Name: Contributo della pompa Na+/ K+ allo scoppio ritmico, esplorato con la modellazione e le analisi dinamiche del morsetto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Scopri come la pompa Na+/K+ e la corrente persistente di Na+ influenzano lo scoppio ritmico nei neuroni cardiaci della sanguisuga usando la tecnica del dynamic clamp. Questo metodo elettrofisiologico permette di controllare in tempo reale le correnti ioniche per studiare l'eccitabilità neuronale.

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Ringraziamo Christian Erxleben per gli esperimenti preliminari di morsetto dinamico sui neuroni HN(7) che hanno dimostrato le loro capacità di scoppio. Angela Wenning ha aiutato gli esperimenti con la consulenza di esperti. Riconosciamo il NIH per aver finanziato questo lavoro attraverso grant 1 R21 NS111355 a GSC e RLC.

NOTA: i soggetti sperimentali su animali invertebrati non sono regolamentati dal NIH o dalle università statali di Emory e Georgia. Tutte le misure sono state tuttavia prese per ridurre al minimo la sofferenza delle sanguisughe utilizzate in questo lavoro.
1. Preparare il ganglio isolato 7 dal cordone nervoso della sanguisuga
<ol><li>Mantenere le sanguisughe Hirudo verbana in acqua di stagno artificiale (contenente lo 0,05% p/v di sale marino) diluite in acqua deionalizzata a 16 °C su un ciclo luce-buio 12:12.</li>
	<li>Preparare le sanguisughe per la dissezione anestetizzandole a freddo in un letto di ghiaccio tritato per &gt;10 minuti fino a quando non sono immobili.</li>
	<li>Riempire una soluzione di dissezione nera rivestita di resina ad una profondità di ~ 1 cm con soluzione salina refrigerata contenente 115 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,7 mM CaCl2, 10 mM D-glucosio e 10 mM HEPES in acqua deionizzata; pH regolato a 7,4 con 1 M NaOH. Appuntare il lato dorsale della sanguisuga verso l'alto nella camera rivestita di resina nera (almeno 20 cm x 10 cm con una profondità di almeno 2 cm sopra la resina che ha uno spessore di almeno 2 cm).</li>
	<li>Sotto uno steromicroscopio a ingrandimento 20x con illuminazione a guida luminosa obliqua, effettuare un taglio longitudinale lungo almeno 3 cm con forbici a molla da 5 mm attraverso la paretecorporea nella porzione rostrale 1/3 del corpo. Usa i perni per tirare da parte la parete del corpo ed esporre gli organi interni. NOTA: Qualsiasi farina di sangue immagazzinata può essere rimossa mediante aspirazione con una pipetta Pasteur lucidata al fuoco.</li>
	<li>Isolare un singolo ganglio centrale 7 (settimo ganglio segmentale libero caudale al cervello).<ol>
<li>Aprire il seno in cui risiede il cordone nervoso utilizzando le forbici a molla da 5 mm. Assicurati di dividere il seno dorsalmente e ventralmente lasciando due strisce di seno. Usa una pinna affilata #5 per aiutare a guidare il taglio e tenere il seno.</li>
		<li>Mantenere il seno attaccato a ciascuna delle due radici nervose bilaterali che emergono dal ganglio (aderisce strettamente a ciascuna radice) per utilizzare queste strisce di seno per bloccare il ganglio.</li>
		<li>Rimuovere il ganglio dal corpo tagliando ifasci nervosi connettivi rostrali e caudali che collegano i gangli (il più lontano possibile dal 7 ° ganglio) e le strisce del seno, quindi tagliare le radici laterali a dove emergono dal seno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pin il ganglio (usando la vecchia pinna smussata #5) con spille di insetti minuten accorciate, lato ventrale in alto, in piastre di Petri chiare e rivestite di resina. Inserire perni nelle strisce di seno e tessuto sciolto aderente alle radici e ai connettivi rostrali e caudali, il più lontano possibile dal ganglio. NOTA: la resina non deve essere più spessa di 3 mm se si desidera ottenere una buona illuminazione dal basso durante la registrazione. Assicurarsi che il ganglio sia teso, sia longitudinalmente che lateralmente</li>
	<li>Aumentare l'ingrandimento dello stereomicroscopio a 40x o superiore e regolare l'illuminazione obliqua in modo che i corpi cellulari neuronali possano essere facilmente visti sulla superficie ventrale del ganglio appena sotto il perineurio.</li>
	<li>Rimuovere il perineurio del ganglio (dente) con microscissori.<ol>
<li>Iniziare la defeazione tagliando la guaine sciolta tra le radici da un lato e continuare il taglio lateralmente verso l'altro lato, assicurandosi di mantenere superficiali le lame a forbice e non danneggiare i corpi cellulari neuronali direttamente sotto la guaine.</li>
		<li>Fai un taglio superficiale simile caudale dal taglio laterale lungo la linea mediana.</li>
		<li>Ora afferra il lembo caudolaterale della guaina su un lato con la pinna fine #5, tiralo via dal ganglio e taglialo con i microscissori.</li>
		<li>Ripeti dall'altra parte; questa procedura espone entrambi i neuroni HN(7) per la registrazione con microelettrodi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare il piatto di preparazione nella configurazione di registrazione e infondere con soluzione salina a una portata di 5 ml / min a temperatura ambiente.</li>
</ol>2. Identificare e registrare gli interneuroni del cuore di sanguisuga con microelettrodi affilati
<ol><li>Per la durata della registrazione del neurone HN(7) (le registrazioni durano tra 30 e 60 min), acquisire e digitalizzare le tracce intracellulari di corrente e tensione da un elettrometro neurofisiologico a una velocità di 5 kHz con un sistema di acquisizione dati digitale (analogico a digitale, da A a D) e di stimolazione (digitale ad analogico, da D ad A), e visualizzare sullo schermo di un computer. NOTA: qualsiasi software commerciale o personalizzato e scheda da A a D/D a A può essere utilizzata per l'acquisizione dati (da A a D). D to A e software personalizzato sono necessari per il morsetto dinamico.</li>
	<li>Sotto uno steromicroscopio a 50-100x con illuminazione del campo scuro dal basso, identificare provvisoriamente un neurone HN(7) della coppia bilaterale dalla sua posizione canonica in posizione posteriolaterale nel ganglio centrale sette.</li>
	<li>Ora cerca di penetrare nel presunto neurone HN(7) con un microelettrodo affilato riempito con 2 M di acetato di potassio e 20 mM KCl usando un micromanipolatore.<ol>
<li>Posizionare il microelettrodo molto vicino al corpo della cellula bersaglio.</li>
		<li>Osservare continuamente il potenziale registrato con l'elettrometro e impostare questo potenziale a zero mV prima di penetrare nel neurone.</li>
		<li>Penetrare nel neurone con il microelettrodo, guidando lentamente l'elettrodo lungo il suo asse lungo con il manipolatore. Utilizzando la funzione di ronzio dell'elettrometro, impostata su 100 ms di durata del ronzio, fino a quando non si osserva uno spostamento negativo del potenziale di membrana e una vigorosa attività di spiking.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impostare l'elettrometro in modalità discontinua di bloccaggio della corrente (DCC) ≥ 3 kHz per registrare contemporaneamente il potenziale di membrana e passare la corrente con il singolo microelettrodo (compensazione della capacità impostata su appena sotto lo squillo e quindi ricomposti il 10%).<ol>
<li>Monitorare la sedimentazione dell'elettrodo durante il DCC su un oscilloscopio.</li>
