Contributo della pompa Na⁺/ K⁺ allo scoppio ritmico, esplorato con la modellazione e le analisi dinamiche del morsetto

Il serraggio dinamico può modificare o introdurre qualsiasi corrente di membrana in un neurone. Introduciamo e modifichiamo la pompa di potassio di sodio e la corrente di sodio persistente in un interneurone cardiaco vivente di una sanguisuga. L'utilizzo di una lampada dinamica consente il controllo completo con una sequenza di tasti della dinamica e dell'ampiezza di qualsiasi corrente introdotta in un neurone in tempo reale.

Lo sviluppo di sistemi interattivi in tempo reale come il morsetto dinamico è alla base di tutta la ricerca BMI. Tutti gli aspetti degli studi cellulari sull'attività elettrica dei neuroni e delle reti possono potenzialmente beneficiare dell'uso del morsetto dinamico. Le principali sfide di questa tecnica sono lo sviluppo di modelli in tempo reale nel neurone e la calibrazione delle regolazioni dinamiche dei crampi al neurone selezionato per lo studio.

Per l'isolamento del ganglio 7 da un cordone nervoso sanguisuga, riempire un piatto di dissezione della linea di resina nera con circa un centimetro di soluzione salina refrigerata integrata con cloruro di sodio, cloruro di potassio, cloruro di calcio, D-glucosio e HEPES in acqua deionizzata e appuntare una sanguisuga fredda anestetizzata lato dorsale nella camera. Utilizzare uno stereomicroscopio con un ingrandimento 20X con illuminazione a guida luminosa obliqua e forbici a molla da cinque millimetri per effettuare un taglio longitudinale lungo almeno tre centimetri attraverso la parete del corpo nella terza porzione rostrale del corpo. Utilizzare perni per separare il tessuto della parete corporea per esporre gli organi interni e aspirare il sangue per ottenere una visione migliore.

Isolare un singolo ganglio centrale del corpo 7. Usando una pinza numero cinque affilata per aiutare a guidare il taglio e per tenere il seno, usa le forbici per aprire il seno in cui risiede il cordone nervoso, avendo cura di dividere il seno dorsalmente e ventralmente. Mantenendo il seno attaccato a ciascuna delle due radici nervose bilaterali che emergono dal ganglio, tagliare i fasci nervosi connettivi rostrali e caudali per rimuovere il ganglio dal corpo e tagliare le radici laterali a dove emergono dal seno.

Usa la vecchia pinna numero cinque smussata per fissare le strisce del seno e il tessuto sciolto con i perni di insetto Minutien accorciati lato ventrale verso l'alto in piastre di Petri rivestite di resina trasparente. Fissare i connettivi rostrali e caudali il più lontano possibile dal ganglio e fissare saldamente le radici. Aumentare l'ingrandimento dello stereomicroscopio a 40X o superiore e regolare l'illuminazione obliqua in modo tale che i corpi cellulari neuronali possano essere facilmente osservati sul lato ventrale del ganglio appena sotto il perineurio.

Usando micro forbici, iniziare a tagliare la guaine peroneale sciolta tra le radici su un lato del ganglio, continuando il taglio lateralmente verso l'altro lato e assicurandosi di mantenere la lama a forbice superficiale senza danneggiare i corpi cellulari neuronali direttamente sotto la guaine. Fai un taglio superficiale simile caudale dal taglio laterale lungo la linea mediana e usa una pinna numero cinque fine per tirare un lembo laterale caudale di guaina lontano dal ganglio alla volta per consentire a ciascuno di essere asportato. Quando entrambi i lembi sono stati rimossi, entrambi gli interneuroni cardiaci devono essere esposti.

Posizionare la parabola nella configurazione di registrazione e infondere il campione con soluzione salina a una portata di cinque millilitro al minuto a temperatura ambiente. Per identificare gli interneuroni sulla configurazione di registrazione, selezionare un ingrandimento da 50 a 100X con illuminazione a campo scuro sotto e individuare un neurone HN 7 della coppia bilaterale dalla sua posizione canonica nella posizione posteriolaterale nel ganglio centrale del corpo 7. Successivamente, utilizzare un micropolatore per posizionare un micro elettrodo affilato riempito con due acetato di potassio molare e un micro elettrodo di cloruro di potassio da 20 millimolari molto vicino al corpo cellulare target e utilizzare un elettrometro neurofisiologico per osservare continuamente il potenziale registrato.

