Un approccio di dissociazione a singola cellula per l'analisi molecolare della vescica urinaria nel topo dopo la lesione del midollo spinale

Questo protocollo è significativo perché utilizza informazioni biologiche per facilitare la generazione di una sospensione a singola cellula con un'elevata vitalità cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di generare sospensioni a singola cellula che mantengono un'elevata vitalità cellulare e un'appropriata rappresentazione dei tipi di cellule isolate. A dimostrare la procedura chirurgica sarà Hussein Atta, un collega del mio laboratorio.

A dimostrare la procedura di dissociazione tissutale sarà Ali Hashemi e l'analisi FACS, Yaser Heshmati. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale in un topo adulto anestetizzato, palpare il processo spinoso più prominente nella colonna vertebrale toracica. Analgesia e antibiotici vengono somministrati prima dell'intervento chirurgico.

Rasare un rettangolo longitudinale sul retro del mouse dalla parte inferiore del collo fino a poco sotto il processo spinoso più prominente e un centimetro su ciascun lato della linea mediana. Disinfettare la pelle esposta tre volte con salviette sequenziali al 10% di iodio povidone e salviette al 70% di etanolo in modo circolare partendo dal sito di incisione e procedendo verso l'esterno. Dopo l'ultima passata, copri il topo con un pezzo di spugna di garza sterile da quattro pollici per quattro pollici con una finestra sul campo chirurgico.

Per indurre la lesione del midollo spinale, praticare prima un'incisione di 1,5 centimetri al centro della schiena e utilizzare una dissezione affilata e smussata per separare i muscoli dai processi spinosi e le lamine delle vertebre T9, T10 e T11. Usa le forbici sottili per dividere nettamente i legamenti interspinosi tra T9 e T10 e T10 e T11 prima di eseguire una laminectomia bilaterale del processo spinoso T10. Quando le lamine sono state completamente asportate, utilizzare le forbici per sezionare il midollo spinale.

Per tagliare completamente le colonne laterali, spazzare delicatamente la punta delle forbici fini su entrambi i lati. Utilizzare un'applicazione di punta di cotone sterile per comprimere il sanguinamento. Dopo aver raggiunto l'omeostasi, chiudere la pelle con suture continue 7-0 polyglactin910 e somministrare per via sottocutanea un millilitro di soluzione salina per prevenire la disidratazione postoperatoria, quindi riportare l'animale in una gabbia fresca con monitoraggio fino alla completa decubito.

Ogni 12 ore, tenendo l'animale con una mano e massaggiando il basso addome con l'altra, utilizzare l'indice e il pollice per localizzare e comprimere delicatamente la vescica urinaria distesa per stimolare l'espressione manuale della vescica fino a quando l'animale non è in grado di urinare da solo. Per l'analisi a valle dei tipi di cellule vescicali di interesse, al momento sperimentale appropriato e una volta che l'animale è stato adeguatamente anestetizzato, eseguire una laparotomia della linea mediana dal bacino al diaframma e tagliare il diaframma lontano dalle costole. Seguendo il bordo della cartilagine ossea parallelo allo sterno, aprire il torace lungo le costole su entrambi i lati dell'animale partendo dal diaframma e procedendo fino alla prima costola.

Dopo aver fissato la parete toracica anteriore sopra la testa dell'animale, utilizzare delle forbici sottili per tagliare via il pericardio e collegare un ago calibro 23 all'apparato di perfusione. Inserire l'ago nel ventricolo sinistro e far avanzare lentamente l'ago nell'aorta senza perforare il tessuto. Quando l'ago è in posizione, inizia a infondere il tessuto con PBS a una portata di 15 millilitri al minuto e usa le punte di un paio di forbici sottili per fare rapidamente un piccolo taglio nell'atrio destro.

Quando il drenaggio è limpido e si può osservare un colore del fegato schiarito, fermare la perfusione e liberare la vescica dai peduncoli vascolari e dall'uretra, quindi posizionare la vescica in una provetta da microcentrifuga contenente la soluzione di Tyrode ghiacciata. Per preparare una sospensione a singola cellula, quando tutte le vesciche sono state raccolte, strappare una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 100 microlitri di soluzione di Tyrode. Dopo la pesatura, tritare le vesciche in una capsula di Petri da 10 centimetri contenente 100 microlitri di soluzione di Tyrode e utilizzare una punta di pipetta a foro largo per trasferire i frammenti di tessuto in 2,5 millilitri di tampone di digestione per vescica.