		<li>Iniettare una corrente costante di -0,1 nA con l'iniettore a corrente costante dell'elettrometro per un minuto o due per stabilizzare la registrazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identificare definitivamente il neurone HN(7) dalla sua caratteristica forma a picco e dalla debole attività di scoppio (Figura 1Ci).</li>
	<li>Eseguire qualsiasi analisi dei dati offline dopo il completamento dell'esperimento e salvare tutti i dati su un disco.</li>
</ol>3. Costruisci un HN in tempo reale o un altro neurone modello
<ol><li>Creare software personalizzato utilizzando una scheda di elaborazione del segnale digitale (DSB; D ad A e da A a D) in un computer da tavolo per implementare in tempo reale le correnti modello descritte in2,4 o diverse correnti modello per altri neuroni o esperimenti.<ol>
<li>Utilizzare equazioni in stile Hodgkin-Huxley in quanto sono il metodo generalmente preferito per rappresentare le correnti del modello.</li>
		<li>Vedere7 per una descrizione dettagliata dell'implementazione del modello HN in tempo reale e del morsetto dinamico prima dell'aggiunta della corrente della pompa. Fare riferimento alla sezione introduttiva per la descrizione delle correnti, della concentrazione intracellulare di Na+ e delle conduttanze del neurone HN(7) vivente nel modello HN.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Implementare e variare le conduttanza / correnti dinamiche del morsetto
<ol><li>Utilizzare il software di morsetto dinamico personalizzato per il DSB per implementare e modificare in tempo reale il morsetto dinamico qualsiasi interfaccia utente grafica (Figura 3) (GUI) accessibile, conduttanza e correnti programmate del modello in tempo reale HN del neurone HN(7). NOTA: Come promemoria, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> e <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> sono la conduttanza massima della corrente Na+ persistente (IP) e la corrente massima della pompa (pompaI), rispettivamente.</li>
	<li>Utilizzare le caselle di immissione GUI nel software per apportare modifiche, mentre il modello è in <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> esecuzione, nella (casella PumpMaxL) e <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> (casella GpinHNLive) (Figura 3). NOTA: le caselle di input della GUI accettano valori digitati e si consigliano passaggi di 0,1 nA <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> e si consigliano passaggi di 1 nS per <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> .<ol>
<li>Aggiungere piccole quantità di <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> e <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> con morsetto dinamico per stabilizzare lo scoppio del neurone HN(7), che è indebolito da una perdita indotta da microelettrodi, come mostrato nella Figura 1Cii. NOTA: la penetrazione acuta del microelettrodo provoca danni alla membrana che si esprimono come aumento della conduttanza delle perdite o diminuzione della resistenza di ingresso.</li>
		<li>Inizia aggiungendo un valore <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> di 0,1-0,2 nA, che compensa la perdita indotta dal microelettrodo, ma deprime l'eccitabilità, e poi aumenta gradualmente <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> , che aumenta l'eccitabilità, fino a quando ne consegue uno scoppio regolare, di solito a <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> ~ 1-4 nS (Figura 4A).</li>
	</ol></li>
	<li>Co-variare sistematicamente queste correnti (incrementi di 0,1 nA per <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> e 1 nS per <img alt="Equation 17" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> ) al neurone HN(7) registrato con morsetto dinamico (Figura 3), e valutare i loro effetti sulle caratteristiche di scoppio: frequenza di picco (f: il reciproco della media dell'intervallo di interspike durante un burst), intervallo di interburst (IBI: il tempo tra l'ultimo picco in una raffica e il primo picco nel burst successivo), durata del burst (BD: il tempo tra il primo spike in un burst e l'ultimo spike in un burst), e il periodo di burst (T: il tempo tra il primo spike in un burst e il primo spike nel burst successivo).<ol>
<li>Modificare i valori di <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> <img alt="Equation 19" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> e, come nella dimostrazione video, per acquisire familiarità con la tecnica e quindi avventurarsi.<ol>
<li>Mantenere <img alt="Equation 20" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> un valore fisso specifico e spazzare in incrementi di 1 nS su un intervallo di supporto dell'attività di <img alt="Equation 21" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> scoppio regolare.</li>
			<li>Ora aumenta il valore fisso di <img alt="Equation 22" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> 0,1 nA e di nuovo spazza su una gamma di attività di <img alt="Equation 23" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> scoppio regolare di supporto.</li>
			<li>Per ogni coppia di parametri implementata, raccogliere dati contenenti almeno 8 burst in modo da poter eseguire misurazioni medie affidabili di f, IBI, BD e T.</li>
			<li>Continuare con sweep per tutto il tempo in cui il neurone rimane vitale, come valutato da un forte picco e da un potenziale di oscillazione basale stabile.</li>
			<li>Raccogliere dati da diversi neuroni (da diversi animali) per generare un grafico composito (Figura 5).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Cymbalyuk, G. S., Gaudry, Q., Masino, M. A., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursting+in+leech+heart+interneurons%3A+cell-autonomous+and+network-based+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bursting in leech heart interneurons: cell-autonomous and network-based mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 22, 10580-10592 (2002).</li>
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<li>Olypher, A., Cymbalyuk, G., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+systems+analysis+of+the+control+of+burst+duration+by+low-voltage-activated+calcium+current+in+leech+heart+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Hybrid systems analysis of the control of burst duration by low-voltage-activated calcium current in leech heart interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 2857-2867 (2006).</li>
<li>Calabrese, R. L., Prinz, A. A. Realistic modeling of small neuronal networks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCalabrese%2C+RL+%22Computational+Modeling+Methods+for+Neuroscientists%22">Computational Modeling Methods for Neuroscientists</a>. DeSchutter, E. , MIT Press. MA, USA. 285-316 (2010).</li>
<li>Rybak, I. A., Molkov, Y. I., Jasinski, P. E., Shevtsova, N. A., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+bursting+in+the+pre-B%C3%B6tzinger+complex%3A+mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rhythmic bursting in the pre-Bötzinger complex: mechanisms and models.</a> Progress in Brain Research. 209, 1-23 (2014).</li>
<li>Picton, L. D., Nascimento, F., Broadhead, M. J., Sillar, K. T., Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+pumps+mediate+activity-dependent+changes+in+mammalian+motor+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sodium pumps mediate activity-dependent changes in mammalian motor networks.</a> Journal of Neuroscience. 37, 906-921 (2017).</li>
</ol>

