Name: Analisi del metabolismo delle cellule dellassassino naturale umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Scopri come misurare glicolisi e respirazione mitocondriale nelle cellule NK umane primarie con analizzatore di flusso extracellulare. Questo metodo automatizzato consente screening ad alto rendimento per studi immunologici e clinici.

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Gli autori ringraziano il Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) per il sostegno e la discussione. Questo studio è stato sostenuto dai programmi di ricerca intramurali del National Institutes of Health, National Cancer Institute e National Heart, Lung, and Blood Institute. JT è supportato dal programma Ramon y Cajal (grant RYC2018-026050-I) di MICINN (Spagna).

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

In questo articolo, abbiamo stabilito un protocollo per isolare e cultire in modo efficiente le cellule NK umane primarie pure e vitali dal sangue periferico. Abbiamo anche ottimizzato le condizioni per la misurazione dell'attività metabolica di queste cellule NK valutate dal tasso di consumo di ossigeno e dal tasso di acidificazione extracellulare utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Rispetto ad altri metodi respirometrici, l'analizzatore di flusso extracellulare è veloce, richiede un numero ridotto di ...

Le cellule Natural Killer (NK) sono linfociti innati che mediano risposte anti-tumorali e anti-virali. Le cellule NK comprendono il 5-15% di tutti i linfociti nel sangue periferico umano e possono essere trovate anche nella milza, nel fegato, nel midollo osseo e nei linfonodi. Le cellule NK non esprimono recettori polimorfici clonotipici, come i recettori delle cellule T (TCR) o i recettori delle cellule B (BCR). Al contrario, l'attivazione delle loro funzioni citolitiche è stimolata dall'impegno di recettori che riconoscono liganti invariabili sulla superficie di una cella bersaglio1,2.
Le cellule NK umane a riposo isolate dal sangue periferico possono sopravvivere per diversi giorni in una coltura media integrata con siero umano. L'attivazione delle cellule NK da parte di citochine come IL-15 o IL-2 spinge le cellule alla proliferazione e ad un aumento della loro capacità diuccidere, tragli altri effetti 3,4,5. Diversi studi hanno dimostrato una correlazione diretta tra l'attivazione delle cellule NK e i cambiamenti nella loro attivitàmetabolica 6. Questi cambiamenti metabolici sono destinati a soddisfare i particolari requisiti delle cellule in termini di energia e biosintesi.
Le cellule e gli organismi aerobici ottengono energia attraverso una serie di reazioni chimiche che coinvolgono il catabolismo e l'ossidazione di carboidrati, grassi e proteine. Attraverso una combinazione di glicolisi, ciclo di acido tricarboxylico (TCA) e fosforilazione ossidativa, le cellule eucariotiche soddisfano la maggior parte della loro domanda ATP e ottengono gli intermedi necessari come elementi costitutivi per le macromolecole essenziali per la crescita e la proliferazione delle cellule. Il processo di glicolysis (Figura 1A) inizia con l'immissione di glucosio nella cella. Nel citosol, il glucosio viene fosforiato e trasformato in piruvato (con una produzione netta di 2 molecole di ATP per molecola di glucosio), che può essere ridotto a lattato o trasportato nei mitocondri per essere trasformato in Acetil-CoA ed entrare nel ciclo TCA. Il ciclo TCA continua a pedalare alimentato con più molecole di Acetil-CoA e produce CO2 (che alla fine si diffonderà al di fuori della cellula e, reagendo con H2O nel mezzo, genererà acido carbonico che porterà all'acidificazione del mezzo) e NADH, la molecola incaricata di donare elettroni alla catena di trasporto elettronico (ETC). Gli elettroni viaggiano attraverso diversi complessi proteici e sono finalmente accettati dall'ossigeno. Questi complessi (I, III e IV) pompano anche H- dalla matrice mitocondriale nello spazio intermembrana. Come conseguenza del gradiente elettrochimico generato,l'H - entreranno di nuovo nella matrice attraverso il complesso V (ATP-synthase), investendo l'energia potenziale accumulata nella generazione di ATP.
Sia la glicolysis che la respirazione mitocondriale possono essere bloccate in punti diversi utilizzando inibitori. La conoscenza e l'uso di questi inibitori è stata la base per lo sviluppo del flusso extracellulare. Misurando due semplici parametri in tempo reale come il pH e l'ossigeno, l'analizzatore di flusso extracellulare deduce il tasso di glicolysi e respirazione mitocondriale in una piastra a 96 ben. Il test di stress della glicolysi viene eseguito in un mezzo basale senza glucosio (Figura 1B)7. Le prime misurazioni del tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) sono indicative dell'acidificazione indipendente dalla glicosisi. Si riferisce come acidificazione non glicolicotica e correla con CO2 prodotto dal TCA che, come spiegato in precedenza, si combina con H2O nel mezzo pergenerare H (ECAR collegato alla TCA). La prima iniezione è glucosio per indurre l'utilizzo del glucosio e aumentare la glicolysis. La seconda iniezione combina sia rotenone, un inibitore I complesso, e antimicina