. Aspirare con cura i supernatanti senza disturbare i pellet di verme e aggiungere 13 millilitri di sospensione del verme ad ogni tubo.Invertire i tubi per rimorsi i pellet e lavare via il maggior quantità possibile di batteri e detriti e centrifugare nuovamente i vermi. Quando ogni intera popolazione di vermi è stata raccolta, lavare il pellet di verme tre volte in 10 millilitri di soluzione M9 fresca per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, rimorsi di ogni pellet di verme pulito in 10 millilitri di acqua distillata doppia.Per la stima delle dimensioni della popolazione, diluire rapidamente tre aliquote di 100 microlitri di campione di verme da ciascun tubo in 900 microlitri di soluzione M9 per campione e utilizzare le aliquote per effettuare diluizioni seriali. Posizionare le sospensioni del campione di verme stock su un rocker per il movimento continuo delle colture mentre le aliquote vengono conteggiate e mescolare le diluizioni del verme fino a quando non sono omogenee. Aggiungere cinque microlitri di soluzione dal primo al campione di 10 worm a uno scivolo al microscopio di vetro e contare i vermi per microscopia leggera.Se nel campione sono presente meno di 50 worm, contare le diluizioni 1:100 e 1:1.000. Se sono disponibili più di 50 worm, passare alla successiva diluizione seriale. Dopo aver contato ogni replica aliquota di ogni diluizione tre volte, la media conta la diluizione per determinare la dimensione stimata della popolazione del verme.Quindi dividere i campioni di verme nelle aliquote sperimentali appropriate e congelare i campioni in azoto liquido per meno 80 gradi Celsius. Per preparare un campione di verme per la citometria a flusso di particelle di grandi dimensioni, diluire un'aliquota del verme a stadio misto circa cinque volte 10 a un volume finale di 10 millilitri di soluzione M9 e aggiungere 200 microlitri di un milligrammo per millilitro E.coli e 1:50 diluizione della soluzione di micromolar rosso fluorescente micromolarmente alla sospensione del verme. Dopo un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente con dondolo, raccogliere i vermi e le microsfere mediante centrifugazione e lavare i vermi due volte con una fresca soluzione M9 per rimuovere eventuali batteri in eccesso e microsfere non internalizzate.Dopo il secondo lavaggio, rimorsi il pellet in cinque millilitri di soluzione M9. Se il pellet sembra pulito, aggiungere cinque millilitri di M9 integrati con azide di sodio da 50 millimolare ai vermi e posizionare il tubo su un rocker per raddrizzare ed eutanasiare i vermi per un conteggio e un dimensionamento accurati. Per la documentazione sulla distribuzione della popolazione, aprire il modello di piastra calibrato a 384 pozzi e impostare il modello in modo da distribuire 20 oggetti recintato in quattro pozzi per ottenere quattro repliche tecniche di ogni regione recintata per ciascuna delle 20 regioni bar del campione.Caricare un campione di vermi da 40 millilitri sul citometro a flusso di particelle di grandi dimensioni e iniziare a ordinare automaticamente il campione mescolando continuamente il campione per evitare di depositare e erogare contemporaneamente oggetti dal campione nella piastra calibrata a 384 pozzetti. Una volta che l'intero campione è stato ordinato e il numero massimo di regioni recintato è stato erogato nella piastra da 384 pozzi, rimuovere il campione dal citometro e pulire lo strumento. Il metodo della piastra di coltura su larga scala è stato testato su 15 ceppi di C.Elegans, tra cui una miscela di mutanti del Caenorhabditis Genetics Center e ceppi selvatici di Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource.In questa analisi, il metodo della piastra di coltura su larga scala ha prodotto dimensioni della popolazione da circa 94.500 a 9.290.000. La dimensione media della popolazione all'interno del ceppo di riferimento PD1074 e tra i ceppi era di circa 2,4 milioni di vermi. Non sono state riscontrate differenze significative nelle dimensioni stimate della popolazione tra i ceppi di C.elegans nel corso di una media di 12,2 giorni di crescita su larga scala.Le piastre di coltura su larga scala PD1074 hanno impiegato tra i 10 e i 14 giorni per crescere fino a raggiungere una popolazione a fasi miste con un tempo di crescita medio di 12,2 giorni. La tensione in crescita più lenta è cresciuta per un massimo di 20 giorni e la varietà in più rapida crescita è cresciuta per un minimo di 10 giorni. In questa distribuzione del campione per PD1074, i vermi sono stati misurati dallo stadio L1 attraverso adulti gravidi su un grande citometro a flusso di particelle.Successive immagini e visualizzazioni delle variazioni nella distribuzione della popolazione tra i campioni hanno rivelato che la pipeline ha generato una popolazione mista di C.elegans. È importante contare accuratamente i worm durante la raccolta di campioni in modo da ottenere dati comparabili tra le crescita e gli studi. Questo approccio di raccolta può essere applicato al sequenziamento dell'RNA, alla genomica e ad altre analisi omiche per espandere la nostra comprensione delle complicate dinamiche che si verificano all'interno delle popolazioni C.elegans.Questa tecnica ci consente di raccogliere popolazioni miste di C.elegans in più esperimenti omici per ottenere un quadro olistico di ogni campione.

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