La modellazione, il morsetto dinamico e le analisi risultanti che abilitano sono tecniche utili per esplorare come individui e gruppi di conduttanza / correnti ioniche contribuiscono all'attività elettrica dei neuroni (Figura 1, Figura 2,Figura 4e Figura 5). L'uso di queste tecniche mostra come la corrente della pompa Na+/ K+ (pompaI) interagisce con le correnti voltaggio-4, in particolare la corrente Na+ persistente (IP), per promuovere un robusto scoppio nel nucleo del generatore di battito cardiaco della sanguisuga. Combinando esperimenti di morsetto dinamico e modellazione, è possibile testare i modelli in modo più diretto di quanto sia possibile con le normali tecniche di registrazione della tensione e di morsetto di corrente. I risultati raccolti dagli esperimenti di morsetto dinamico (Figura 5) saranno utilizzati per perfezionare ulteriormente il modello HN. Il metodo di base del serraggio dinamico qui dimostrato può essere personalizzato per riflettere le proprietà di qualsiasi neurone in studio se un modello matematico di correnti neuronali può essere determinato con esperimenti di morsetto di tensione.
Il completamento con successo degli esperimenti del tipo mostrato qui richiede un'attenta impalatura di un HN o di un altro neurone quando si utilizza un microelettrodo affilato, perché il forte scoppio è limitato dalla penetrazione dell'elettrodo1. (Le tecniche di registrazione dei cerotti a cellule intere, che riducono al minimo le perdite introdotte, sono applicabili anche ad altri neuroni, ma non funzionano bene sui neuroni delle sanguisuga.) È fondamentale che l'impalamento del neurone HN causi danni minimi al neurone (perdita aggiunta) e la resistenza all'input deve essere monitorata e deve essere nell'intervallo di 60-100 MOhms per esperimenti di successo4.
Il morsetto dinamico è una tecnica potente, ma ha limitazioni imposte dalla geometria neuronale perché le conduttanze artificiali sono implementate nel sito dell'elettrodo di registrazione - di solito il corpo cellulare - non nel sito in cui le correnti generatrici di ritmo sono solitamente localizzate5,6,10. Nei neuroni HN della sanguisuga, il corpo cellulare è elettricamente vicino alla zona di integrazione (neurite principale) del neurone in cui sono localizzate le correnti più attive e vengono avviati i picchi.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61473">Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses</a>. An author name was updated.
The&#160;name of the first author was updated from:
Ricardo Javier Erazo Toscano
to:
Ricardo Javier Erazo-Toscano

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61473">Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses</a>. An author name was updated.

Erratum: Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses

Il battito cardiaco nelle sanguisughe è guidato da un CPG costituito da 9 coppie bilaterali di interneuroni cardiaci (NN) distribuiti su altrettanti gangli segmentali del corpo centrale. Al centro del CPG ci sono coppie reciprocamente inibitorie di interneuroni situati nel 3° e 4° gangli segmentale che formano oscillatori semicentri (HCO) (Figura 1A). Questi neuroni continuano a scoppiare quando sinapticamente isolati farmacologicamente usando bicuculline1. Altri, come la coppia nel 7° gangli segmentale (il focus di questo protocollo), sono anche burster, in grado di produrre attività di scoppio quando isolati sinapticamente. Non sono reciprocamente collegati e ricevono solo input discendenti, e quindi sono facilmente isolati tagliando il ganglio dal resto del cordone nervoso. Questa attività di scoppio indipendente è sensibile alla corrente di dispersione introdotta causata dalla penetrazione con microelettrodi affilati per la registrazione, ma esplode vigorosamente quando registrata con metodi di patch sciolti1.
Sono stati modellati sia i singoli neuroni HN che gli HCO HN (modelli di compartimento isopotenziale singolo basati su Hodgkin-Huxley di neuroni HN contenenti tutte le correnti voltaggio-mo-ari e sinaptiche identificate sperimentalmente) e tutte le caratteristiche di scoppio del sistema vivente sono state catturate con successo2. La miomodulina, un neuropeptide endogeno nelle sanguisughe, diminuisce notevolmente il periodo (T) del ritmo di scoppio dei neuroni HN isolati e degli HCO HN. Questo modulatore agisce per aumentare la corrente h (corrente verso l'interno attivata dall'iperpolarizzazione, Ih) e per diminuire lapompaI3. Questa osservazione ha portato all'esplorazione di come lapompa I interagisce con Ihe di come la loro co-modulazione contribuisce all'attività ritmica dei neuroni HN. L'attivazione della pompa aumentando [Na+]i (usando lo ionoforo monensin) accelera il ritmo di scoppio HN sia negli HCO HN che nei neuroni HN isolati4. Questa velocità dipendeva da Ih. Quando Ih era bloccato (2 mM Cs+),il periodo di scoppio non è stato alterato da questo metodo di attivazione della pompa; tuttavia, la durata del burst (BD) è stata ridotta e l'intervallo di interburst (IBI) è aumentato sia negli HCO HN che nei neuroni HN isolati4.
Per questo protocollo, tutte le correnti di un neurone HN(7) vivente, inclusa la corrente della pompa, la pompaI,sono incorporate nel modello HN come segue:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq01v2.jpg"> (1)
dove C è la capacità di membrana (in nF), V è il potenziale di membrana (in V), t è il tempo (in s). Descrizioni ed equazioni dettagliate della corrente ionica sono state descritte altrove2,4. Il neurone modello HN completo funziona in tempo reale (Figura 2). Il software sarà reso disponibile su GitHub al momento della pubblicazione e sarà idoneo all'esecuzione sulla scheda di elaborazione del segnale digitale descritta nella Tabella dei Materiali. Qui, il focus dell'indagine è la corrente della pompa Na+/ K+ (pompaI) e le correnti voltaggio-4 che contribuiscono in modo significativo Na+ flusso: una corrente Na+ veloce (INa) e una corrente Na+ persistente (IP). Le conduttanze massime di queste correnti sono <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq1a.jpg"> <img alt="Equation 1b" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq1b.jpg"> rispettivamente. La pompa Na+/K+ scambia tre ioni Na+ intracellulari per due ioni K+ extracellulari, producendo così una corrente netta verso l'esterno. È importante sottolineare che pompa 3 volte più Na+ dal neurone di quanto indichi questa corrente, il che è importante per il calcolo della concentrazione intracellularedi Na +.
La corrente della pompa Na+/K+ dipende dalle concentrazioni intracellulari di Na+ ed è espressa dalla seguente funzione sigmoidale:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq02.jpg"> (2)
dove [Na]i è la concentrazione intracellulare di Na+, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> è la massima Na+/K+ corrente della pompa, [Na]ih è la concentrazione intracellulare di Na+ per la semi-attivazione della pompa Na+/K+ e [Na]è la sensibilità della pompa Na+/K+ a [Na]i. [Na]i si costruisce come risultato degli afflussi di Na+ trasportati da IP e INa ed è diminuito dall'efflusso Na+ della pompa Na+/ K+. Il contributo di Ih e ILeak al flusso totale di Na+ è piccolo e non è considerato nel modello in tempo reale.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq03.jpg"> (3)
dove, v è il volume (~6,7 pL) del serbatoio intracellulare Na+, F è la costante di Faraday e la concentrazione extracellulare di Na+ è mantenuta costante.
Le conduttanza voltaggio-uscita e di perdita sono state differenziate - queste rispondono al potenziale di membrana - dalla corrente della pompa, che è regolata dalla concentrazione intracellulare Na+ calcolata ([Na+]i). [Na+] i è costruito attraverso Na+ ingresso tramite la corrente na+ veloce (INa) che produce potenziali d'azione (picchi) e la corrente Na+ persistente (IP) che fornisce la depolarizzazione per supportare lo spiking. [Na+] i è, a sua volta, ridotto dall'azione della pompa attraverso l'estrusione di Na+. Sono stati assunti valori HN viventi di base di <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> (5nS) e <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgna.jpg"> (150 nS) e prendiamo in considerazione qualsiasi morsetto dinamico aggiunto <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> .
L'obiettivo del protocollo qui descritto è quello di manipolare lapompa I in modo preciso e reversibile in tempo reale per scoprire come interagisce con le correnti voltaggio-mozionato (corrente Na+ persistente nel protocollo di corrente) per controllare lo scoppio ritmico in singoli NN. Per raggiungere questo obiettivo, è stato utilizzato un morsetto dinamico, che introduce artificialmente, su comando, una quantità precisa di qualsiasi corrente che può essere calcolata mentre il modello è in esecuzione. Questo metodo ha vantaggi rispetto alla manipolazione farmacologica della pompa, che colpisce l'intero tessuto, può avere effetti fuori bersaglio che sono spesso difficili da invertire e non possono essere manipolati con precisione. Il morsetto dinamico5,6 legge la tensione di un neurone registrato in tempo reale(Figura 1B)e calcola e inietta, in tempo reale, la quantità di qualsiasi corrente in base alle equazioni del modello e ai valori impostati di qualsiasi o <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgx.jpg"> <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> . Metodi simili possono essere facilmente applicati a qualsiasi neurone che può essere registrato intracellulare. Tuttavia, i parametri dovranno essere riscalati al neurone scelto e il neurone dovrà essere isolato dagli input sinaptici, ad esempio farmacologicamente.