A, un inibitore Complex III insieme, per bloccare l'ETC. Le cellule rispondono a questa drammatica diminuzione della produzione di ATP mitocondriale attivando la glicolysis per mantenere i livelli di ATP cellulare, e questo rappresenta la quantità di glicolisi che non viene utilizzata dalla cellula nello stato basale, ma potrebbe essere potenzialmente reclutata in risposta agli aumenti della domanda di ATP (compensatore). La terza iniezione è il glucosio analogico 2-Deoxyglucose (DG), che compete con il glucosio come substrato per l'esochinasi enzimatica. Il prodotto di questa fosforilazione, 2-deossiglucosio-6-fosfato non può essere trasformato in piruvato, e quindi la glicolysis è bloccata, che abbassa l'ECAR al suo minimo. L'ECAR misurato a questo punto comprende altre fonti di acidificazione extracellulare che non sono attribuite alla glicoolisi o all'attività respiratoria, nonché qualsiasi glicolisi residua non completamente inibita da 2-DG (post 2-DG-acidificazione).
Il test di stress mitocondriale viene eseguito in un mezzo con glucosio (Figura 1C) 8. Le prime misurazioni del tasso di consumo di ossigeno (OCR) corrispondono alla linea di base della respirazione mitocondriale (respirazione basale). La prima iniezione è l'oligomicina, che inibisce il ritorno dei protoni attraverso la sintesi ATP (V complesso), bloccando la sintesi ATP e quindi iperpolarizzare rapidamente la membrana mitocondriale, che impedisce un ulteriore pompaggio di protoni attraverso complessi respiratori e porta ad una diminuzione dell'OCR. Il confronto tra la respirazione di base e il valore dato dall'aggiunta di oligomicina rappresenta la respirazione collegata all'ATP. Il rimanente tasso di consumo di ossigeno insensibile all'oligomicina è chiamato perdita di protoni, che rappresenta il flusso di protoni attraverso il bistrato lipidico o le proteine nella membrana mitocondriale interna come il translocase adenina nucleotide9. La seconda iniezione è il disaccoppiatore 2,4-dinitrophenol (DNP), un ionoforo che induce un ingresso massiccio di H- nella matrice mitocondriale, che porta alla depolarizzazione della membrana mitocondriale e interruzione della sintesi ATP mitocondriale. Le cellule rispondono alla dissipazione della forza protone-motivo aumentando il tasso di trasporto di elettroni e consumo di ossigeno ai livelli massimi nel tentativo inutile di recuperare il potenziale della membrana (capacità respiratoria massima). La differenza tra la capacità respiratoria massima e la respirazione basale è la capacità respiratoria di riserva della cellula, che rappresenta la quantità di respirazione che non viene utilizzata dalla cellula per generare ATP nello stato basale, ma potrebbe essere potenzialmente reclutata in risposta all'aumento della domanda di ATP o in condizioni di stress8. La terza iniezione è una combinazione di rotenone e antimicina A. Questa iniezione ferma completamente l'ETC e l'OCR diminuisce al suo livello più basso, con il consumo rimanente di ossigeno non mitocondriale (causato da NADPH-oxidasi, ecc.).
I cambiamenti nelle vie metaboliche potrebbero in qualche modo prevedere il funzionamento delle cellule NK, in quanto è stato suggerito che l'attivazione continua delle cellule NK con citochine in vitro potrebbe portare all'esaurimento delle cellule NK dallo studio di diverse vie metaboliche10,11. La correlazione tra lo stato metabolico delle cellule NK e la funzione è molto importante dal punto di vista dell'immunoterapia del cancro. In questo campo, l'attivazione di cellule NK con infusione di IL-15, da solo o in combinazione con anticorpi terapeutici monoclonali sono stati testati al fine di migliorare l'uccisione delle cellule tumorali12,13,14. La conoscenza dello stato metabolico delle cellule NK in risposta a queste strategie di trattamento fornirebbe un valido predittore dello stato di attivazione delle cellule NK e della funzione di uccisione.
Lo studio delle vie metaboliche in altre cellule mieloidi e linfoidi come monociti, cellule T e B è statodescritto 15 e sono stati pubblicati metodi ottimizzati16. In questo protocollo forniamo un metodo che combina sia un protocollo di isolamento NK che produce un numero elevato di cellule NK pure e vitali sia un protocollo ottimizzato per misurare l'attività metabolica utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Qui mostriamo che questo è un metodo valido per lo studio dei cambiamenti metabolici nel riposo e IL-15 attivato cellule NK umane. Per il test del flusso extracellulare, sono stati testati e ottimizzati parametri come il numero di cellule e le concentrazioni di farmaci. Rispetto ad altri metodi respirometrici, l'analizzatore di flusso extracellulare è completamente automatizzato e in grado di testare in tempo reale, con quantità molto basse di cellule, fino a 92 campioni contemporaneamente, e quindi consente screening ad alta velocità effettiva (con più campioni e repliche) in modo relativamente rapido17.
Questo metodo può essere utilizzato da ricercatori interessati a valutare la funzione cellulare NK studiando il metabolismo delle cellule NK. Potrebbe essere applicato anche alle cellule attivate da altre citochine, anticorpi o stimoli solubili.