Incubare il tessuto per 40 minuti a 37 gradi Celsius su un miscelatore Nutator e utilizzare una pipetta da cinque millilitri per triturare il campione per un minuto prima di raccogliere le cellule e i tessuti dissociati mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in un millilitro di soluzione di distacco cellulare e posizionare le cellule sul miscelatore Nutator per altri 10 minuti. Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule con un'altra centrifugazione e risospendere il pellet in un millilitro di tampone di lisi dei globuli rossi.

Dopo un minuto, interrompere la lisi con l'aggiunta di nove millilitri di PBS e filtrare le cellule attraverso un colino da 70 micrometri in una provetta da 50 millilitri, quindi centrifugare nuovamente le cellule e risospendere il pellet in 200 microlitri di tampone colorante integrato con blocco FC. Dopo un'incubazione di 10 minuti su ghiaccio, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet nel volume appropriato di miscela master di anticorpi coniugati fluorofori per 20 minuti su ghiaccio al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con un millilitro di tampone di colorazione cellulare e risospendere il pellet in 100 microlitri di tampone di colorazione cellulare fresco integrato con cinque microlitri di ANNESSINA V FITC e un microlitro di ioduro di propidio.

Dopo 15 minuti a temperatura ambiente, aggiungere 400 microlitri di tampone legante l'annessina alle cellule e mescolare per inversione. Per analizzare le cellule mediante citometria a flusso, utilizzare prima un campione di cellule non colorato per impostare i parametri di dispersione laterale e anteriore delle cellule, quindi misurare l'emissione di fluorescenza a 530 nanometri e superiore a 575 nanometri per escludere le cellule morte. Utilizzare le griglie su ogni punto blot per definire la popolazione negativa nel primo decadimento e utilizzare i controlli di fluorescenza meno uno per correggere la sovrapposizione spettrale fino a quando i mezzi di popolazione negativi e positivi non sono allineati.

Quindi misura 100.000 eventi delle cellule con i marcatori specifici di interesse, creando cancelli per le popolazioni cellulari di interesse, se necessario. Quando tutti i campioni sono stati analizzati, analizzare i dati utilizzando il software di analisi citofluorimetrica appropriato. Il collagene 1A1, il collagene 3A1, il collagene 1A2 e il collagene 6A1 sono i tipi di collagene più abbondanti che si trovano all'interno della vescica del topo.

L'analisi per determinare i livelli di espressione dell'mRNA dei collageni uno, tre, sei e acido ialuronico rivela che l'espressione di questi componenti della matrice extracellulare è più prevalente nelle popolazioni di cellule mesenchimali che nell'urotelio. L'analisi citofluorimetrica indica che diversi protocolli di digestione enzimatica producono popolazioni cellulari altamente vitali e il terzo protocollo di digestione utilizzato in questa analisi è risultato il più efficace nella conservazione cellulare. Utilizzando questo metodo, è possibile ottenere un aumento significativo del numero totale di cellule isolate dalla vescica di topi con lesione del midollo spinale per confrontarlo con le vesciche di controllo.

Rispetto ai controlli, anche le vesciche degli animali con lesione del midollo spinale mostrano un aumento significativo delle cellule CD45 positive. Il passaggio 7.1 è importante per l'identificazione nella popolazione cardiaca. La strategia di gating dovrebbe essere informata dalle celle di interesse.

Le vesciche degli animali con lesione midollare hanno una popolazione cellulare distinta. Questo protocollo può essere utilizzato per la selezione cellulare, la coltura cellulare primaria, il sequenziamento di singole cellule e altre procedure a valle di molecole e cellule che richiedono singole cellule vitali. Questo protocollo fornisce un'elevata vitalità e quindi una bassa perdita di popolazione cellulare, che è un punto chiave per le tecniche di analisi di singole cellule come il sequenziamento dell'RNA di una singola cellula.