<table><tbody><tr><td><forte>ANIMALI</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hirudo verbana</td><td>Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches</td><td></td><td>sanguisughe vive 2-3 grammi</td></tr><tr><td><forte>SOSTANZE CHIMICHE</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQUA</td><td></td><td></td><td></td>ARTIFICIALE PER LAGHETTO</tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670-100G</td><td>1,8 mM aggiungere l'ultimo dopo aver regolato il pH</td></tr><tr><td>glucosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Instant Ocean (sale marino)</td><td>Spectrum Brands Inc., Madison, WI</td><td></td><td>0,05% (p/v) diluito in acqua deionizzata</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td>4 mM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-250G</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>NaOH 0.1 N Soluzione</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2105-50ML</td><td>Regolare a pH 7.4 con NaOH</td></tr><tr><td>MICROELECTRODES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K Acetato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1190-100G</td><td>2 M</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td>20 mM</td></tr><tr><td>SALINE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#5 Pinze</td><td>Strumenti per le scienze fini Dumont</td><td>11251-30 O 11251-20</td><td>Per la dissezione generale delle sanguisughe</td></tr><tr><td>AxoClamp 2A/2B Elettrometro DCC</td><td>Axon Instruments Dispositivi molecolari</td><td>2A/2B</td><td>Per la registrazione del potenziale di membrana neuronale e della pinza di corrente discontinua</td></tr><tr><td>Resina nera</td><td>Dow Sylguard</td><td>170</td><td>Linee generali disco da dissezione</td></tr><tr><td>Vetro capillare diametro esterno 1 mm, diametro interno 0,75 mm</td><td>A-M Systems</td><td>615000</td><td>Per la fabbricazione di microelettrodi affilati</td></tr><tr><td>Resina trasparente</td><td>Dow Sylguard</td><td>184</td><td>linee Piastra di Petri utilizzata per montare il ganglio per l'elettrofisiologia</td></tr><tr><td>Condensatore a campo scuro</td><td>Nikon</td><td>Dry 0,95-0,80 MBL 1210</td><td>Per illuminare la preparazione del ganglio durante l'impalamento cellulare</td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Axon CNS Molecular Devices</td><td>1440A</td><td>esegue da A a D e da D ad A per l'acquisizione e la stimolazione dei dati durante l'elettrofisiologia</td></tr><tr><td>Scheda di elaborazione del segnale digitale</td><td>dSpace</td><td>CLP1104</td><td>Il nostro software implementa tutte le conduttanze/correnti nel nostro modello di neurone HN su una scheda controller PPC DS1103 dSPACE in tempo reale a una velocità di 20 kHz con un'interfaccia grafica ControlDesk (dSPACE, Paderborn, Germania)9.&nbsp;</td></tr><tr><td>Estrattore per microelettrodi Falming/Brown</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>Per la fabbricazione di microelettrodi affilati</td></tr><tr><td>Illuminatore ad alta intensità Fiber-Lite</td><td>Dolan Jenner Industries</td><td>170D</td><td>Per illuminare la dissezione generale e per illuminare la preparazione del ganglio durante l'impalamento cellulare</td></tr><tr><td>Amplificatore per stadio principale per AxoClamp 2A</td><td>Axon Instruments</td><td>HS-2A Guadagno: 0,1LU</td><td>Ora parte di Molecular Devices per la registrazione del potenziale di membrana neuronale e della pinza di corrente discontinua</td></tr> Guida <tr><td>luminosa</td><td>Dolan Jenner Industries</td><td>Rev R 38 08 3729107</td><td>Per illuminare la dissezione generale e per illuminare la preparazione del ganglio durante l'impalamento cellulare</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-385</td><td>Micromanipolatore per l'impalamento cellulare con microelettrodi</td></tr><tr><td>Micromanipolatore controllore</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td>Controlla i micromanipolatori per l'impalamento cellulare con microelettrodi</td></tr><tr><td>Perni Minuten</td><td>BioQuip</td><td>0,15 mm di diametro 1208SA</td><td>Dovrebbe essere accorciato curvando a ~5 mm</td></tr><tr><td>Breadboard ottica 3' x 5' x 8"</td><td>Newport</td><td>Obsoleto</td><td>Con i 4 isolatori pneumatici sottostanti utilizzati per costruire uno spazio di lavoro privo di vibrazioni per l'elettrofisiologia</td></tr><tr><td>Oscilloscopio</td><td>HAMEG Instruments</td><td>HM303-6</td><td>Per monitorare il posizionamento degli elettrodi durante il DCC</td></tr><tr><td>Forbici a molla Pascheff-Wolff</td><td>Moria</td><td></td><td>Fornito da Fine Science Tools (Foster City, CA) catalogo # 15371-92</td></tr><tr><td>pClamp 9 Software</td><td>Axon Instruments</td><td>9</td><td>Ora parte di Moleculear Devices utilizza il Digidata 1440 per l'acquisizione e la stimolazione dei dati durante l'elettrofisiologia</td></tr><tr><td>Isolatori pneumatici 28"</td><td>Newport</td><td>Obsoleto</td><td>Con breadboard ottica utilizzata per costruire uno spazio di lavoro privo di vibrazioni per l'elettrofisiologia</td></tr><tr><td>Software Simulink / MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2006 (Obsoleto)</td><td>Implementa il morsetto dinamico sulla scheda di elaborazione del segnale digitale</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Wild</td><td>M5A</td><td>10x Oculari utilizzati per sezionare la sanguisuga e rimuovere e rivestire i gangli</td></tr><tr><td>Streromicroscopio</td><td>Pezzi oculari Wild</td><td>M5</td><td>20x utilizzati nella stazione elettrofisiologica per visualizzare i neuroni per la penetrazione dei microelettrodi</td></tr><tr><td>Forbici a molla per studenti Vannas</td><td>Strumenti di scienze fini</td><td>91500-09</td><td>Per la dissezione generale della sanguisuga</td></tr></tbody></table>