<table><tbody><tr><td>2-Deossi-D-glucosio (2-DG)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D8375-5G</td><td>Glicolisi stress test iniettore</td></tr><tr><td>composto 2,4-Dinotrofenolo (2,4-DNP)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D198501</td><td>ETC disaccoppiatore / mitocondriale stress test iniettore composto</td></tr><tr><td>96 pozzetti Piastra per colture cellulari / Fondo rotondo con coperchio</td><td>Costar</td><td>3799</td><td>NK coltura cellulare</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>MilliporeSigma</td><td>A8674</td><td>Complesso III inibitore / glicolisi e test da sforzo mitocondriale composto iniettore</td></tr><tr><td>BD FACSDIVA Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Acquisizione dati di flusso</td></tr><tr><td>BD LSR Fortessa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Acquisizione dati di flusso</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Adesivo cellulare</td></tr><tr><td>CyQUANT saggio di proliferazione cellulare</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C7026</td><td>Saggio di proliferazione cellulare per la quantificazione del DNA. Contiene tampone per lisi cellulare e colorante CyQUANT GR</td></tr><tr><td>EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II</td><td>Tecnologie Stemcell</td><td>17851</td><td>Isolamento di cellule NK da PBMC</td></tr><tr><td>Kit di arricchimento di cellule NK umane EasySep Tecnologie</td><td>Stemcell</td><td>19055</td><td>Isolamento di cellule NK da PBMC</td></tr><tr><td>Tecnologie EasySep Magnet</td><td>Stemcell</td><td>18001</td><td>Isolamento di cellule NK da PBMC</td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M, pH 8</td><td>Qualità Biologico</td><td>10128-446</td><td>NK vendere</td></tr><tr><td>tampone di separazione Provette FACS</td><td>Falcon-Fisher Scientific</td><td>352235</td><td>Esperimento di citometria a flusso</td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Provette coniche</td><td>Falcon-Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>NK Separazione cellulare</td>Siero</tr><tr><td>fetale di vitello (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td>NK tampone di separazione cellulare</td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Analisi dei dati di flusso</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8270</td><td>Componente del mezzo di prova da sforzo mitocondriale. Composto iniettore per test da sforzo di glicolisi</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>78429</td><td>Inibitore della proteasi 100X. Utilizzare nel tampone di lisi RIPA</td></tr><tr><td>Stimolazione cellulare NK</td><td>umana</td><td>Peprotech</td><td>200-15-50ug</td></tr><tr><td>Siero umano (HS)</td><td>Valley Biomedical</td><td>9C0539</td><td>Integratore di terreno per colture cellulari</td></tr><tr><td>NK IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td>cellule NK terreno di coltura</td></tr><tr><td>L-Glutammina (200 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-081</td><td>Componente del terreno per test da sforzo</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit di colorazione per cellule morte Aqua fissabile</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34965</td><td>Colorante di vitalità per la colorazione con citometria a flusso</td></tr><tr><td>LSM</td><td>mpbio</td><td>50494X</td><td>Separazione di PBMC dal sangue umano</td></tr><tr><td>Topo anti-umano CD3 BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563725</td><td>Colorazione con citometria a flusso con cellule T</td></tr><tr><td>Topo anti-umano CD56 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>555516</td><td>NK colorazione con citometria a flusso</td></tr><tr><td>Topo anti-umano NKp46 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>557991</td><td>NK colorazione con citometria a flusso</td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>MilliporeSigma</td><td>75351</td><td>Complesso V inibitore / test da sforzo mitocondriale composto iniettore</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>Cellula NK tampone di separazione</td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td>Per la determinazione della concentrazione proteica</td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td>Lisi cellulare</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>MilliporeSigma</td><td>R8875</td><td>Inibitore del complesso II / glicolisi e composto iniettore per test da sforzo mitocondriale</td></tr><tr><td>Seahorse Software di controllo</td><td>Agilent</td><td></td><td>Controller per l'analizzatore Seahorse XFe96</td></tr><tr><td>Seahorse Wave Desktop Software</td><td>Agilent</td><td></td><td>Per l'analisi dei dati</td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Medium</td><td>Agilent</td><td>102353-100</td><td>Base di saggio del flusso extracellulare Medium</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>Analizzatore di flusso extracellulare</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100</td><td>Include 20 piastre per colture cellulari XF96, 18 cartucce per sensori XFe96, guide di caricamento per il trasferimento dei composti nella cartuccia del saggio e 1 flacone di soluzione calibrante (500 ml).</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>MilliporeSigma</td><td>S5761</td><td>Per preparare la soluzione Cell-Tak</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-070</td><td>Componente del terreno per test da sforzo mitocondriale</td></tr></tbody></table>