Impostare questo potenziale a zero millivolt e penetrare nel neurone con il microelettrodo usando il manipolatore per guidare lentamente l'elettrodo lungo il suo asse lungo. Utilizzare una funzione di ronzio elettrometrico di 100 millisecondi fino a quando non si osserva uno spostamento negativo del potenziale di membrana e una vigorosa attività di spiking. Impostare l'elettrometro su almeno tre kilohertz in modalità morsetto di corrente discontinua per registrare contemporaneamente il potenziale di membrana mentre si passa la corrente al neurone.

Utilizzare un oscilloscopio per monitorare l'impostazione dell'elettrodo e utilizzare un iniettore a corrente costante per iniettare una corrente costante di meno 0,1 nanoampere per uno o due minuti per stabilizzare la registrazione. Il neurone HN 7 può essere identificato dalla sua caratteristica forma a picco e dalla debole attività di scoppio. Per la conduttanza dinamica del morsetto e l'implementazione corrente, aprire un programma software di morsetto dinamico costruito su misura per la scheda di elaborazione del segnale digitale.

E mentre il modello è in funzione, impostare la corrente massima della pompa su 0,1-0,2 nanoampere e aumentare gradualmente la conduttanza massima della corrente di sodio persistente fino a quando ne consegue uno scoppio regolare. Co-variare sistematicamente queste correnti con incrementi di 0,1 nanoampere per l'uscita massima della corrente della pompa e incrementi di un nanosiemens per la massima conduttanza della corrente di sodio persistente e valutare gli effetti di questi aumenti sulla frequenza di picco, sull'intervallo inter-burst, sulla durata del burst e sul periodo di burst. Mantenere la conduttanza massima della corrente di sodio a un valore fisso specifico e spazzare in un nanoamp incrementi su un intervallo di correnti massime della pompa per supportare l'attività di scoppio regolare prima di aumentare il valore fisso della conduttanza di sodio da un nanosiemens e spazzare su un secondo intervallo di correnti massime della pompa.

Per ogni coppia di parametri implementata, raccogliere dati contenenti almeno otto burst in modo da poter eseguire misurazioni medie affidabili della frequenza di picco, dell'intervallo inter-burst, della durata del burst e del periodo di burst. Quindi raccogliere dati da diversi neuroni aggiuntivi come appena dimostrato per generare un grafico composito. Utilizzando questo modello, la corrente della pompa esterna oscilla durante tutto il ciclo di scoppio come la concentrazione interna di sodio intorno a un livello di base.

Questa corrente della pompa contribuisce alla terminazione dello scoppio durante la fase di scoppio. L'iperpolarizzazione prodotta dalla corrente della pompa attiva l'iperpolarizzazione attivata verso l'interno durante l'intervallo inter-burst. Il modello di interneurone cardiaco in tempo reale indica che la corrente di sodio persistente negli interneuroni cardiaci contribuisce a gran parte dell'ingresso di sodio influenzando fortemente la concentrazione interna del sodio e quindi la corrente della pompa.

Poiché la corrente di sodio persistente è attiva a potenziali di membrana relativamente negativi, si oppone alla corrente della pompa durante gli intervalli di scoppio e inter-scoppio. Come illustrato, lo scoppio robusto viene ripristinato negli interneuroni cardiaci tonicamente attivi mediante la co-aggiunta di correnti persistenti di pompa di sodio e sodio potassio con un morsetto dinamico. I risultati preliminari indicano una forte interazione complicata tra le due correnti, che può essere ulteriormente esplorata utilizzando il modello.

Un esperimento di successo dipende dalla buona denutrizione del ganglio e dalla guida attentamente diretta, dalla penetrazione e dal ronzio del microelettrodo. Aumentiamo il morsetto dinamico implementando una corrente della pompa dipendente dal sodio che viene calcolata stimando la concentrazione intracellulare di uno ione. Tali stime possono essere utilizzate per iniettare qualsiasi corrente dipendente dallo ione in un neurone.