contributo della pompa na+/ k+ allo scoppio ritmico, esplorato con la modellazione e le analisi dinamiche del morsetto

Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses

La pompa Na+/K+, spesso pensata come una funzione di fondo nell'attività neuronale, contribuisce a una corrente verso l'esterno (pompaI) che risponde alla concentrazione interna di Na+ ([Na+]i). Nei neuroni bursting, come quelli che si trovano nelle reti neuronali del generatore di pattern centrale (CPG) che producono movimenti ritmici, ci si può aspettare che la [Na+]i e quindi la pompaI varino durante il ciclo di burst. Questa reattività all'attività elettrica, combinata con l'indipendenza dal potenziale di membrana, conferisce alla pompa proprietà dinamiche non comuni alle correnti basate su canali (ad esempio, canali di tensione o trasmettitori o di perdita). Inoltre, in molti neuroni, l'attività della pompa è modulata da una varietà di modulatori, espandendo ulteriormente il ruolo potenziale della pompa I nell'attività di scoppio ritmico. Questo documento mostra come utilizzare una combinazione di metodi di modellazione e di morsetto dinamico per determinare come pompare e la sua interazione con l'attività ritmica persistente di influenza Na+ corrente in un CPG. In particolare, questo documento si concentrerà su un protocollo di morsetto dinamico e metodi di modellazione computazionale negli interneuroni cardiaci di sanguisughe medicinali.