analisi del metabolismo delle cellule dell'assassino naturale umano

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

Le cellule natural killer (NK) mediano principalmente risposte immunitarie anti-tumorali e anti-virali innate e rispondono a una varietà di citochine e altri stimoli per promuovere la sopravvivenza, la proliferazione cellulare, la produzione di citochine come i programmi di interferone gamma (IFNγ) e/o citotossicità. L'attivazione delle cellule NK mediante stimolazione della citochina richiede un sostanziale ristrutturazione delle vie metaboliche per supportare i loro requisiti bioenergetici e biosintetici. C'è un grande corpo di prove che suggerisce che il metabolismo delle cellule NK alterato è associato a una serie di malattie croniche tra cui l'obesità e il cancro, che evidenzia l'importanza clinica della disponibilità di un metodo per determinare il metabolismo delle cellule NK. Qui descriviamo l'uso di un analizzatore di flusso extracellulare, una piattaforma che consente misurazioni in tempo reale del consumo di glicolisi e ossigeno mitocondriale, come strumento per monitorare i cambiamenti nel metabolismo energetico delle cellule NK umane. Il metodo qui descritto consente anche il monitoraggio dei cambiamenti metabolici dopo la stimolazione delle cellule NK con citochine come IL-15, un sistema attualmente in fase di studio in una vasta gamma di studi clinici.

L'isolamento delle cellule NK dal sangue periferico fornisce una popolazione pura e vitale
L'analisi extracellulare del flusso si basa sulla misurazionedella concentrazione di H e O2 nel pozzo e non distingue tra le diverse popolazioni di cellule o la loro vitalità. Per questo motivo, ottenere una popolazione altamente pura e vitale della cellula di interesse è stato il passo chiave per avere successo in questi esperimenti.
L'i...