La modellazione con l'aggiunta della pompaI4 ha portato i risultati sperimentali presentati nella sezione introduttiva in modo più nitido e ha iniziato a spiegare il meccanismo di scoppio assistito dalla pompa. Il modello in tempo reale qui dimostrato è stato sintonizzato <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgx.jpg"> (e <img alt="Equation 31" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> i parametri scelti) in modo che produca un'attività ritmica regolare che rientra nei limiti dell'attività normale come osservato negli esperimenti - f, IBI, BD, T - e continua a produrre tale attività quando i parametri modulati dalla miomodulina <img alt="Equation 32" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> (la corrente massima della pompa) e <img alt="Equation 33" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgh.jpg"> (conduttanza massima della corrente h) sono variati o co-variati nel modello. I valori dei parametri determinati possono essere utilizzati come benchmark o set canonico per esperimenti di modellazione. In questi casi di modello, la pompa oscilla durante il ciclo di scoppio come [Na+]i attorno a un livello di base. Lapompa I contribuisce alla terminazione dello scoppio durante la fase di scoppio e l'iperpolarizzazione che produce attiva I h durante l'IBI; notare il livello massimo di Ih vicino all'inizio del burst (Figura 2).
Sebbene il modello HN in tempo reale abbia tutte le correnti2,4 disponibili per il serraggio dinamico, l'attenzione qui era su <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> e , che sono disponibili per le modifiche <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> mentre il modello è in esecuzione nella GUI del morsetto dinamico ( Figura3). Il morsetto dinamico consente allo sperimentatore di aggiungere (o sottrarre con un negativo <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgx.jpg"> <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> o) qualsiasi conduttanza o corrente in un neurone artificialmente che imita la tensione e la dipendenza ionica di una conduttanza o corrente reale. Pertanto, è possibile esplorare appieno come una particolare conduttanza / corrente interagisce con le conduttanza / correnti endogene all'interno delle cellule (Figura 1). Il modello HN in tempo reale indica che la corrente Na+ persistente (IP) nei neuroni HN contribuisce a gran parte della voce Na+ influenzando fortemente [Na+]i (Figura 2) e quindi, pompa. Poiché IP è attivo a potenziali di membrana relativamente negativi, si oppone alla pompa I anche durante l'IBI.
Queste osservazioni indicano che è istruttivo esplorare le interazioni tra <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> e <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> in neuroni HN isolati con morsetto dinamico come discusso in precedenza8,9,10. Questi esperimenti (in corso) vengono eseguiti con registrazioni di microelettrodi taglienti in singoli neuroni HN(7) isolati sinapticamente (settimo ganglio reciso dal cordone nervoso). Ad oggi, questi esperimenti mostrano che lo scoppio robusto viene ripristinato nei neuroni HN tonicamente attivi (a causa della penetrazione del microelettrodo introdotta perdita) mediante co-aggiunta di pompa IP e I con morsetto dinamico (Figura 4). Questa è un'osservazione importante che indica che in questi neuroni è disponibile un meccanismo di scoppio (anche quando la perdita è compromessa) che deriva dall'interazione di Ipump e IP. I risultati preliminari indicano la loro forte interazione complicata, che può essere esplorata nel modello e negli esperimenti (Figura 5).
In conclusione, pompare in risposta agli aumenti periodici di [Na+]i durante l'attività di scoppio contribuisce al ritmo di scoppio attraverso la terminazione di scoppio (diminuzione BD). L'interazione della pompa IP e I costituisce un meccanismo sufficiente a supportare l'attività di scoppio endogena; questo meccanismo può ripristinare robusti scoppi negli interneuroni HN registrati intracellulari nel ganglio 7. L'interazione tra IP e Ipompa attraverso [Na+]i influisce sul periodo di scoppio HN in modo non monotono e garantisce la robustezza dello scoppio autonomo. Queste conclusioni sono in linea con gli esperimenti e la modellazione nei sistemi vertebrati11,12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig01.jpg"> Figura 1: Attività elettrica dell'interneurone del cuore di sanguisuga e implementazione della pompa I e della P con morsetto dinamico. (A) Normale attività di scoppio registrata simultaneamente, extracellulare (in alto) e intracellulare (in basso), in un battito cardiaco sanguisuga HCO da un terzo ganglio, uno schema dei neuroni registrati e le loro connessioni sinaptiche reciprocamente inibitorie a destra. (B) Schema dinamico del morsetto quando si registra un interneurone HN(7) in un ganglio isolato 7; si noti che non vi è alcuna interazione sinaptica tra i due interneuroni HN(7). (Ci) Scoppio in un interneurone HN(7) compromesso dalla perdita. (Cii) Uno scoppio più robusto può essere prodotto aggiungendo la pompa dinamica a morsetto I ( <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> = 0,1 nA), che compensa la perdita indotta dal microelettrodo, ma deprime l'eccitabilità e <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> (1 nS), che aumenta l'eccitabilità. Le linee tratteggiate nere indicano i valori della linea di base. Abbreviazioni: HN = cuore interneurone; HCO = oscillatore semicentro; Pompa I = corrente verso l'esterno; IP = Na persistente+ corrente; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">= namassimale +/K+ corrente della pompa; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> = conduttanza massima della corrente Na+ persistente; Vm = potenziale di membrana; [Na+] i = concentrazione interna di Na+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig02.jpg"> Figura 2: Singolo modello di interneurone HN che mostra tracce per potenziale di membrana (Vm), I h, Ipompa, [Na+]ie IP. Le correnti iperpolarizzanti verso l'esterno sono negative e le correnti depolarizzanti verso l'interno sono positive. Le linee tratteggiate nere indicano i valori della linea di base. Abbreviazioni: HN = cuore interneurone; Pompa I = corrente verso l'esterno; IP = Na persistente+ corrente; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">= namassimale +/K+ corrente della pompa; Ih = corrente verso l'interno attivata dall'iperpolarizzazione; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg">= conduttanza massima della corrente Na+ persistente; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgh.jpg"> = conduttanza massima della corrente verso l'interno attivata dall'iperpolarizzazione; Vm = potenziale di membrana; [Na+] i = concentrazione interna di Na+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig03.jpg"> Figura 3: Interfaccia utente grafica del modello HN (Real-time heart interneuron) e morsetto dinamico implementati su una scheda di elaborazione del segnale digitale. In alto a sinistra: le caselle red Math sono caselle di parametri determinate dall'utente per il modello in tempo reale, mentre le caselle Blue Live sono caselle di parametri determinate dall'utente utilizzate nel morsetto dinamico. El = il potenziale di inversione della corrente di dispersione; Gl = conduttanza di perdita; Gh = conduttanza massima h-corrente; Gp = P conduttanza massima di corrente; GCaS = conduttanza massima della corrente di calcio lenta; PumpMax = corrente massima della pompa; [Conduttanza sinaptica massima di GSyn2 al rispettivo neurone; Soglia di attraversamento del picco ThreshSyn2 per mediare un potenziale sinaptico - questi usati per creare un oscillatore semicentro ibrido (vivente / modello) non illustrato qui.]. In basso a sinistra per morsetto dinamico. All'inizio a sinistra ci sono 5 valori calcolati di variabili dinamiche del morsetto: pompa I = corrente della pompa iniettata; Ih = h-corrente iniettata (non usata qui); IP = P corrente iniettata; NaI =na + concentrazione interna calcolata; ENa = potenziale di inversione del sodio calcolato. In basso a sinistra per morsetto dinamico. A destra delle variabili calcolate ci sono 6 caselle di parametri determinate dall'utente: GNa = uso della conduttanza massima del sodio veloce endogeno assunto per calcolare il flusso Na+ associato ai potenziali d'azione; PumpMaxL = corrente massima della pompa da iniettare mediante morsetto dinamico; Naih vedi equazione (2); Gh = conduttanza massima per determinare la corrente h da iniettare mediante morsetto dinamico; Gp = uso della conduttanza massima della corrente P endogena assunta per calcolare il flusso Na+ associato alla corrente P endogena; GpinHNLive = conduttanza massima per determinare la corrente P da iniettare mediante morsetto dinamico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig04.jpg"> Figura 4: Analisi dinamica del morsetto di scoppio indipendente di HN(7). L'upregulation <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> da (A) 4.0 nS a (B) 9.0 nS rallenta il ritmo di scoppio HN indipendente. Le tracce sperimentali mostrano scoppi ritmica nel neurone HN(7) isolato con morsetto dinamico. Gli intervalli di oscillazione di [Na+]i e Vm aumentano con l'upregulated <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> . Tracce dall'alto verso il basso: Vm registrato, pompaIiniettata, calcolata [Na+]ie iniettata IP. Le linee tratteggiate nere indicano i valori della linea di base. Abbreviazioni: HN = cuore interneurone; Pompa I = corrente verso l'esterno; IP = Na persistente+ corrente; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">= namassimale +/K+ corrente della pompa; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> = conduttanza massima della corrente Na+ persistente; Vm = potenziale di membrana; [Na+] i = concentrazione interna di Na+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig05.jpg"> Figura 5: Analisi dinamica del morsetto di scoppio indipendente di HN(7). L'upregulation di <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> tende a diminuire, seguita da un aumento del periodo di scoppio HN. Nei singoli esperimenti (punti collegati da linee) usando il morsetto dinamico, <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> i valori sono stati spazzati mentre sono stati <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> mantenuti costanti. I colori rappresentano diversi livelli costanti di aggiunta <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> utilizzati in diversi esperimenti. Abbreviazioni: HN = cuore interneurone; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> = namassimale +/K+ corrente della pompa; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> = conduttanza massima della corrente Na+ persistente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui viene presentato un metodo per lo studio dei ruoli della pompa Na+/ K+ e della corrente Na+ persistente negli interneuroni del cuore di sanguisuga utilizzando il morsetto dinamico.

Contributo della pompa Na+/ K+ allo scoppio ritmico, esplorato con la modellazione e le analisi dinamiche del morsetto

The Na+/K+ pump, often thought of as a background function in neuronal activity, contributes an outward current (Ipump) that responds to the internal ...