In questo articolo, descriviamo un metodo per misurare la glicolysi e la respirazione mitocondriale nelle cellule dell'assassino naturale umano primario (NK) isolate dal sangue periferico, a riposo o dopo l'attivazione indotta da IL15. Il protocollo descritto potrebbe essere facilmente esteso alle cellule NK umane primarie attivate da altre citochine o stimoli solubili.

Analisi del metabolismo delle cellule dell'assassino naturale umano

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

Questo metodo consente la determinazione del metabolismo delle cellule killer naturali. Un parametro chiave nell'attivazione misurando il consumo di ossigeno e le variazioni di pH nel mezzo extracellulare. Il vantaggio dell'analizzatore di flusso extracellulare è che è completamente automatizzato e in grado di testare fino a 92 campioni in tempo reale con basse quantità di cellule.Consentendo così schermi ad alta velocità effettiva. Un metodo valido per determinare la glicolisi e la respirazione nelle cellule inchio cimiche è molto importante in clinica. Poiché ci sono molte malattie tra cui l'obesità e il cancro in cui il metabolismo delle cellule ralchi è compromesso.Inizia con pipettare 20 millilitri di mezzo di separazione dei linfociti in un tubo conico da 50 millilitri. Mantenendo il tubo ad un angolo di 30 gradi, pipettare delicatamente 20 millilitri di sangue sul mezzo. Creazione di un'interfaccia visibile e ben definita tra i due fluidi.Centrifugare i tubi per 25 minuti a 1000 volte G.Quindi eserti con cura i tubi dalla centrifuga e metterli in un rack. Verificare la presenza di uno strato cospicuo di cellule all'interfaccia tra LSM e plasma. Aspirare delicatamente lo strato di cella mononucleare con una pipetta di plastica da 10 millilitri e posizionarlo in un nuovo tubo conico da 50 millilitri.Lavare le cellule mononucleari due volte con 45 millilitri di PBS. E centrifugarli a 800 volte G per cinque minuti. Per isolare le cellule killer naturali o gli engavi, contare i mari PVM e rimescolarli nel buffer di separazione NK a una volta da 10 a ottava celle per millilitro.Quindi trasferire 10 millilitri della sospensione cellulare in un nuovo tubo da 50 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di miscela di anticorpi di isolamento cellulare NK. E 10 microlitri di anticorpi di isolamento positivi anti CD si mescolano ai PBBC.E incubarli a temperatura ambiente per 10 minuti. Perline magnetiche a vortice e aggiungere un millilitro ai PBBC e agli anticorpi. Quindi incubare il MIGS per 10 minuti a temperatura ambiente con agitazione occasionale.Aggiungere 35 millilitri di tampone di isolamento NK e posizionare il tubo sul magnete per 15 minuti. Raccogliere con cura il supernatante con una pipetta di plastica da 50 millilitri senza toccare i lati o il fondo del tubo. Contare le cellule e centrifugarle a 800 volte G per cinque minuti.Per stimolare le cellule NK con corridoio solubile 15, rimostrare 750.000 cellule in 100 microlitri di IMDM contenenti il 10%HS in un pozzo di una piastra di 96 polacche. Diluire il corridoio umano da 15 a un microgrammo per millilitro nell'IMDM e il 10%HS. E aggiungere 100 microlitri del corridoio umano diluito 15 alle cellule.Riparare un campione di controllo con celle non stimolate e posizionare entrambi i campioni nell'incubatore a 37 gradi Celsius. Stimolare le cellule per 48 ore, quindi eseguire il test del flusso extracellulare. Il giorno prima dell'esperimento, accendere l'analizzatore e lasciarlo riscaldare fino a 37 gradi Celsius.Aprire il pacchetto della cartuccia di censura e separare la cartuccia dalla piastra di utilità. Quindi aggiungere 200 microlitri della soluzione di calibrant ad ogni pozzo della piastra di utilità. E rimettere la cartuccia centrale per assicurarsi che i sensori siano completamente sommersi.Per risultati ottimali incubare la cartuccia durante la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore privo di anidride carbonica. Che correttamente umidificato. Per preparare una lama rivestita adesiva, pipettare 25 microlitri della soluzione adesiva cellulare ad ogni pozzo della piastra.E incubato a temperatura ambiente per 20 minuti. Quindi rimuovere la soluzione e lavare la piastra due volte con 200 microlitri di acqua sterile per pozzo. Tenere la piastra aperta per 15 minuti all'interno del cappuccio di coltura cellulare per consentire ai pozzi di asciugarsi.Centrifugare le celle NK precedentemente isolate aggiungere 200 volte G per cinque minuti. Quindi rimuovere i supernatanti e lavare le cellule in mezzo di prova di stress mitocondriale riscaldato o mezzo di prova di stress per glicolisi. Pellettare nuovamente le cellule e rimornerle alla concentrazione cellulare preferita nello stesso mezzo.Posare 180 microlitri di sospensione cellulare per pozzo nella piastra di dosaggio. Utilizzare pozzi A uno, A 12 H uno e H 12 come pozzi di controllo per la correzione dello sfondo. Aggiungendo 180 microlitri del mezzo di dosaggio a questi pozzi incubare la piastra per 30 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore privo di anidride carbonica.Centrifugare la piastra a 200 volte G per cinque minuti. Quindi osservare le cellule al microscopio per verificare che formino uno strato di mano nella parte inferiore del pozzo. Incubare le cellule per altri 25 minuti.Soluzioni di lavoro calde a 37 gradi Celsius. E riadatta il loro pH a 7,4 se necessario. Caricare i composti precedentemente preparati per una prova di stress mitocondriale o per una prova di stress da glicolisi nelle schede A, B e C della cartuccia di censura idratata Rimettere la cartuccia di censura caricata nell'incubatrice durante l'impostazione del programma.Per impostare il protocollo di dosaggio del flusso extracellulare, aprire il software e utilizzare le definizioni di gruppo per definire le condizioni di pretrattamento. Utilizzare la scheda Mappa piastra per indicare i gruppi di pozzi che hanno condizioni simili Indicare anche la correzione dello sfondo e i pozzi vuoti. Quindi impostare il programma nella scheda protocolli.Avviare il programma e posizionare la cartuccia del sensore e la piastra di utilità sul vassoio. Dopo la fase di calibrazione, sostituire la piastra di calibrant per la piastra di dosaggio con le celle attaccate. Una volta completata l'esecuzione, recuperare i dati e analizzarli.Al fine di valutare la purezza e la vitalità delle cellule NK. I piccoli Alec Watt dei mari PVM e la popolazione isolata di cellule NK sono stati macchiati e analizzati dalla citometria a flusso. La purezza della popolazione cellulare NK è stata stabilita rimanendo doppiamente contro CD tre e CD 56 o NKP 46.Un sacco di tasso di consumo di ossigeno mitocondriale per le cellule NK umane sono mostrati qui. Come previsto, i numeri di cella I mostrassero valori OCR più elevati. I numeri cellulari sono anche correlati linearmente con la quantità di DNA o proteine nel pozzo.D'altra parte, numeri di cella più alti non erano ottimali. Perché dopo l'aggiunta di DNP, la concentrazione di ossigeno nel pozzo era totalmente esaurita in ogni ciclo. Il che ha impedito il calcolo accurato dell'OCR.Nelle cellule NK umane, 100 DNP micromolare sono risultati essere la dose ottimale. Qui viene mostrato un tipico esperimento di stress test mitocondriale con 750.000 cellule NK per pozzo. In questo test l'oligomicina porta ad una drammatica diminuzione del consumo di ossigeno.E un aumento dell'ECAR. Che rappresenta un passaggio alla glicolisi e uno sforzo per mantenere i livelli di ATP cellulare. L'attivazione delle cellule NK da parte del corridoio 15 ha causato un aumento sia del consumo mitocondriale di ossigeno che dell'acidificazione extracellulare.La respirazione basale massima e atp è aumentata, ma non la perdita di protoni o la respirazione non mitocondriale. Inoltre, il tasso OCR/ECA è diminuito Indicando uno spostamento verso un metabolismo glicolitico dopo la stimolazione il 15. Quando si esegue questo protocollo, è molto importante ottenere una popolazione cellulare pura e sana per determinare il numero di cellule ottimale e titolare la concentrazione di incavibili.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra il metodo per analizzare il metabolismo energetico nelle cellule NK umane attivate utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Diversi inibitori dei complessi della catena di trasporto degli elettroni influenzano la sintesi di ATP, che viene misurata attraverso il tasso di consumo di ossigeno o OCR, fornendo informazioni sul metabolismo cellulare e sulla bioenergetica.