Il serraggio dinamico può modificare o introdurre qualsiasi corrente di membrana in un neurone. Introduciamo e modifichiamo la pompa di potassio di sodio e la corrente di sodio persistente in un interneurone cardiaco vivente di una sanguisuga. L'utilizzo di una lampada dinamica consente il controllo completo con una sequenza di tasti della dinamica e dell'ampiezza di qualsiasi corrente introdotta in un neurone in tempo reale.Lo sviluppo di sistemi interattivi in tempo reale come il morsetto dinamico è alla base di tutta la ricerca BMI. Tutti gli aspetti degli studi cellulari sull'attività elettrica dei neuroni e delle reti possono potenzialmente beneficiare dell'uso del morsetto dinamico. Le principali sfide di questa tecnica sono lo sviluppo di modelli in tempo reale nel neurone e la calibrazione delle regolazioni dinamiche dei crampi al neurone selezionato per lo studio.Per l'isolamento del ganglio 7 da un cordone nervoso sanguisuga, riempire un piatto di dissezione della linea di resina nera con circa un centimetro di soluzione salina refrigerata integrata con cloruro di sodio, cloruro di potassio, cloruro di calcio, D-glucosio e HEPES in acqua deionizzata e appuntare una sanguisuga fredda anestetizzata lato dorsale nella camera. Utilizzare uno stereomicroscopio con un ingrandimento 20X con illuminazione a guida luminosa obliqua e forbici a molla da cinque millimetri per effettuare un taglio longitudinale lungo almeno tre centimetri attraverso la parete del corpo nella terza porzione rostrale del corpo. Utilizzare perni per separare il tessuto della parete corporea per esporre gli organi interni e aspirare il sangue per ottenere una visione migliore.Isolare un singolo ganglio centrale del corpo 7. Usando una pinza numero cinque affilata per aiutare a guidare il taglio e per tenere il seno, usa le forbici per aprire il seno in cui risiede il cordone nervoso, avendo cura di dividere il seno dorsalmente e ventralmente. Mantenendo il seno attaccato a ciascuna delle due radici nervose bilaterali che emergono dal ganglio, tagliare i fasci nervosi connettivi rostrali e caudali per rimuovere il ganglio dal corpo e tagliare le radici laterali a dove emergono dal seno.Usa la vecchia pinna numero cinque smussata per fissare le strisce del seno e il tessuto sciolto con i perni di insetto Minutien accorciati lato ventrale verso l'alto in piastre di Petri rivestite di resina trasparente. Fissare i connettivi rostrali e caudali il più lontano possibile dal ganglio e fissare saldamente le radici. Aumentare l'ingrandimento dello stereomicroscopio a 40X o superiore e regolare l'illuminazione obliqua in modo tale che i corpi cellulari neuronali possano essere facilmente osservati sul lato ventrale del ganglio appena sotto il perineurio.Usando micro forbici, iniziare a tagliare la guaine peroneale sciolta tra le radici su un lato del ganglio, continuando il taglio lateralmente verso l'altro lato e assicurandosi di mantenere la lama a forbice superficiale senza danneggiare i corpi cellulari neuronali direttamente sotto la guaine. Fai un taglio superficiale simile caudale dal taglio laterale lungo la linea mediana e usa una pinna numero cinque fine per tirare un lembo laterale caudale di guaina lontano dal ganglio alla volta per consentire a ciascuno di essere asportato. Quando entrambi i lembi sono stati rimossi, entrambi gli interneuroni cardiaci devono essere esposti.Posizionare la parabola nella configurazione di registrazione e infondere il campione con soluzione salina a una portata di cinque millilitro al minuto a temperatura ambiente. Per identificare gli interneuroni sulla configurazione di registrazione, selezionare un ingrandimento da 50 a 100X con illuminazione a campo scuro sotto e individuare un neurone HN 7 della coppia bilaterale dalla sua posizione canonica nella posizione posteriolaterale nel ganglio centrale del corpo 7. Successivamente, utilizzare un micropolatore per posizionare un micro elettrodo affilato riempito con due acetato di potassio molare e un micro elettrodo di cloruro di potassio da 20 millimolari molto vicino al corpo cellulare target e utilizzare un elettrometro neurofisiologico per osservare continuamente il potenziale registrato.Impostare questo potenziale a zero millivolt e penetrare nel neurone con il microelettrodo usando il manipolatore per guidare lentamente l'elettrodo lungo il suo asse lungo. Utilizzare una funzione di ronzio elettrometrico di 100 millisecondi fino a quando non si osserva uno spostamento negativo del potenziale di membrana e una vigorosa attività di spiking. Impostare l'elettrometro su almeno tre kilohertz in modalità morsetto di corrente discontinua per registrare contemporaneamente il potenziale di membrana mentre si passa la corrente al neurone.Utilizzare un oscilloscopio per monitorare l'impostazione dell'elettrodo e utilizzare un iniettore a corrente costante per iniettare una corrente costante di meno 0,1 nanoampere per uno o due minuti per stabilizzare la registrazione. Il neurone HN 7 può essere identificato dalla sua caratteristica forma a picco e dalla debole attività di scoppio. Per la conduttanza dinamica del morsetto e l'implementazione corrente, aprire un programma software di morsetto dinamico costruito su misura per la scheda di elaborazione del segnale digitale.E mentre il modello è in funzione, impostare la corrente massima della pompa su 0,1-0,2 nanoampere e aumentare gradualmente la conduttanza massima della corrente di sodio persistente fino a quando ne consegue uno scoppio regolare. Co-variare sistematicamente queste correnti con incrementi di 0,1 nanoampere per l'uscita massima della corrente della pompa e incrementi di un nanosiemens per la massima conduttanza della corrente di sodio persistente e valutare gli effetti di questi aumenti sulla frequenza di picco, sull'intervallo inter-burst, sulla durata del burst e sul periodo di burst. Mantenere la conduttanza massima della corrente di sodio a un valore fisso specifico e spazzare in un nanoamp incrementi su un intervallo di correnti massime della pompa per supportare l'attività di scoppio regolare prima di aumentare il valore fisso della conduttanza di sodio da un nanosiemens e spazzare su un secondo intervallo di correnti massime della pompa.Per ogni coppia di parametri implementata, raccogliere dati contenenti almeno otto burst in modo da poter eseguire misurazioni medie affidabili della frequenza di picco, dell'intervallo inter-burst, della durata del burst e del periodo di burst. Quindi raccogliere dati da diversi neuroni aggiuntivi come appena dimostrato per generare un grafico composito. Utilizzando questo modello, la corrente della pompa esterna oscilla durante tutto il ciclo di scoppio come la concentrazione interna di sodio intorno a un livello di base.Questa corrente della pompa contribuisce alla terminazione dello scoppio durante la fase di scoppio. L'iperpolarizzazione prodotta dalla corrente della pompa attiva l'iperpolarizzazione attivata verso l'interno durante l'intervallo inter-burst. Il modello di interneurone cardiaco in tempo reale indica che la corrente di sodio persistente negli interneuroni cardiaci contribuisce a gran parte dell'ingresso di sodio influenzando fortemente la concentrazione interna del sodio e quindi la corrente della pompa.Poiché la corrente di sodio persistente è attiva a potenziali di membrana relativamente negativi, si oppone alla corrente della pompa durante gli intervalli di scoppio e inter-scoppio. Come illustrato, lo scoppio robusto viene ripristinato negli interneuroni cardiaci tonicamente attivi mediante la co-aggiunta di correnti persistenti di pompa di sodio e sodio potassio con un morsetto dinamico. I risultati preliminari indicano una forte interazione complicata tra le due correnti, che può essere ulteriormente esplorata utilizzando il modello.Un esperimento di successo dipende dalla buona denutrizione del ganglio e dalla guida attentamente diretta, dalla penetrazione e dal ronzio del microelettrodo. Aumentiamo il morsetto dinamico implementando una corrente della pompa dipendente dal sodio che viene calcolata stimando la concentrazione intracellulare di uno ione. Tali stime possono essere utilizzate per iniettare qualsiasi corrente dipendente dallo ione in un neurone.