Monitoraggio in tempo reale del metabolismo energetico nelle cellule NK umane utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare

Questo video dimostra l'attività litica delle cellule natural killer contro le cellule bersaglio colorate in modo fluorescente. Il metodo consente la misurazione della citotossicità indotta dalle cellule NK colorando le cellule morte e utilizzando un citometro a flusso per quantificare le cellule bersaglio vive e morte.

Preparazione del campione per il saggio di citotossicità cellulo-mediata Natural Killer per l'analisi citofluorimetrica

Un metodo semplice ed affidabile è descritto qui di analizzare un insieme di funzioni delle cellule NK come degranulazione, citochine e chemochine ai differenti sottopopolazioni di cellule NK.

Citometria a flusso basato su test per il monitoraggio delle funzioni delle cellule NK

Questo lavoro descrive un flusso di lavoro avanzato per la determinazione accurata e rapida della conta delle cellule NK (Natural Killer) e della citotossicità delle cellule NK in campioni di sangue umano.

Flusso analisi di citometria di Natural Killer cellulare Lytic attività nel Sangue umano intero

Un metodo di basato su citometria di flusso per determinare quantitativamente l'attività citotossica delle cellule natural killer di umane è mostrato qui.

Un'analisi di citotossicità di base di citometria a flusso per la valutazione dell'attività delle cellule NK umane

L'evasione dell'eradicazione mediata da cellule naturali (NK) da parte delle cellule tumorali è importante per l'inizio e la progressione del cancro. Qui, presentiamo due protocolli non basati sulla radioattività per valutare la citotossicità mediata dalla cellula NK verso le cellule tumorali epatiche. Inoltre, viene presentato un terzo protocollo per analizzare la migrazione delle celle NK.

Misurazione della citotossicità e della migrazione mediata da cellule Killer naturali nel contesto delle cellule tumorali epatiche

Un protocollo per lo studio di eventi guidati da FcγRIIIa da anticorpi terapeutici in cellule natural killer umane è descritto qui. Questa piattaforma di stimolazione artificiale consente l'interrogazione delle funzioni emozionali a valle come la degranulazione, la produzione di chemochine / citochine e le vie di segnalazione mediate dalle porzioni FcγRIIIa e Fc degli anticorpi coinvolti nel legame.

Valutazione degli eventi delle cellule natural killer umane guidati dall'impegno di FcγRIIIa nella presenza di anticorpi terapeutici

Il presente protocollo mostra come differenziare le cellule CD3−/CD45+CD56+ con citotossicità lieve dalle cellule staminali umane a potenziale espanso (hEPSC) sia in condizioni di coltura 3D che 2D. Ciò consente la convalida fenotipica di routine senza la distruzione del complesso microambiente.

Generazione di cellule Natural Killer da cellule staminali umane espanse

Questo protocollo descrive un metodo label-free per l'analisi rapida di singole cellule della conta e dell'attività delle cellule natural killer (NK) utilizzando la tecnologia di imaging shadow senza lenti. Questo metodo quantifica i cambiamenti morfologici nelle singole cellule NK mediante analisi computerizzata dei loro modelli di diffrazione.

Piattaforma di imaging senza lenti distribuibile sul campo per un'analisi rapida e senza marcatura dell'attivazione delle cellule natural killer

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro in vitro standardizzato per la misurazione coerente della citotossicità naturale, mediata dai recettori degli antigeni chimerici e dipendente dagli anticorpi delle cellule naturali umane, utilizzando imaging a cellule vive e citometria di flusso.

Quantificazione della citotossicità delle cellule NK potenziata dai recettori antigenici chimerici e dagli anticorpi terapeutici tramite imaging a cellule vive e citometria a flusso

Scopri come misurare glicolisi e respirazione mitocondriale nelle cellule NK umane primarie con analizzatore di flusso extracellulare. Questo metodo automatizzato consente screening ad alto rendimento per studi immunologici e clinici.

Analisi del metabolismo delle cellule dell'assassino naturale umano

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