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In questo articolo il video illustra il set-up, le procedure per applicare le patch corpi cellulari e come implementare le registrazioni dinamiche clamp da cellule gangliari in tutto il montaggio del mouse retine. Questa tecnica permette l'indagine del contributo preciso di input sinaptici eccitatori e inibitori, e la loro portata, il tempo di spiking neuronale.

Implementazione morsetto dinamico con conduttanze sinaptiche e artificiale nel topo cellule gangliari della retina

Preciso, a base di causalità-quantificazione della funzione diastolica globale è stato raggiunto cinematica analisi basato sulla modellazione del flusso transmitralico tramite il parametrizzate diastolica di riempimento (PDF) formalismo. PDF genera rigidità, relax, e parametri di carico unici e delucida 'nuovo' fisiologia, fornendo indici sensibili e specifici di disfunzione.

Quantificazione di Global Funzione diastolica da Analisi basata su modellazione cinematica del flusso transmitralico tramite il formalismo di riempimento parametrizzate diastolica

Qui una regione romanzo di interesse protocollo di analisi basato su ordinamento ellissi best-fit assegnati a regioni di segnale positivo nel tempo bidimensionale sequenze di immagini decadenza è dimostrata. Questo algoritmo può consentire ai ricercatori di analizzare globalmente segnali fisiologici Ca 2 + con l'input minimo da parte dell'utente e pregiudizi.

Analisi automatizzata del Dynamic Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnali in sequenze di immagini

La voltammetria ciclica veloce può monitorare la neurotrasmissione dopamina in vivo nel contesto di farmaci, malattie e altre manipolazioni sperimentali. Questo lavoro descrive l'implementazione di QNsim1.0, un software per modellare le risposte dopaminiche stimolate elettricamente secondo il modello quantitativo neurobiologico per quantificare le stime della dinamica di rilascio e di reuptake della dopamina.

Modellazione di voltammetria ciclica veloce dei dati da dati neurotrasmettivali elettromagnetici a dopamina utilizzando QNsim1.0

Riciclaggio di calcio intracellulare svolge un ruolo critico nella regolazione della funzione sistolica e diastolica in cardiomiociti. Qui, descriviamo un protocollo per la valutazione del reticolo sarcoplasmico Ca2 + riserva e funzione di rimozione del calcio diastolica in cardiomiociti da un sistema di imaging di calcio.

Valutazione del reticolo sarcoplasmico calcio intracellulare e riserva diastolica calcio rimozione nei cardiomiociti ventricolari isolati

Viene proposta una tecnica veloce e affidabile per controllare le oscillazioni di forma di una singola bolla acustica intrappolata che si basa sulla tecnica della coalescenza tra due bolle. Le oscillazioni della forma della bolla controllate da simmetria e allo stato stazionario consentono l'analisi del flusso di fluido generato in prossimità dell'interfaccia della bolla.

Induzione del microstreaming mediante oscillazioni di bolle non sferiche in un sistema di levitazione acustica

Un rapido rilassamento miocardico e cardiaco è essenziale per la normale fisiologia. I meccanismi di rilassamento meccanico sono ora noti per dipendere dalla velocità di deformazione. Questo protocollo fornisce una panoramica dell'acquisizione e dell'analisi degli esperimenti per studiare ulteriormente il controllo meccanico del rilassamento.

Controllo meccanico del rilassamento mediante trabecole cardiache intatte

Il dispositivo di suzione non nutritiva (NNS) può facilmente raccogliere e quantificare le caratteristiche NNS utilizzando un ciuccio collegato a un trasduttore di pressione e registrato tramite un sistema di acquisizione dati e laptop. La quantificazione dei parametri NNS può fornire preziose informazioni sullo sviluppo neurologico attuale e futuro di un bambino.

Misurazioni dei parametri di suzione non nutritiva utilizzando un sistema di trasduttori di pressione personalizzato

Questo protocollo presenta una scatola comportamentale basata su microcontrollore per valutare l'inibizione del preimpulso (PPI) raccogliendo dati di accelerazione da un sensore sotto la scatola. Questi dati valutano i deficit di gating sensoriale nei ratti socialmente isolati, con un metodo aggiuntivo per sincronizzare i dati con l'attività neuronale per far avanzare gli studi di neurofisiologia sui disturbi comportamentali.

Sviluppo di una scatola comportamentale per la valutazione dell'inibizione del preimpulso e dell'attività neurale in modelli animali psichiatrici

L'elettrofisiologia dinamica del clamp può stabilire collegamenti causali tra i deficit di attivazione neuronale e la disfunzione dei canali ionici. Descriviamo i metodi e i protocolli di clamp dinamico nei neuroni cerebellari di Purkinje di topo, rilevando risorse utili e considerazioni tecniche. In uno studio rappresentativo, abbiamo aggiunto la conduttanza del sodio modellata ai neuroni Tsc1-/- di Purkinje per evitare l'attivazione ripetitiva.

Metodi di clamp dinamico per studiare l'eccitabilità neuronale compromessa associata all'autismo

Viene presentato un protocollo sperimentale per assemblare, stimolare elettricamente e analizzare i bilayer di interfaccia gocce dopate con gramicidina A. Le relazioni struttura-funzione lipido-proteina sono quantificate misurando le variazioni nell'area della membrana, nel flusso ionico e nella conduttanza a canale singolo, e collegando queste risposte a cambiamenti simili alla plasticità nella conduzione ionica in un modello di membrana ispirato alle sinapsi elettriche.

Caratterizzazione della struttura e funzione della membrana lipido-proteina utilizzando i bistrati dell'interfaccia delle gocce

Scopri come la pompa Na+/K+ e la corrente persistente di Na+ influenzano lo scoppio ritmico nei neuroni cardiaci della sanguisuga usando la tecnica del dynamic clamp. Questo metodo elettrofisiologico permette di controllare in tempo reale le correnti ioniche per studiare l'eccitabilità neuronale.

Contributo della pompa Na⁺/ K⁺ allo scoppio ritmico, esplorato con la modellazione e le analisi dinamiche del morsetto

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